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結(jié)核病仍是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病之一，2017年全球估算結(jié)核病死亡病例約為157萬，全球約有45.9萬耐多藥結(jié)核病患者(MDR-TB)[1]。耐多藥結(jié)核病的治療極其困難，這已經(jīng)成為世界性的難題，因此制定有效的MDR-TB治療方案對于結(jié)核病疫情的有效控制極為重要。異煙肼(Isoniazide, INH)是目前使用的重要的一線抗結(jié)核藥物，是結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)化療方案的重要組成部分，被稱為“全效殺菌藥”[2]。目前，INH耐藥被認(rèn)為是耐多藥結(jié)核病的開始階段[3]。臨床上，結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥后，通常選用丙硫異煙胺(Protionamide, Pto)來代替INH組成治療方案。Pto和乙硫異煙胺(Ethionamide, Eto)均為異煙酸的衍生物，兩者與INH作用相似，均與INH有部分的交叉耐藥性，且Pto一旦耐藥則不易恢復(fù)敏感性[2]。因此，研究重慶市結(jié)核分枝桿菌INH與Pto的耐藥情況，對INH耐藥及耐多藥結(jié)核病的臨床治療有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1菌株來源分析 2015年10月至2017年10月期間重慶市39個區(qū)縣有傳統(tǒng)藥敏實驗結(jié)果并鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株，收集其中INH和Pto任意耐藥的菌株288例作為調(diào)查對象。所收集的患者菌株中，男性229例，女性59例，年齡15～84歲，平均年齡47歲。根據(jù)患者年齡將研究對象分為3組：15～44歲、45～59歲和≥60 歲。

1.1.2相關(guān)定義 MDR-TB是指結(jié)核病患者感染的MTB經(jīng)體外藥敏試驗證實至少同時對INH和利福平耐藥；XDR-TB是指在MDR-TB的基礎(chǔ)上至少同時對一種氟喹諾酮類和一種二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥；Pre-XDR-TB即指對氟喹諾酮類或二線注射藥物耐藥的患者。

1.2 方法

1.2.1藥敏試驗及菌種鑒定培養(yǎng) 陽性的菌株采用比例法進行藥敏試驗[4]。藥敏試驗包含4種一線抗結(jié)核藥物：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)；6種二線抗結(jié)核藥物：氧氟沙星(Ofx)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、對氨基水楊酸(PAS)和丙硫異煙胺(Pto)。耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落數(shù)之比≥1%，即為耐藥。采用對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸酰肼(TCH)生長試驗對分枝桿菌進行菌種鑒定。

1.2.2質(zhì)量控制 市級參比室每年接受國家參比室的抗結(jié)核藥物敏感性熟練度測試，以保證實驗室的工作質(zhì)量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 收集病例的基本信息及藥敏實驗結(jié)果輸入Excel進行管理，采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1INH與Pto耐藥總體情況 所收集的288例INH和Pto任意耐藥的菌株中，INH耐藥、Pto敏感菌株為269例，INH敏感、Pto耐藥菌株為3例，INH和Pto均耐藥菌株為16例。詳見表1。

表1 288例菌株INH或Pto耐藥狀況Tab.1 Drug resistant state of 288 INH or Pto-resistant strains

2.2INH或Pto耐藥患者的人群分布 INH和Pto耐藥菌株中男性的耐藥率均高于女性(79.3%vs20.7%；68.4%vs31.6%)，但在兩種耐藥菌株中，男性INH和Pto耐藥率與女性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.254，P>0.05)。INH耐藥菌株中，各年齡段耐藥差異不明顯；Pto耐藥菌株中，年齡15～44歲組耐藥率高于45～59歲組(73.7%vs26.3%)，年齡≥60歲組的患者無Pto耐藥發(fā)生。兩種耐藥菌株中，年齡15～44歲組Pto的耐藥率顯著高于INH的耐藥率(χ2=9.286，P<0.01)。詳見表2。

2.3不同治療史肺結(jié)核患者的耐藥情況 兩種耐藥菌株中，復(fù)治患者的耐藥率均高于初治患者(INH耐藥株：65.6%vs34.4%；Pto耐藥株：52.6%vs47.4%)，但初、復(fù)治患者INH或Pto的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(初治：34.4%vs47.4%；復(fù)治：65.6%vs52.6%；χ2=1.316，P>0.05)。詳見表2。

2.4不同登記分類 肺結(jié)核患者的耐藥情況兩種耐藥菌種中，高危人群的耐藥率均高于新患者(INH耐藥株：82.8%vs17.2%；Pto耐藥株：73.7%vs26.3%)。INH耐藥菌株中，登記為復(fù)發(fā)/返回患者耐藥率最高，達45.6%；Pto耐藥菌株中，新患者與復(fù)發(fā)/返回患者的耐藥率最高，均為26.3%。各登記分類患者菌株INH或Pto的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表3。

