趙 晨，趙祥穎，張家祥，張立鶴，劉建軍

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院 山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟(jì)南250013）

D-核糖是一種功能性戊糖，是核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的重要組成成分[1]，具有改善心臟缺血、提升心臟功能、增強(qiáng)機(jī)體能量、緩解肌肉酸痛等生理功效[2]，在食品[3]、醫(yī)藥[4-5]等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。微生物發(fā)酵法是目前公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)、高效的D-核糖生產(chǎn)方式[6-7]。國內(nèi)外D-核糖工業(yè)化生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)誘變選育的野生型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉(zhuǎn)酮酶缺陷變異株[8-9]。而傳統(tǒng)誘變方法正突變效率低、篩選工作量大、誘變周期長，且多重誘變易造成較多無義突變和負(fù)向突變積累，致使菌株活性、生長速度、底物同化能力和環(huán)境耐受性降低[10]。因此，亟需新的育種方法構(gòu)建高效D-核糖高產(chǎn)菌株。

2002年，ZHANG Y X等[11]首次提出了基因組重排（genome shuffling）概念，可將基因重組對象從單個基因擴(kuò)展到整個基因組，在代謝工程中具有重大的應(yīng)用潛力[12-13]。相比傳統(tǒng)誘變和基因工程育種方法，基因組重排技術(shù)操作簡單、易推廣、見效快，可在微生物基因結(jié)構(gòu)功能以及相關(guān)產(chǎn)物代謝表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不清楚的情況下，在全基因組不同位置上同時發(fā)生多交換、多基因的隨機(jī)整合重組，迅速將某一理想表型的多個甚至數(shù)十個突變基因優(yōu)化組合，實現(xiàn)目的產(chǎn)物產(chǎn)量的大幅增加[14]，并有效剔除負(fù)突變，改善菌種性能[15]。目前該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于乳酸[16]、核黃素[17]等高產(chǎn)菌株的選育研究。

前期，實驗室采用多重誘變育種篩選獲得一株野生型D-核糖高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌SFR-4[18]，由于負(fù)突變積累，菌株SFR-4生長緩慢、抗逆性差，發(fā)酵過程易于染菌，顯著增加了工業(yè)發(fā)酵過程控制難度；同時，該菌株難以進(jìn)行有效基因工程操作，斷絕了其工業(yè)化定向改造的可能。而以遺傳背景清晰的枯草芽孢桿菌模式菌株B.subtilis 168[19]構(gòu)建的轉(zhuǎn)酮酶突變菌株B.subtilis SFR-3A[20]，能夠積累較高D-核糖，且生長速度快、環(huán)境耐受性強(qiáng)，并具有較成熟的基因工程操作工具，方便實現(xiàn)菌株分子改造，工業(yè)應(yīng)用前景較好，但D-核糖產(chǎn)量略低于SFR-4菌株。經(jīng)全基因組測序表明，菌株SFR-3A與SFR-4 D-核糖生物合成相關(guān)基因序列并無差別，分析其D-核糖產(chǎn)量差異可能源于其他尚未明確的全局代謝調(diào)控因子等調(diào)控機(jī)制，因此，試圖篩選單個基因改造來提高B.subtilis SFR-3A D-核糖產(chǎn)量的難度較大。

為此，本研究首先以前期構(gòu)建B.subtilis SFR-3A時獲得的攜帶博萊霉素抗性基因（zeor）的過程菌株SFR-3A zeor為出發(fā)菌株，通過轉(zhuǎn)入木糖誘導(dǎo)型毒性蛋白mazF表達(dá)載體，獲得具有正反向雙重篩選標(biāo)記菌株，后與菌株SFR-4基因組重排，選育抗逆D-核糖高產(chǎn)工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與引物

本實驗所用的菌株見表1，其中B.subtilis SFR-4[18]為多重誘變篩選獲得的轉(zhuǎn)酮酶突變株，B. subtilis SFR-3A zeor[20]為采用SFR-4菌株轉(zhuǎn)酮酶突變序列替換B.subtilis 168菌株相應(yīng)位點篩選獲得的產(chǎn)D-核糖工程菌株，均由本實驗室保藏。

表1 本研究所使用的菌株Table 1 Strains used in the study

本實驗所用引物均由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，如表2所示。

表2 本研究中所使用的引物Table 2 Primers used in the study

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；木糖、牛肉膏（均為生化試劑）、溶菌酶（20 kU/mg）、壯觀霉素、博萊霉素：生工生物工程（上海）股份有限公司；順丁烯二酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨、聚乙二醇4000（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司；玉米漿干粉：西王集團(tuán)有限公司；Prime STAR Max高保真脫氧核糖核酸聚合酶：大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl10g/L，121 ℃滅菌20 min。配制LB平板時加20 g/L瓊脂。

