許正偉，賀寶榮，劉團(tuán)江，郭華，郝定均

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死或變性，這些受損的神經(jīng)元由于無法再生和修復(fù)，會(huì)給病人留下偏癱或者截癱的嚴(yán)重生理后遺癥，為病人家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)干細(xì)胞因其獨(dú)特的優(yōu)勢，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的基因或細(xì)胞治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。作為來源于皮膚的表皮干細(xì)胞，由于其材料來源豐富且獲取方便，合適培養(yǎng)體系下在體外還能夠?qū)崿F(xiàn)快速增殖、長期存活且與機(jī)體具有良好的相容性，亦不存在違反倫理道德的問題，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的優(yōu)良材料[1]。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一種廣譜的微量活性蛋白[2]，具有廣泛的生物學(xué)作用，在皮膚創(chuàng)傷治療、神經(jīng)組織的發(fā)育和血管的形成受損以及組織的修復(fù)與再生過程中具有十分重要的作用[3]。bFGF作為一種能夠促進(jìn)有絲分裂活性的蛋白，可誘導(dǎo)神經(jīng)分化[3]，對神經(jīng)元具有促進(jìn)增殖的活性[4]。此外，bFGF對于表皮創(chuàng)傷的愈合以及上皮的形成也具有重要調(diào)節(jié)作用[5]。研究表明，bFGF可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的多向分化，在創(chuàng)傷面的修復(fù)過程中促進(jìn)“層次性”分化[6]。那么，bFGF是否也影響了表皮干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的行為過程？為此，本研究自2015年11月至2016年11月分離、培養(yǎng)獲得SD大鼠背部表皮干細(xì)胞，在不同密度的表皮干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中加入bFGF作為誘導(dǎo)劑，通過觀察細(xì)胞分化的形態(tài)、數(shù)目變化以及免疫組化鑒定，探究bFGF對表皮干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料出生后生長1～3 d的清潔級SD大鼠10只，雌雄不限[源自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號：SYXK(陜)2015-002]。本研究中對于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

K-FSM培養(yǎng)基、大鼠來源Ⅳ型膠原、胰酶(0.25%)、中性蛋白酶(0.15%)大豆蛋白和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自GIBCO公司； Nestin抗體(兔抗大鼠,多抗)和NSE抗體(兔抗大鼠,多抗)購自Abcam公司；HE染色試劑盒和PBS緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；D-hank′s緩沖液(Hyclone)購自成都君海生物科技有限公司。

1.2表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定實(shí)驗(yàn)前，將所需要的器械進(jìn)行消毒處理，整個(gè)操作在無菌環(huán)境中進(jìn)行。取出生3 d的SD大鼠，頸椎脫臼處死后取背部含毛囊皮膚，先后用含雙抗的D-Hank′s液和不含有雙抗的D-Hank′s液洗滌3遍，清洗后的組織再置于含有中性蛋白酶(0.15%)的消化液中于8 ℃的環(huán)境下過夜處理。第2天分離得到含毛囊皮膚的表皮，切碎后用0.25%的胰酶消化處理。10 min后加入等體積的大豆蛋白液(0.25%)終止消化。300目過濾、離心、棄上清，再懸浮于K-SFM培養(yǎng)基中洗滌一次重新懸浮。細(xì)胞計(jì)數(shù)，密度調(diào)成0.5×107/mL，再向六孔板(Ⅳ型膠原8 ℃過夜處理)沒空中個(gè)加入2 mL細(xì)胞懸浮液，37 ℃培養(yǎng)10 min。吸出培養(yǎng)液，用D-Hank′s液輕柔洗滌3次，再每孔加入2 mL K-SFM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)。

在倒置顯微鏡下，200倍視野下每日觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目變化。行常規(guī)HE染色，鑒定表皮細(xì)胞。

1.3bFGF對不同密度表皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)以表皮干細(xì)胞的密度不同共分為4組，密度分別為0.1×107/mL、0.3×107/mL、0.5×107/mL、0.1×106/mL。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)(3個(gè)六孔板)，每孔中分別加入2 mL對應(yīng)密度的細(xì)胞懸液。然后將培養(yǎng)板置于37 ℃的環(huán)境中溫育10 min，立即移除培養(yǎng)液，再用D-Hank′s液輕柔洗滌3遍。每孔中再加入2 mL含有bFGF(20 ng/mL)[6]的K-SFM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)。

1.4誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)數(shù)目的變化統(tǒng)計(jì)4組不同濃度的表皮干細(xì)胞，各組每天隨機(jī)取6個(gè)孔在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，利用分割法計(jì)算視野內(nèi)形態(tài)發(fā)生變化的細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算平均值。

