張戈垚 黃翔華

【摘要】間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于人體發(fā)生、發(fā)育過(guò)程的許多種組織中，前列腺中也存在MSCs。體外分離培養(yǎng)MSCs所采用的體系一般分為無(wú)血清培養(yǎng)體系和有血清培養(yǎng)體系。本研究選取常規(guī)無(wú)血清MSCs培養(yǎng)液和MEMɑ+10%MSCs金牌血清培養(yǎng)液這兩種培養(yǎng)體系同時(shí)培養(yǎng)人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞（human prostate-derived? mesenchymal stem cells，hPMSCs），觀察培養(yǎng)后的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的差異，從而推測(cè)有無(wú)血清的培養(yǎng)體系對(duì)人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。研究結(jié)果表明，與無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液比較，MEMɑ+10%間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清培養(yǎng)液中的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化能力完全，符合間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果為臨床和實(shí)驗(yàn)室科研選用適宜的培養(yǎng)體系提供了初步的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞;培養(yǎng)條件;分化

【中圖分類號(hào)】R181.3+2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）02-004-02

1研究背景

1.1人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)介

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體的大多數(shù)器官中均具有MSCs，具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖和多分化潛能，在組織器官的損傷修復(fù)中有重要的作用[1]。良性前列腺增生包含腺體和間質(zhì)組織增生，正常前列腺的間質(zhì)細(xì)胞與皮質(zhì)細(xì)胞比例為2：1，在前列腺增生組中，間質(zhì)細(xì)胞與皮質(zhì)細(xì)胞之比升高為5：1，隨著年齡增加，細(xì)胞增殖能力大大降低[2，3]。目前，我們能夠從肌肉、骨髓、肺、脂肪、肝、胰腺等組織以及臍帶血、羊水中制備MSCs[1]。有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺中也存在MSCs，有關(guān)它們的分化能力罕有報(bào)道[4]。

1.2MSCs體外分化能力和鑒定

體外分離培養(yǎng)MSCs所采用的體系一般包括有血清和無(wú)血清培養(yǎng)體系，前者為醫(yī)用級(jí)MSCs采用，后者多為實(shí)驗(yàn)室研究級(jí)MSCs采用[5，6]。

MSCs在體外特定條件下可分化為多種中胚層來(lái)源的細(xì)胞[7]。通過(guò)對(duì)定向分化細(xì)胞的檢測(cè)來(lái)確定MSCs在不同培養(yǎng)基中分化能力是否存在差異[8-10]。

油紅O染料（Oil Red-O）屬于蘇丹染料家族的一員，是一種脂溶性的偶氮染料[11]。由于在成脂分化作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)先后誘導(dǎo)分化為前成脂細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，后者聚集著大大小小的脂肪滴，油紅O在脂肪中的溶解度大于其在染液中的溶解度，因而使脂肪著色，呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

茜素紅S（Alizarin Red S）是一種常用示鈣染劑，廣泛用作生物醫(yī)學(xué)樣本中含鈣目標(biāo)物的染色檢驗(yàn)。游離的鈣離子可與茜素紅S形成紅色沉淀，固著的鈣則會(huì)被直接染成紅色。在成骨誘導(dǎo)分化作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)被逐漸分化為骨細(xì)胞，包括鈣化骨節(jié)（鈣鹽結(jié)晶體）的形成和細(xì)胞的泌鈣反應(yīng)，兩者均可被茜素紅S染成紅色。

阿爾新藍(lán)8GX（Alcian Blue 8GX）是阿爾新藍(lán)家族的一種，廣泛用于酸性多糖的染色，例如軟骨或其他組織中的糖胺聚糖以及細(xì)胞分泌的外被多糖等。在軟骨誘導(dǎo)分化作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)被誘導(dǎo)成為軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞外具有一層富含蛋白多糖的基質(zhì)，是軟骨分化的標(biāo)志物，可被阿爾斯新藍(lán)染成藍(lán)色或藍(lán)綠色。Alcian Blue染色是成熟軟骨細(xì)胞的標(biāo)志。