CMR完全再生培養(yǎng)基：蔗糖171.15 g/L，葡萄糖10 g/L，牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgCl·27H2O 4.42 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2。115 ℃滅菌30 min。

木糖篩選培養(yǎng)基：木糖20 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉3 g/L，（NH4）2SO43 g/L，pH 6.5。115 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉3 g/L，（NH4）2SO43 g/L，pH 6.5。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120 g/L，酵母浸粉10 g/L，玉米漿干粉5 g/L，（NH4）2SO45 g/L，pH 6.5。115 ℃滅菌30 min。

SMM緩沖液：蔗糖171.15 g/L，順丁烯二酸2.32 g/L，MgCl·26H2O 4.06 g/L，pH 7.0。115 ℃滅菌30 min。

SMMP緩沖液：蔗糖342.29 g/L，葡萄糖4 g/L，順丁烯二酸4.64 g/L，牛肉膏6 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉6 g/L，MgCl·26H2O 8.12 g/L，NaCl 14 g/L，KH2PO45.28 g/L，K2HPO414.72 g/L，pH 7.0，蔗糖采用0.22 μm無菌過濾器過濾除菌。115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PCT-200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀：美國BIO-RAD公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；722型光柵分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；5-L全自動機(jī)械攪拌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40D葡萄糖分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；Ultimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 反向篩選標(biāo)記菌株構(gòu)建方法

參照LIN Z等[21]描述的反向篩選標(biāo)記構(gòu)建方法。經(jīng)化學(xué)合成后，采用引物P1/P2 PCR得到連接500 bp淀粉酶基因（amyE）上游DNA序列（amyE-UP）、壯觀霉素抗性基因（Spc）r和木糖誘導(dǎo)型啟動子PxylA的amyE-UP-Spcr-PxylA基因片段，采用引物P3/P4 PCR得到連接毒素基因mazF和500 bp amyE下游DNA序列（amyE-DN）的mazF-amyE-DN基因片段，后通過融合PCR獲得amyE-mazF-cassette（見圖1）。采用SPIZIZEN J[22]化學(xué)轉(zhuǎn)化法將該片段轉(zhuǎn)入SFR-3A zeor菌株中，并涂布于含有100 μg/mL壯觀霉素的LB平板中，經(jīng)菌落PCR、基因測序驗證，篩選獲得目的菌株。

圖1 amyE-mazF-cassette反向篩選標(biāo)記Fig. 1 Schematic representation of the counter selectable marker amyE-mazF-cassette

1.3.2 基因組重排方法

（1）原生質(zhì)體的制備

將目的菌株稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16～18 h；轉(zhuǎn)接于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，接種量2%，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 h；取5 mL菌液12 000 r/min離心1 min，棄上清。采用5 mL SMMP緩沖液洗滌離心2次，并將菌體懸浮于SMMP緩沖液中；加入溶菌酶（終質(zhì)量濃度為2 mg/mL），混勻后，37 ℃水浴，每隔30 min進(jìn)行鏡檢。將酶解后的細(xì)菌懸液經(jīng)無菌微孔膜（0.45 μm）過濾，4 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，SMMP緩沖液洗滌離心2次，獲得相關(guān)枯草芽孢桿菌的原生質(zhì)體。

（2）原生質(zhì)體的融合

取兩親株的原生質(zhì)體高滲懸浮液2 mL，混合靜置5 min，3 000 r/min離心10 min，棄上清；加入0.2 mL SMM緩沖液，懸浮沉淀；加入1.8 mL 體積分?jǐn)?shù)為40%的聚乙二醇4000溶液，立即混勻，37 ℃水浴融合2 min，3 000 r/min離心10 min，去上清；加入2 mL SMM緩沖液洗滌離心2次；用2 mL SMM緩沖液重新懸浮，37 ℃水浴培養(yǎng)90 min；將懸浮液涂布于CMR完全再生培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h；挑取菌落至含有20 μg/mL博萊霉素的木糖篩選培養(yǎng)基中篩選，獲得基因組重排目的菌株。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將菌株接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h。以2%接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)96 h。

