邱涵，呂曉君

石斛、枸杞是我國傳統(tǒng)的珍貴中藥材，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，石斛有滋陰清熱、生津養(yǎng)胃、潤肺止咳，明目強(qiáng)身等功效[1]，枸杞有滋陰補(bǔ)血、補(bǔ)腎養(yǎng)肝、潤肺止咳、益精明目等功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛屬和枸杞屬植物均具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、治療眼病等作用[3-9]。有研究報(bào)道，石斛復(fù)方制劑可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化和提高NK細(xì)胞活性的機(jī)制來調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能[10]；枸杞的活性物質(zhì)枸杞多糖可在體內(nèi)外調(diào)節(jié)對小鼠巨噬細(xì)胞的免疫功能[11]，并對機(jī)體T細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、NK細(xì)胞非特異性免疫功能均具有顯著的調(diào)節(jié)作用[12]。石斛枸杞顆粒是由鐵皮石斛、枸杞子等藥材合理組方而成的復(fù)方制劑，本實(shí)驗(yàn)自2017年1月研究考察石斛枸杞顆粒對免疫器官、細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞功能的影響，研究其對小鼠免疫功能的影響，為石斛枸杞顆粒進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1受試物石斛枸杞顆粒由湖北金鷹生物科技有限公司生產(chǎn)(規(guī)格：5 克/袋，批號20160303)，性狀為棕色顆粒。人體推薦量為每日3次，每次1袋，計(jì)0.25 g/kg/d(人按60 kg計(jì)算)。保存條件：儲放于通風(fēng)陰涼干燥處，保質(zhì)期：24個(gè)月。

1.2實(shí)驗(yàn)動物雌性SPF級昆明小鼠，160只，體質(zhì)量18～22 g，購自武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，質(zhì)量合格證號42000400004987，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2012-0013。本研究中對于小鼠的處理符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3儀器與試劑AB204-S電子天平和XS6001S電子秤，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；YLS-25A電動耳腫打耳器，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司； 3K15臺式冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，力新儀器上海有限公司；BX53顯微鏡，日本OLYMPUS公司；AU400全自動生化儀，日本OLYMPUS公司。RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司，批號1645374；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20150616；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)，批號142714011。小鼠淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.4方法[13]

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組及受試物給予方式 小鼠按體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的40只動物分為4組(高、中、低3個(gè)劑量組及陰性對照組)。設(shè)石斛枸杞顆粒高劑量組(7.5 g/kg BW，相當(dāng)于人體推薦量的30倍)、中劑量組(5.0 g/kg BW，相當(dāng)于人體推薦量的20倍)、低劑量組(2.5 g/kg BW，相當(dāng)于人體推薦量的10倍)。臨用前將受試物用蒸餾水配制成0.375，0.250，0.125 g/mL三種濃度的混懸液。各組小鼠灌胃給予不同濃度的受試物，灌胃體積為20 mL/kg BW。陰性對照組給予等體積蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)30 d。灌胃結(jié)束后處死動物，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別按1.4.2～1.4.7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：第1實(shí)驗(yàn)組，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實(shí)驗(yàn)；第2實(shí)驗(yàn)組，抗體生成細(xì)胞檢測和血清溶血素測定；第3實(shí)驗(yàn)組，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；第4實(shí)驗(yàn)組，NK細(xì)胞活性測定、免疫器官臟/體比。

1.4.2體質(zhì)量及免疫器官臟/體比測定 所有動物每周稱量體質(zhì)量一次，灌胃30 d后處死小鼠。第4實(shí)驗(yàn)組小鼠的取出胸腺和脾臟，稱重并計(jì)算臟/體比值。臟/體(%)=臟器重量/動物體質(zhì)量×100%。

1.4.3遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 采用二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)的小鼠DTH實(shí)驗(yàn)(耳腫脹法)。小鼠腹部脫毛，用1% DNFB溶液涂抹50 μL致敏，5 d后，再用1% DNFB溶液10 μL均勻涂抹小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊，攻擊后24 h處死動物剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片后分別稱重，以左右耳的重量之差來反映DTH的程度。

1.4.4抗體生成細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn) 采用Jerne改良玻片法。將脫纖維處理后的羊血用生理鹽水洗滌3次，離心1 500×g/min 10 min，用生理鹽水配成2%(V/V)的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，每只鼠經(jīng)腹腔注射2%(V/V) SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫。5天后處死小鼠，取出脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。將0.5 mL 0.5%瓊脂糖、50 μL 10% SRBC、20 μL 脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，37 ℃溫育1.5h，然后加入補(bǔ)體，繼續(xù)溫育1.5 h，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。

1.4.5血清溶血素測定實(shí)驗(yàn) 采用血凝法，與1.4.4實(shí)驗(yàn)共用小鼠。免疫5 d后，小鼠摘眼球取血，制備血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(V/V)的SRBC懸液，混勻，37 ℃溫育3 h，觀察血球凝集程度，進(jìn)行血清溶血素的測定，計(jì)算抗體水平。

1.4.6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 采用滴片法。每只小鼠腹腔注射2%(V/V) SRBC 0.2 mL。4 d后頸椎脫臼處死小鼠，每只腹腔注射加小牛血清的Hank's液4 mL，充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，收集腹腔洗液至試管內(nèi)。在試管內(nèi)加入0.5 mL腹腔洗液、0.5 mL 1%雞血紅細(xì)胞懸液，混勻，吸取0.5 mL混合液加入玻片上已晾干的3%瓊脂圈內(nèi)，37 ℃溫育20 min，甲醇固定、Gimsa液染色，顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.4.7NK細(xì)胞活性測定，采用LDH 測定法 末次給予受試樣品后，處死小鼠，無菌操作下取脾，研磨制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液后，過200目篩網(wǎng)后Hank′s液洗2次，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107個(gè)/mL。以脾細(xì)胞懸液為效應(yīng)細(xì)胞，取對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度至4×105個(gè)/mL作為靶細(xì)胞，作用4 h后，離心取上清，全自動生化分析儀檢測細(xì)胞上清液中LDH含量，計(jì)算NK 細(xì)胞活性。