2研究目的和意義

2.1研究目的

實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)用血清成分不確定，因血清品質(zhì)和添加量不同，其中的因子對(duì)MSCs的影響有差異。市場(chǎng)銷售的間充質(zhì)干細(xì)胞成品培養(yǎng)液多為無(wú)血清培養(yǎng)液，成分明確，但適用細(xì)胞類型有限。本研究選取Biological Industries公司出品的常規(guī)無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液和MEMɑ+10%間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清培養(yǎng)液這兩種培養(yǎng)體系，觀察分離且鑒定過(guò)的hPMSCs誘導(dǎo)分化能力的區(qū)別，從而推測(cè)有無(wú)血清對(duì)hPMSCs的影響。

2.2研究意義

干細(xì)胞是一類有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞，在特定條件下，它們可轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N或多種細(xì)胞。有關(guān)人類MSCs的研究最終的目標(biāo)均是希望應(yīng)用于臨床。目前間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)在解決多種疾病方面有重大突破。但是考慮到動(dòng)物血清的臨床使用風(fēng)險(xiǎn)，市場(chǎng)提供的成品培養(yǎng)液均是無(wú)血清產(chǎn)品，這些產(chǎn)品適用MSCs類型有限，為滿足多種類型MSCs的臨床研究需要，我們必須要關(guān)注新型間充質(zhì)干細(xì)胞在使用常規(guī)有血清和無(wú)血清培養(yǎng)體系中的分化差異，該類比較研究未見報(bào)道。

3材料與方法

3.1材料與試劑

建系的人間充質(zhì)干細(xì)胞由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科研究所提供，MEMɑ基礎(chǔ)培養(yǎng)液、間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清、MSC NutriStem XF成品培養(yǎng)液、成脂誘導(dǎo)分化液、成骨誘導(dǎo)分化液、成軟骨誘導(dǎo)分化液、成脂分化染色液試劑盒、成骨分化染色液試劑盒、成軟骨分化染色液試劑盒、MSC Attachment solution均由Biological Industries公司提供。

3.2儀器與設(shè)備

15ml離心管、50ml離心管、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（均購(gòu)自Corning公司）;細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）、1000μl移液器、無(wú)菌注射器、0.22μm無(wú)菌濾器、倒置顯微鏡（Nikon）、超凈工作臺(tái)、冰箱

3方法

（1）hPMSCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配制

①成脂分化完全培養(yǎng)基的配制：

室溫下解凍2 個(gè)Supplement Mix（Mix I 和Mix II），將0.1 ml Supplement Mix I 與 1.5 ml Supplement Mix II 加入到100 ml Adipogenic Basal Medium 中，即為誘導(dǎo)成脂分化完全培養(yǎng)基。該完全培養(yǎng)基可在2-8°C 儲(chǔ)存一個(gè)月。

②成脂分化完全培養(yǎng)基的配制：

MSC go Osteogenic XF是即用型完全培養(yǎng)基。

③成軟骨分化完全培養(yǎng)基的配制：

室溫下解凍Supplement Mix，將Supplement Mix 和Chondrogenic Basal Medium 以1：10 的比例混合即為完全分化培養(yǎng)基（如：10 ml Supplement Mix + 100 ml Basal Medium）。

該完全分化培養(yǎng)基可在2-8°C儲(chǔ)存一個(gè)月。

（2）接種hPMSCs：

用MSC Attachment solution （BI： 05-752-1，1：100 DPBS 稀釋使用） 預(yù)包被一個(gè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板18孔，其中9孔加入1 ml/孔 MSC NutriStem XF成品間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液，接種0.75x105 細(xì)胞。剩余9孔加入1 ml/孔MEMɑ基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清的混合液，接種0.75x105細(xì)胞。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h 后，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，分別將MSC NutriStem XF 培養(yǎng)基和MEMɑ基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清的混合液吸除。每3孔細(xì)胞分為一組，每種培養(yǎng)液體系各有3組，這3組分別加入1ml/孔成脂分化培養(yǎng)基、成骨分化培養(yǎng)基和成軟骨分化培養(yǎng)基。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天，期間每3天換液一次。

（3）hPMSCs分化的染色鑒定

①成脂誘導(dǎo)分化染色鑒定

（A）染色前，將Adipo-Staining A與Adipo-Staining B （C37A40010） 按3：2的體積比混合，即為染色工作液（Staining Solution）。每次使用現(xiàn)用現(xiàn)配，3 小時(shí)內(nèi)使用。

（B）吸棄分化培養(yǎng)基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A）輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)瓶底面

（C）吸棄DPBS，加入3 ml Adipo-Fixation （C37A10020），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使底面浸潤(rùn)均勻，室溫下靜置30 分鐘。

