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      一個(gè)共同性外斜視家系基因突變研究

      2019-03-04 05:16:10李永蓉
      重慶醫(yī)學(xué) 2019年3期
      關(guān)鍵詞:共同性斜視家系

      李永蓉,王 慧

      (安徽省合肥市第二人民醫(yī)院眼科 230011)

      斜視是指由于各種原因所致眼外肌作用不平衡,眼位偏斜的一種眼科常見(jiàn)疾病,分為共同性斜視和非共同性斜視。在亞洲人口中,共同性外斜視最常見(jiàn)[1],影響兒童視力發(fā)育、雙眼融合功能和立體視,目前發(fā)病原因尚未明確。共同性外斜視具有較高的遺傳性,MATSUO等[2]報(bào)道,共同性外斜視遺傳性表現(xiàn)為多種基因遺傳,并有一些敏感的染色體位點(diǎn)。非共同性外斜視中的先天性眼外肌纖維化(CFEOM)是一種特殊的家族性遺傳疾病,為單基因遺傳。有研究發(fā)現(xiàn)共同性外斜視與非共同性外斜視CFEOM有相似的遺傳基因突變可能性,ARIX基因突變與CFEOM2有關(guān)[3],最新研究發(fā)現(xiàn) TUBB3基因、細(xì)胞形態(tài)TUBB2b基因與CFEOM3有關(guān)[4],本研究在共同性外斜視家系中同時(shí)檢測(cè)ARIX、TUBB2b、TUBB3基因,探討ARIX、TUBB2b、TUBB3基因在共同性外斜視遺傳中的作用。

      1 資料與方法

      1.1一般資料 患者1,女,46歲;患者2,男,41歲。兩例患者為同父母姐弟,2014年7月因共同性外斜視來(lái)本院行手術(shù)治療。經(jīng)追查發(fā)現(xiàn)一個(gè)完整共同性外斜視家系,患者母親年輕時(shí)患有外斜視,已手術(shù)矯正。兩例患者各有1名女兒患有共同性外斜視(隱斜),暫保守觀察。所有患者及家系為健康人,均足月順產(chǎn),無(wú)低出生體質(zhì)量、無(wú)吸氧史、無(wú)傳染病史,排除家系其他疾病及遺傳性疾病史。

      1.2方法

      1.2.1試驗(yàn)取材 本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)評(píng)估(批準(zhǔn)號(hào):201439),遵循赫爾辛基宣言,征求患者及家屬同意并簽署知情同意書(shū)后,抽取1名正常親屬外周靜脈血,標(biāo)記為1號(hào),抽取4例患者外周靜脈血,分別標(biāo)記為2、3、4、5號(hào)。1、2、4號(hào)為親姐弟3人,其中2、4號(hào)為共同性外斜視患者并行斜視矯正手術(shù);3、5號(hào)分別為4、2號(hào)女兒,患有共同性外隱斜,暫不需治療。5人間有血緣關(guān)系,采取標(biāo)本送ARIX基因突變檢查,并繪制家系圖譜(圖1)。另抽取其他3名無(wú)血緣關(guān)系健康人外周靜脈血作為陰性對(duì)照,分別標(biāo)記為6、7、8號(hào),和上述5個(gè)標(biāo)本一起送TUBB2b基因、TUBB3基因突變檢查。所有標(biāo)本采取后存放于-80 ℃的冰箱中保存,OMEGA試劑盒,PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

      1.2.2試驗(yàn)方法 通過(guò)對(duì)家系患者外周血基因組DNA提取、引物合成及PCR擴(kuò)增、純化產(chǎn)物測(cè)序,進(jìn)行該家系患者ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因與Genbank公布的基因正常序列比對(duì)。試驗(yàn)方法分為基因組DNA提取,引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增,測(cè)序3步進(jìn)行。

      1.2.2.1基因組DNA提取 外周血液DNA的提?。翰捎肊.Z.N.A.?血液DNA微量提取試劑盒(Omega公司,美國(guó)),按照說(shuō)明書(shū)提取DNA后測(cè)量基因組DNA的濃度和光密度(OD)值(Nanodrop 2000,Thermofish公司,美國(guó))。提取的DNA取2 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)?;蚪MDNAOD260/OD280值為1.72~2.01,濃度為40~75 ng/μL,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶單一,基因組DNA于-80 ℃保存。