1.5細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定待細(xì)胞培養(yǎng)到一周，且細(xì)胞融合達(dá)到80%后，取出蓋玻片，各組細(xì)胞行常規(guī)細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定，其中Nestin抗體最佳濃度為1∶250，NSE抗體最佳使用濃度為1∶500，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定K-SFM培養(yǎng)基環(huán)境下，24 h內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)向四周伸展生長的現(xiàn)象，細(xì)胞多呈圓形或者多角形，但未發(fā)生形變，且均勻分布，貼壁細(xì)胞少(圖1A)。在第3～4天，大部分細(xì)胞開始呈現(xiàn)克隆樣生長、變大，約在第5天細(xì)胞出現(xiàn)80%融合，細(xì)胞形態(tài)變大且清晰，呈現(xiàn)長圓形，胞核較大，核質(zhì)比例大，視野內(nèi)細(xì)胞成“鋪路石樣”形態(tài)(圖1B)。HE染色，細(xì)胞呈橢圓形或多角形，細(xì)胞著色均勻，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色；細(xì)胞密度較大，整體呈現(xiàn)“鋪路石樣”形態(tài)(圖1C)。

注：A為表皮干細(xì)胞生長24 h時(shí)的形態(tài)(×400);B為表皮干細(xì)胞生長5 d時(shí)的形態(tài)(×200);C為HE染色鑒定(×400)

圖1K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞形態(tài)觀察

2.2誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化bFGF誘導(dǎo)后，0.3×107/mL組(圖2A)和0.1×107/mL組(圖2B)的表皮干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很大變化。在第3天即可以看到細(xì)胞開始發(fā)生伸展性生長，呈多角形或短棒狀形態(tài)，且分布較均勻。在第7天左右，可以觀察到細(xì)胞生長均勻，大小一致，體積小，且呈克隆生長，細(xì)胞形態(tài)大部分呈多角形或者橢圓形，形態(tài)發(fā)生雙極或多級改變的細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增多，呈神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞分布均勻。0.5×107/mL組在第3天時(shí)，形態(tài)發(fā)生雙極或多極變化的表皮干細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)高峰，然后逐漸減少直到消失；0.1×106/mL組的表皮干細(xì)胞一直未出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象，也未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)行了伸展生長。

注：A為0.1×107/mL組;B為0.3×107/mL組

圖2bFGF誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

2.3誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)數(shù)目的變化加入bFGF誘導(dǎo)后，每天觀察表皮干細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量，持續(xù)觀察1周。結(jié)果顯示，在bFGF誘導(dǎo)作用下，0.1×107/mL組和0.3×107/mL組的表皮干細(xì)胞發(fā)生雙極或多極形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量增多，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多；0.5×107/mL組表皮干細(xì)胞在第3天時(shí)，發(fā)生雙極或多極形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值，然后逐漸減少直至消失。0.1×106/mL組表皮干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)有形態(tài)改變的現(xiàn)象(圖3)。

圖3 bFGF誘導(dǎo)后不同密度表皮干細(xì)胞形態(tài)變化趨勢

2.4細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定bFGF誘導(dǎo)后，表皮干細(xì)胞發(fā)生向神經(jīng)細(xì)胞分化現(xiàn)象，細(xì)胞體積變大，部分細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)出梭形，另有部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)雙極或多極化形態(tài)變化，而巢蛋白(Nestin)染色細(xì)胞質(zhì)呈顯棕黃色，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)染色細(xì)胞質(zhì)呈顯棕黃色，兩種標(biāo)志物的免疫組化染色結(jié)果均呈陽性(圖4)。

圖4 細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定Nestin和NSE顯陽性(×200)

3 討論

皮膚干細(xì)胞是一類具有高度增殖、多向分化潛能，且自我更新能力和修復(fù)能力強(qiáng)的一種成體干細(xì)胞，也是目前研究比較多的一類成體干細(xì)胞[7]。目前，對于皮膚干細(xì)胞的定位、種類和數(shù)量的研究并不明確，在已發(fā)現(xiàn)的6種皮膚干細(xì)胞中，有表皮干細(xì)胞(Epidermal Stem Cells,ESCs)和毛囊干細(xì)胞(Follilar Stem Cells,FSCs)的研究報(bào)道相對較多[8-9]。普遍認(rèn)為表皮干細(xì)胞主要存在于表皮基底層和毛囊隆突區(qū)這兩個(gè)生理區(qū)域，本研究中，我們?nèi)D大鼠背部含毛囊皮膚，利用快速貼壁法[10]，成功消化、分離得到表皮細(xì)胞，這些細(xì)胞胞核較大，核質(zhì)比例大，且在培養(yǎng)中有大量克隆形成。表皮干細(xì)胞在維持上皮的再生與平衡方面起著重要作用，在損傷皮膚的修復(fù)與治療、腫瘤和炎癥反應(yīng)中都具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值[11-12]。而表皮干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)細(xì)胞的研究，也可能為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病帶來福音。代學(xué)良等[13]通過慢病毒介導(dǎo)Ngn2基因轉(zhuǎn)染SD大鼠皮膚源性前體細(xì)胞，成功制備出再程序化的皮膚來源神經(jīng)干細(xì)胞。Hu等[14]將表皮干細(xì)胞移植入挫傷脊髓神經(jīng)，結(jié)果顯示植入的表皮干細(xì)胞有助于促進(jìn)感覺神經(jīng)的連接和觸覺神經(jīng)的修復(fù)。對于表皮干細(xì)胞向神經(jīng)系分化所涉及到的信號通路和關(guān)鍵因子，已成為當(dāng)前的研究熱門。