（D）吸棄Adipo-Fixation，加入3 ml Adipo-Wash I （C37A20050），潤(rùn)洗底面，靜置2-3min

（E）吸棄Adipo-Wash I，加入3 ml Staining Solution使底面浸潤(rùn)均勻，室溫下靜置30 min。

（F）吸棄Staining Solution，加入3mlAdipo-Wash II （C37A50050），

（G）吸棄Wash II，重復(fù)（F），再次漂洗細(xì)胞（如若上清依然很紅，可延長(zhǎng)漂洗時(shí)間或再漂洗一次）。

（H）加入1 ml Adipo-Inspection（C37A60010），置于顯微鏡下觀察、拍照

②成骨誘導(dǎo)分化染色鑒定

（A）吸棄分化培養(yǎng)基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)瓶底面

（B）吸棄DPBS，加入3 ml Fixation solution（C37C10020），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使底面浸潤(rùn)均勻，室溫下靜置30 分鐘

（C）吸棄Fixation solution;加入3 ml Wash I （C37C20050），潤(rùn)洗細(xì)胞2-3 次

（D） 吸棄Wash I，加入3 ml StainingSolution （C37C30020），底面浸潤(rùn)均勻，室溫染色30 分鐘

（E）吸棄Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37C40050），潤(rùn)洗細(xì)胞2-3 次

（F）吸棄Wash II，加入1 ml Inspection Solution（C37C50010），置于顯微鏡下觀察、拍照（細(xì)胞會(huì)被染成橘紅色）。

③成軟骨誘導(dǎo)分化染色鑒定

（A）吸棄分化培養(yǎng)基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)瓶底面。

（B）吸棄DPBS，加入3 ml Fixation solution （C37B10020），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使底面浸潤(rùn)均勻，室溫下靜置30 分鐘。

（C） 吸棄Fixation solution，加入3 ml Wash I （C37B20050），潤(rùn)洗細(xì)胞，靜置2-3 分鐘

（D）吸棄Wash I，加入3 ml Staining Solution （C37B30020），底面浸潤(rùn)均勻，室溫避光染色過(guò)夜

（E）吸棄Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37B40050），潤(rùn)洗細(xì)胞。

（F）吸棄Wash II，重復(fù)第5 步，再次漂洗細(xì)胞（如若上清依然很藍(lán)，可延長(zhǎng)漂洗時(shí)間或再漂洗一次.注意：不要把細(xì)胞沖下來(lái)）。

（G）加入1 ml Inspection Solution（C37B50010），置于顯微鏡下觀察、拍照。

4結(jié)果分析

在MSC NutriStem XF無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，成脂分化結(jié)果未見紅色油脂滴形成;成骨分化偶見茜素紅S形成的紅色沉淀;成軟骨分化可見藍(lán)綠色結(jié)構(gòu)（圖1）。這提示MSC NutriStem XF無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂分化有障礙。相較而言，在 MEMɑ基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%間充質(zhì)干細(xì)胞金牌血清中培養(yǎng)的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，可見紅色油脂滴形成，說(shuō)明成脂分化成功;成骨分化可見大量的茜素紅S形成的紅色沉淀;成軟骨分化可見明顯藍(lán)綠色結(jié)構(gòu)（圖2）。這說(shuō)明該體系培養(yǎng)的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化能力完全，符合間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力標(biāo)準(zhǔn)。雖然這一體系含有血清，但該體系培養(yǎng)的人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)穩(wěn)定。

5討論

5.1創(chuàng)新

截至目前，未見有關(guān)比較人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞在有血清和無(wú)血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)后體外誘導(dǎo)分化能力比較的報(bào)道。分析這一分化能力的差異，可為臨床和實(shí)驗(yàn)室科研挑選適宜的維持人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)穩(wěn)定的培養(yǎng)體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。比起人血清的風(fēng)險(xiǎn)，更應(yīng)該注重細(xì)胞性質(zhì)的穩(wěn)定。

5.2展望

本項(xiàng)研究?jī)H簡(jiǎn)單探討了不同培養(yǎng)體系中人前列腺間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化能力的差異，并未深入引起這種差異的的深層次原因。今后我們將分析引起這種差異的關(guān)鍵基因或蛋白質(zhì)，為臨床和科研需求提供更為詳盡的研究基礎(chǔ)。

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