      表1 ARIX基因、TUBB2b基因、TUBB3基因外顯子引物序列

      1.2.2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因外顯子區(qū)域。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL,包括1 μL模板DNA(10~60 ng/μL),10 μL Takara 2×PCR Premix(RR003A),1 μL引物(2.5 pmol/μL),9 μL ddH2O。使用ABI公司的9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。ARIX基因反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,(94 ℃ 45 s ,59 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s)×40個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min 終止反應(yīng)。TUBB2b基因反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,(94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。TUBB3基因反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,(94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶均單一。擴(kuò)增產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒(OMEGA D2500-01)說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行回收純化。

      1.2.3測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖檢測(cè)有目的條帶后,由奧美德諾(北京)基因科技有限公司進(jìn)行切膠純化雙向測(cè)序。測(cè)序PCR的條件為:預(yù)變性96 ℃ 30 s,95 ℃變性 30 s,退火溫度50 ℃ 30 s,60 ℃延伸4 min,25個(gè)循環(huán)后,最后60 ℃延伸5 min,16 ℃結(jié)束反應(yīng),純化后上3730xl (BigDye Version3.1,美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國(guó))遺傳分析儀器進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNASTAR軟件分析,并與Genebank進(jìn)行比對(duì)。

      2 結(jié) 果

      2.1ARIX基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank中公布的人野生型ARIX基因序列比較,本研究篩查的家系中患者2、3、4、5號(hào)在ARIX基因熱點(diǎn)突變區(qū)域NM_005169.3:c.156C>T (p.Leu52=);c.215C>T (p.Ala72Val);c.217+19C>A沒(méi)有出現(xiàn)突變,見(jiàn)圖2。

      圖2 ARIX基因熱點(diǎn)突變區(qū)域突變情況

      2.2TUBB2b基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank中公布的人野生型TUBB2b基因序列比較,本研究篩查的家系中2號(hào)患者在TUBB2b基因外顯子rs2259136位點(diǎn)發(fā)生同義突變,見(jiàn)圖3。

      圖3 TUBB2b 基因外顯子rs2259136位點(diǎn)基因型

      2.3TUBB3基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank 中公布的人野生型TUBB3基因序列比較,本研究篩查的家系中2、4、5號(hào)患者在TUBB3基因3′UTR rs1135425位點(diǎn)存在基因突變,見(jiàn)圖4。

      圖4 TUBB3基因3′UTR rs1135425位點(diǎn)基因型

      3 討 論

      共同性外斜視是一種常見(jiàn)的斜視類(lèi)型,早期表現(xiàn)為外隱斜、間歇性外斜視,最后發(fā)展為恒定性外斜視。常發(fā)病于幼兒,早期表現(xiàn)不容易被家長(zhǎng)所識(shí)別,一旦外斜視從間歇性轉(zhuǎn)變?yōu)楹愣ㄐ?,即使手術(shù)治療,恢復(fù)雙眼單視與立體式的可能性也較小。臨床上常見(jiàn)的治療方式是手術(shù)治療,許多患兒因?yàn)槎喾N原因發(fā)展到恒定性外斜視時(shí)才接受手術(shù)治療,嚴(yán)重影響視功能。因此,對(duì)共同性外斜視的發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要。

      共同性外斜視具有遺傳性,國(guó)外有研究提出了一些敏感性位點(diǎn),但無(wú)明確的基因定位,日本學(xué)者調(diào)查了55個(gè)共同性斜視家庭(n=258),進(jìn)行全基因MOD評(píng)分法分析,發(fā)現(xiàn)在一些敏感染色體4q28.3和7q31.2位點(diǎn)區(qū)域,有來(lái)源于父親或母親的遺傳現(xiàn)象[5]。GONG等[6]通過(guò)研究一對(duì)母女都患有間歇性外斜視的患者,在配對(duì)基因PAX3中發(fā)現(xiàn)了1種新的雜合突變(c.G434T)。ZHANG等[7]研究表明MGST2和WNT2是日本患者共同性外斜視敏感性的候選基因。

      共同性外斜視發(fā)病有家族聚集性特點(diǎn),LEE等[8]研究發(fā)現(xiàn)在兄弟姐妹中有一對(duì)患有斜視時(shí),共同性外斜視的發(fā)病年齡、屈光狀態(tài)、臨床特征、斜視的亞型都是相同的,也證明了共同性外斜視的遺傳特性。MATSUO等[9]研究孿生兄弟或姐妹患有共同性斜視病例中,單卵雙生子或三胞胎斜視表現(xiàn)一致性最常見(jiàn),達(dá)84%,雙卵雙生或多卵三胞四胞胎的斜視表現(xiàn)一致性較低,其中間歇性外斜視為主要表現(xiàn)形式。