2.5INH或Pto耐藥菌株中耐多藥及廣泛耐藥情況 INH耐藥菌株和Pto耐藥菌株中，MDR-TB的發(fā)生率均較高(83.5%vs78.9%)，但MDR-TB、XDR-TB發(fā)生率在兩種耐藥菌株中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.706，P>0.05；χ2=0.218，P>0.05)。Pto耐藥組中，Pre-XDR-TB發(fā)生率及Ofx耐藥發(fā)生率要顯著高于INH耐藥組(36.8%vs11.6%；73.7%vs37.2%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.949，P<0.01；χ2=9.928，P<0.01)。詳見表4。

表4 INH耐藥株或Pto耐藥株耐多藥及廣泛耐藥情況Tab.4 MDR-TB, XDR-TB and Ofx resistance in INH- or Pto-resistant strains

2.6 INH和Pto交叉耐藥菌株耐藥相關(guān)因素分析

2.6.1INH和Pto交叉耐藥相關(guān)影響因素 在收集的16株INH與Pto交叉耐藥菌株中，男性的耐藥率高于女性(62.5%vs37.5%)。不同年齡組中，年齡15～44歲組患者的耐藥率最高(81.3%)，其次為年齡45～59歲組(18.7%)，年齡≥60歲組患者無交叉耐藥發(fā)生。不同治療史患者中，復(fù)治患者交叉耐藥率高于初治患者( 56.2%vs43.8%)。在交叉耐藥的患者中，93.8%為MDR-TB患者，Pre-XDR-TB和XDR-TB的發(fā)生率也分別高達37.5%和43.8%。根據(jù)地域分布，萬州片區(qū)交叉耐藥菌株比率達56.2%。詳見表5。

表5 INH與Pto交叉耐藥菌株耐藥相關(guān)影響因素分析Tab.5 Factors associated with the cross-resistance of INH and Pto

2.6.2INH和Pto交叉耐藥菌株耐藥譜分析 在16例INH和Pto交叉耐藥菌株中，僅1例為多耐藥菌株，對6種抗結(jié)核藥物耐藥，其余15例均為耐多藥患者，至少對4種抗結(jié)核藥物耐藥，有1例對全部10種抗結(jié)核藥物耐藥，耐藥組合類型多達8種。交叉耐藥菌株在新患者和高危人群中耐藥情況詳見表6。

3 討 論

近年來，INH耐藥結(jié)核病的發(fā)生呈現(xiàn)上升的趨勢，且重慶地區(qū)MDR-TB患者對二線抗結(jié)核藥物的耐藥情況較為嚴(yán)重，其中，乙硫異煙胺耐藥患者在MDR-TB患者中概率高達9.9%[5]。INH與Pto和乙硫異煙胺存在部分交叉耐藥性，一旦使用Pto對INH耐藥菌株進行治療，很可能因INH與Pto交叉耐藥而導(dǎo)致治療方案無效。本研究首次對重慶市 INH或Pto任一耐藥菌株及其交叉耐藥菌株耐藥特點進行分析，以期為重慶市INH耐藥及耐多藥結(jié)核病患者的有效治療提供參考。

表6 INH和Pto交叉耐藥菌株耐藥譜分析Tab.6 Spectrum of drug resistance in INH and Pto cross-drug resistance strains

本研究收集的INH或Pto任一耐藥菌株中，單耐異煙肼菌株高達27株，Pto耐藥菌株在MDR-TB中所占比例達6.3%(15/238)，低于李心德等[6]的研究結(jié)果(MDR-TB中Pto耐藥率為12.9%)。本研究中Pto耐藥率比較低，可能是由于表型藥敏試驗所用的商品化固體培養(yǎng)基的Pto耐藥界限值較高，從而導(dǎo)致假敏感[7]；也可能是由于所收集菌株的范圍或所采用的藥敏方法不同[8]。

研究結(jié)果顯示，男性耐INH或Pto的比率均高于女性，且年齡15～44歲也是Pto耐藥發(fā)生的危險因素，這可能與男性和青年人一般是家庭的主要經(jīng)濟支柱，工作壓力大，在外工作時間長，流動性大，且治療依從性較差等因素有關(guān)[9-10]。已有相關(guān)研究表明，45歲以下是耐多藥發(fā)生的危險因素[10]。與其他研究結(jié)果不盡相同，澳大利亞等國家，女性是耐藥發(fā)生的危險因素[11]，但也有研究表明，性別與菌株的耐藥性無關(guān)[12]。這可能是因為耐藥與其他各種因素相關(guān)，也因各個國家的實際狀況不同而有差異。