2 結(jié)果

2.1對小鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果見表1，石斛枸杞顆粒各劑量組小鼠整個(gè)試驗(yàn)過程中體質(zhì)量與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2對小鼠淋巴器官臟器/體質(zhì)量比值的影響結(jié)果見表2，石斛枸杞顆粒各劑量組小鼠胸腺/體質(zhì)量比值和脾臟/體質(zhì)量比值較陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 石斛枸杞顆粒對小鼠體質(zhì)量的影響

表2 石斛枸杞顆粒對小鼠淋巴器官臟器/體質(zhì)量的影響

2.3對細(xì)胞免疫功能的影響結(jié)果見表3，石斛枸杞顆粒中、低劑量組能增加耳廓腫脹度，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其可促進(jìn)小鼠對DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。

表3 石斛枸杞顆粒對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH反應(yīng)的影響

注：各劑量組與陰性對照組比較，aP<0.05

2.4對體液免疫功能的影響結(jié)果見表4，石斛枸杞顆粒各劑量組的溶血空斑數(shù)、血清溶血素水平與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其不能增強(qiáng)體內(nèi)抗體生成細(xì)胞能力和增加抗體生成水平，即石斛枸杞顆粒對體液免疫功能無明顯影響。

2.5對小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響結(jié)果見表5，石斛枸杞顆粒高劑量組可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其可增強(qiáng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

2.6對小鼠NK細(xì)胞活性的影響結(jié)果見表6，石斛枸杞顆粒高、中劑量組能增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答和免疫功能的重要系統(tǒng)，是生物體識別“非自體物質(zhì)”并將其消滅或排除體外，抵御病原體入侵的保衛(wèi)系統(tǒng)。免疫細(xì)胞、免疫分子和免疫器官共同構(gòu)成機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并與其他系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)，共同維持機(jī)體生理功能的平衡。機(jī)體正常免疫功能狀態(tài)的維持需要多種免疫細(xì)胞的相互作用和制約，免疫功能是在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他有關(guān)細(xì)胞及其產(chǎn)生的免疫分子的相互作用下完成的，主要包括細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞功能，它們相互配合完成特異性免疫和非特異性免疫。細(xì)胞免疫和體液免疫屬于特異性免疫，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞功能屬于非特異性免疫[14-16]。本實(shí)驗(yàn)研究觀察了石斛枸杞顆粒對體質(zhì)量和免疫器官的作用，同時(shí)從細(xì)胞免疫、體液免疫、吞噬功能、NK細(xì)胞功能四個(gè)方面檢測和其對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示，石斛枸杞顆粒對小鼠體質(zhì)量和脾臟臟/體比、胸腺臟/體比無顯著性影響，說明其對免疫器官的作用不明顯。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)，二硝基氟苯(DNFB)是一種半抗原，將其涂抹小鼠腹部皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合形成完全抗原，刺激小鼠T淋巴細(xì)胞會增殖成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次涂抹至小鼠耳部時(shí)刺激記憶細(xì)胞迅速增殖，產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)引起耳廓腫脹，發(fā)生以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，屬于細(xì)胞免疫應(yīng)答功能；石斛枸杞顆?？梢鸲[脹度增加，促進(jìn)小鼠DTH反應(yīng)，提示其可增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。用SRBC免疫小鼠數(shù)天，能夠刺激小鼠B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，用免疫后的小鼠血清對SRBC的溶解能力反映了小鼠抗體分泌細(xì)胞分泌抗體的能力，屬于體液免疫應(yīng)答功能；本研究中石斛枸杞顆粒對血清溶血素水平和抗體生成能力無明顯影響，說明其對體液免疫功能無明顯作用。巨噬細(xì)胞是一種非特異性免疫細(xì)胞，可通過直接吞噬外來異物或自身衰老的細(xì)胞來發(fā)揮提高機(jī)體免疫力的作用，因此，巨噬細(xì)胞吞噬活性的大小在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的非特異性免疫功能，利用巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以在體外觀察巨噬細(xì)胞的吞噬功能；石斛枸杞顆粒可增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，說明其可激活單核-巨噬細(xì)胞免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)非特異性免疫功能。NK細(xì)胞具有自然殺傷活性及抗腫瘤作用，活細(xì)胞胞漿內(nèi)的LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)YAC-1細(xì)胞(小鼠淋巴瘤細(xì)胞)受到NK細(xì)胞殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外，因此通過檢測細(xì)胞上清液的LDH含量來反映NK細(xì)胞的活性；石斛枸杞顆?？稍黾蛹?xì)胞上清液的LDH含量，說明其可增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。

表4 石斛枸杞顆粒對小鼠抗體生成細(xì)胞和血清溶血素的影響

表5 石斛枸杞顆粒對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

表6 石斛枸杞顆粒對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

注：與陰性對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

綜上所述，本研究結(jié)果表明石斛枸杞顆粒對小鼠細(xì)胞免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞活性均有增強(qiáng)作用，促進(jìn)了小鼠的特異性免疫和非特異性免疫，具有增強(qiáng)免疫功能的作用，是一種具有良好開發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。