      研究表明共同性外斜視的遺傳是一個(gè)多因素方式,包括遺傳和環(huán)境因素,最主要的危險(xiǎn)因素有早產(chǎn)兒、低出生體質(zhì)量、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、母親孕期吸煙、遠(yuǎn)視和屈光參差、遺傳因素等[10]。BAGHERI等[11]研究發(fā)現(xiàn),近親結(jié)婚發(fā)生共同性外斜視比例比非近親結(jié)婚高。

      CFEOM是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性眼肌疾病,臨床上主要表現(xiàn)為動(dòng)眼神經(jīng)缺陷引起的斜視。趙堪興[12]提出CFEOM的發(fā)生和KIF21A這種驅(qū)動(dòng)蛋白不能輸送動(dòng)眼神經(jīng)軸突、神經(jīng)肌肉接頭和眼外肌發(fā)育所需物質(zhì)有關(guān),這種斜視是由支配眼球運(yùn)動(dòng)的顱神經(jīng)發(fā)育異常導(dǎo)致。OUYANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)共同性外斜視患者大腦的幾個(gè)區(qū)域腦白質(zhì)體積明顯降低,動(dòng)眼神經(jīng)傳導(dǎo)異常。2007年劉桂香等[14]發(fā)現(xiàn)共同性外斜視的1個(gè)突變基因——ARIX基因位于染色體11q13上,由3個(gè)外顯子組成,編碼1個(gè)同源結(jié)構(gòu)域翻譯因子,對(duì)交感神經(jīng)和與眼位控制有關(guān)的腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元亞群的傳代和生存起關(guān)鍵作用。本研究這個(gè)家族性共同性外斜視家系,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)患者有ARIX基因外顯子的任何突變。

      ARIX基因突變與CFEOM2有關(guān),CFEOM表現(xiàn)為先天性上瞼下垂和外斜視,外斜視眼球運(yùn)動(dòng)受限可能是由于在運(yùn)動(dòng)蛋白KIF21A或tubulin等類(lèi)型的TUBB3或TUBB2b中雜合子錯(cuò)義突變引起的[15]。這些基因突變會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和引導(dǎo)缺陷。日本學(xué)者 NAKANO等[16]通過(guò)研究4個(gè)CFEOM2家系,對(duì)這些家族成員進(jìn)行基因測(cè)序和突變篩查,發(fā)現(xiàn)該家系A(chǔ)RIX/PHOX 2 A 基因的3個(gè)純合子突變與發(fā)病密切相關(guān)。CFEOM的3種遺傳形式被定義為CFEOM1、CFEOM2和CFEOM3。CFEOM2是一種由轉(zhuǎn)錄因子PHOX2A中純合突變引起的神經(jīng)元規(guī)范的常染色體隱性障礙,而CFEOM1和CFEOM3是軸突誘導(dǎo)的常染色體顯性障礙,分別由KIF21A和TUBB3或TUBB2b的雜合突變引起[17]。

      通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)本研究這個(gè)家系患者的TUBB2b 基因的外顯子,發(fā)現(xiàn)2號(hào)患者在rs2259136位點(diǎn)有同義突變,雖并未引起氨基酸改變,但該位點(diǎn)rs2259136首次在共同性外斜視患者中發(fā)現(xiàn),其意義值得進(jìn)一步研究。本家系中2、4、5號(hào)3例共同性外斜視患者,在TUBB3基因中發(fā)現(xiàn)3′UTR區(qū)域rs1135425位點(diǎn)突變,3′UTR具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,可與miRNA或RNA結(jié)合影響mRNA的穩(wěn)定性,進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯,本研究推斷3′UTR區(qū)域rs1135425位點(diǎn)改變可能是引起該家系外斜視的病因。

      對(duì)于共同性外斜視遺傳性來(lái)說(shuō),闡明特定的基因突變?nèi)匀皇且粋€(gè)巨大的挑戰(zhàn),大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其遺傳性是由遺傳和環(huán)境多因素影響的。隨著新興的基因組測(cè)序工具的使用,學(xué)界可能會(huì)產(chǎn)生新的見(jiàn)解,現(xiàn)在斜視的遺傳性研究也開(kāi)始有從研究斜視肌肉分子組成、調(diào)控基因表達(dá)方向進(jìn)行的,AGARWAL等[18]研究發(fā)現(xiàn)斜視肌的分子組成發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的改變。未來(lái)還會(huì)有更多新的研究方向產(chǎn)生,本研究發(fā)現(xiàn)的基因突變位置可能是未來(lái)研究的基礎(chǔ),了解這些基因突變的作用有助于了解目前尚不清楚的發(fā)病機(jī)制,這也是本課題組臨床研究工作開(kāi)展的目的。

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