bFGF是構(gòu)成成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族的主要成單元之一[15-16]，廣泛分布于人體組織中，是一種廣譜的微量活性蛋白[2]。bFGF具有廣泛的生物學(xué)作用，其靶細(xì)胞有神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞等，在皮膚創(chuàng)傷治療、神經(jīng)組織的發(fā)育和血管的形成受損以及組織的修復(fù)與再生過程中具有十分重要的作用[3,17]。bFGF誘導(dǎo)所涉及的信號途徑是絕大多數(shù)正常細(xì)胞發(fā)育所必須的，目前的研究表明，bFGF與受體結(jié)合后主要是通過四種信號通路發(fā)揮作用，蛋白激酶C途徑(PKC)，Ras/Raf/MEK/ERK途徑，蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子途徑(JAK/STAT)和磷脂酰肌醇-3-激酶途徑(PI3K)[18-19]。bFGF作為一種能夠促進(jìn)有絲分裂活性的蛋白，可誘導(dǎo)神經(jīng)分化[3]，對神經(jīng)元具有促進(jìn)增殖的活性[4]。Yang等[20]的研究發(fā)現(xiàn)bFGF能夠顯著促進(jìn)人類的胚胎干細(xì)胞分化形成多巴胺能神經(jīng)元。Duobles等[21]發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)損壞后，鈣離子結(jié)合蛋白(S100beta)能夠通過促進(jìn)受損傷神經(jīng)周邊的細(xì)胞大量分泌bFGF，從而達(dá)到自我修復(fù)受損神經(jīng)的目的。此外，bFGF對于表皮創(chuàng)傷的愈合以及上皮的形成也具有重要調(diào)節(jié)作用[5]。研究表明，bFGF可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的多向分化，在創(chuàng)傷面的修復(fù)過程中能夠促進(jìn)“層次性”分化[6]。同時(shí)，有研究認(rèn)為，bFGF的作用存在濃度決定作用效果的情況，較低濃度的bFGF有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的分化。本研究中，bFGF的濃度為20 ng/mL時(shí)，有助于表皮干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化[22]，在第3天即可以看到細(xì)胞開始發(fā)生伸展性生長，細(xì)胞呈雙極或多極形態(tài)改變。

本研究中，我們選取新生SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，取其背部含毛囊皮膚，利用快速貼壁法成功消化、分離得到表皮細(xì)胞。在濃度為20 ng/mL的bFGF誘導(dǎo)下，0.3×107/mL組和0.1×107/mL組的表皮干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很大變化，在第3天即可以看到細(xì)胞開始發(fā)生伸展性生長，在第7天左右，可以觀察到細(xì)胞生長均勻，細(xì)胞形態(tài)基本一致，體積小且呈克隆生長，而且細(xì)胞形態(tài)大多呈多角形或者橢圓形，形態(tài)發(fā)生雙極或多級改變的細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增多，呈神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞分布均勻。這初步說明，在bFGF的誘導(dǎo)下，表皮干細(xì)胞開始向神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生分化。通過調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的密度進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.1×107/mL組和0.3×107/mL組的表皮干細(xì)胞發(fā)生雙極或多極形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多。NSE[23]和Nestin[24]作為神經(jīng)元樣細(xì)胞的生物標(biāo)志物已經(jīng)被廣泛的研究和應(yīng)用。本研究中，0.1×107/mL組和0.3×107/mL組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示NSE和Nestin顯陽性，初步分析為神經(jīng)元樣細(xì)胞。細(xì)胞密度改變所引起的分化異同，可能是由于細(xì)胞接觸距離的不同導(dǎo)致0.1×107/mL組和0.3×107/mL組細(xì)胞啟動(dòng)了與表皮干細(xì)胞的分化相關(guān)的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而導(dǎo)致激發(fā)了表皮干細(xì)胞的定向分化潛能，發(fā)生向神經(jīng)細(xì)胞分化的現(xiàn)象。

作為來源于哺乳動(dòng)物皮膚的表皮干細(xì)胞，由于其材料來源豐富且獲取方便，合適培養(yǎng)體系下在體外還能夠?qū)崿F(xiàn)快速增殖、長期存活且與機(jī)體具有良好的相容性，亦不存在違反倫理道德的問題，因此為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞和基因治療帶來了新的希望。本研究結(jié)果顯示，在SD大鼠中bFGF能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，這為后續(xù)解析SD大鼠表皮干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制提供了一定的理論參考。