復(fù)治患者耐異煙肼或Pto的概率均高于初治患者，可能與復(fù)治患者既往不規(guī)律用藥、治療史過多及初治方案選擇不當(dāng)?shù)扔嘘P(guān)[13]。值得注意的是，即使是初治患者，耐INH或Pto的概率也比較高，尤其是初治患者Pto耐藥比率已高達47.4%，這可能與耐藥結(jié)核病患者就診不及時、管理不規(guī)范，導(dǎo)致耐藥菌株的進一步傳播有關(guān)[14]。有研究表明，傳播才是造成耐(多)藥結(jié)核病流行的主要因素[15]。因此，醫(yī)生在對初治患者進行治療時，應(yīng)根據(jù)患者治療史和耐藥結(jié)果制定合理的治療方案，以免因經(jīng)驗性用藥造成耐藥狀況的進一步加劇。另外，相關(guān)部門應(yīng)加強結(jié)核病防治知識的宣傳，強化患者的健康教育，促進耐藥結(jié)核病患者的規(guī)范管理，減少耐藥菌株的傳播。重慶市尚未對耐藥患者菌株進行基因分型分析，因此重慶市耐藥患者的傳播情況還有待進一步深入的研究。不同登記分類菌株中，高危人群耐INH或Pto的概率高于新患者，且高危人群中復(fù)發(fā)/返回及初治2/3月末陽性患者是耐藥的主要人群，提示高危人群仍是我們關(guān)注的重點對象，應(yīng)繼續(xù)做好高危人群的耐藥篩查工作。

Pto耐藥菌株中，Pre-XDR-TB和Ofx耐藥的發(fā)生率均高于INH 耐藥菌株，提示Pto耐藥的MDR-TB患者可能更易發(fā)生廣泛耐藥。有研究報道，Pto耐藥與左氧氟沙星耐藥相關(guān)，左氧氟沙星耐藥菌株中更易發(fā)生Pto耐藥[8]。另有研究顯示，MTB對吡嗪酰胺的耐藥率隨著氟喹諾酮類耐藥率的升高而升高[16]。目前對Pto或吡嗪酰胺與氟喹諾酮類耐藥相關(guān)的確切原因還不太清楚，但氟喹諾酮類耐藥與Pto耐藥的高相關(guān)性可能是由于MTB暴露在氟喹諾酮類藥物后產(chǎn)生的氧自由基增加了突變的產(chǎn)生[17]。據(jù)報道，一般的細菌感染患者氟喹諾酮類藥物的濫用導(dǎo)致了我國氟喹諾酮類藥物耐藥性的增加[18]。根據(jù)本研究，氟喹諾酮類藥物的高耐藥性很可能導(dǎo)致隨后的Pto耐藥，從而使包含Pto藥物的治療方案對氟喹諾酮類藥物耐藥的結(jié)核病患者無效。

INH與Pto存在一定的交叉耐藥性。本研究中收集了16株INH與Pto交叉耐藥菌株，青年人(15～44歲)交叉耐藥的發(fā)生率仍舊較高，與以前的報道一致[10]。交叉耐藥菌株中MDR-TB的發(fā)生率高達93.8%，由于Pto耐藥與Ofx耐藥相關(guān)，因此交叉耐藥菌株可能更容易發(fā)展為XDR。交叉耐藥菌株具有一定的區(qū)域分布特征，其中，萬州片區(qū)交叉耐藥菌株比率高達56.2%，這可能與該地區(qū)醫(yī)生的用藥習(xí)慣有關(guān)，也可能與該地區(qū)耐藥患者的管理不規(guī)范，造成耐藥菌株的傳播有關(guān)。INH與Pto交叉耐藥菌株最少對4種抗結(jié)核藥物耐藥，最多對所檢測的10種抗結(jié)核藥物均產(chǎn)生耐藥。但由于本研究目前收集的Pto耐藥菌株數(shù)量有限，導(dǎo)致本研究可能存在一定的偏差。結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥的主要分子機制與katG、inhA、ahpC和kasA基因突變有關(guān)[19]，而Pto耐藥與inhA基因突變密切相關(guān)[7]。因此，INH和Pto交叉耐藥的發(fā)生與inhA基因突變的相關(guān)性還需要做進一步的分析。

本研究對重慶市近兩年INH或Pto耐藥及其交叉耐藥流行情況進行了分析，表明重慶市結(jié)核分枝桿菌Pto耐藥與Ofx耐藥存在著一定的相關(guān)性。因此，應(yīng)采取相應(yīng)措施控制氟喹諾酮類藥物的使用，以減少廣泛耐藥的發(fā)生。目前，重慶市INH耐藥與Pto耐藥情況已比較嚴(yán)重，且存在交叉耐藥的情況，醫(yī)生在為INH耐藥、Ofx耐藥或耐多藥結(jié)核病患者制定化療方案時應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果，盡量避免經(jīng)驗性用藥，以減少更多耐藥的發(fā)生。

利益沖突：無