1.3.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將菌株接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h。以2%接種量接種到裝有3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐通風(fēng)量為1.75 L/min，罐壓維持在0.06 MPa，并通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速維持溶解氧15%，罐溫維持37 ℃，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH 6.5。

1.3.5 分析檢測

（1）生物量測定

生物量采用比濁法，采用分光光度計于波長600 nm處

測定吸光度值（OD600nm值）。

（2）葡萄糖含量測定

將發(fā)酵液離心后，取上清液適當(dāng)稀釋后，采用SBA-40D

葡萄糖分析儀測定。

（3）D-核糖含量的測定

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中D-核糖的含量。HPLC的檢測條件為：Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm），示差折光檢測器（differential refraction detector，RID）檢測，進(jìn)樣量為10 μL，流動相為80%（V/V）乙腈，流速0.6 mL/min，柱溫60 ℃。用流動相對樣品進(jìn)行稀釋后，用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾，采用外標(biāo)法對發(fā)酵液進(jìn)行定量。

（4）D-核糖轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率的計算

式中：CR為D-核糖產(chǎn)量，g/L；CG為底物葡萄糖消耗量，g/L；t為發(fā)酵時間，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組重排選育D-核糖高產(chǎn)菌株

基因組重排育種可以高效地將多種正向優(yōu)勢性狀基因集中，并增加菌株穩(wěn)定性，很大程度上彌補(bǔ)了經(jīng)典物理、化學(xué)誘變對菌株生長、底物利用及耐受性方面造成的不利影響。兩株親株進(jìn)行基因組重排后，如無有效的篩選標(biāo)記，可能會挑取大量未融合的無效雙親菌株，顯著增加了篩選工作量。由于菌株SFR-4添加篩選標(biāo)記困難，因此，本研究在菌株SFR-3Azeor中引入木糖誘導(dǎo)型毒性蛋白基因mazF[23]作為反向篩選標(biāo)記，獲得菌株SFR-3A-ZMS。將該菌株與菌株SFR-4原生質(zhì)體融合后，涂布于CMR完全再生培養(yǎng)基中，并挑取單菌落至含有20 μg/mL博來霉素的木糖篩選培養(yǎng)基中，攜帶mazF標(biāo)記的菌株SFR-3A-ZMS和無博來霉素抗性基因（zeo）r的菌株SFR-4都無法生長，大大提高了篩選效率。后對篩選平板上生長菌株搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，在挑取100株菌株中有69株菌的D-核糖產(chǎn)量高于菌株SFR-3A。

圖2 基因組重排菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig. 2 Shake flask fermentation results of the recombinant strains by genome shuffling

基因組重排雖然可以對親株菌株優(yōu)勢基因進(jìn)行整合，但由于同源重組的隨機(jī)性，親本菌株缺陷基因也可能會被整合，其表達(dá)效果可能會保留甚至擴(kuò)增放大。因此，在基因組重排菌株篩選過程中需對融合菌株進(jìn)行多方面考察。挑取D-核糖產(chǎn)量提高明顯的10株轉(zhuǎn)化株，通過搖瓶發(fā)酵進(jìn)一步考察基因組隨機(jī)重排對菌株生長性能的影響，結(jié)果如圖3所示，No.94、No.96、No.98菌株生長較慢，No.97、No.99、No.100菌株與菌株SFR-3A生長曲線相似。后經(jīng)連續(xù)7代培養(yǎng)，檢測該3株菌均表現(xiàn)出較高的遺傳穩(wěn)定性。選擇D-核糖產(chǎn)量、菌株活性、遺傳穩(wěn)定性較高的No.100菌株為目的菌株，并命名為菌株SFRCP-100，經(jīng)發(fā)酵測定，該菌株D-核糖搖瓶產(chǎn)量達(dá)到34.69 g/L，較菌株SFR-3A提高了32.15%。

圖3 菌株搖床發(fā)酵生長曲線Fig. 3 Growth curves of the strain in shaker flasks of strains

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

前期菌株B.subtilis SFR-3A培養(yǎng)基優(yōu)化研究表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量對菌株D-核糖積累的影響較為顯著[20]。為此，本實驗在菌株SFR-3A發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基氮源進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見圖4。首先考察酵母浸粉對菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵影響，結(jié)果如圖4a所示，對D-核糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，表明酵母浸粉添加量對D-核糖產(chǎn)量影響差異顯著（P＜0.05），在酵母浸粉添加量為5.0～7.5 g/L時，菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵產(chǎn)量增加明顯，當(dāng)酵母浸粉含量為7.5 g/L時，D-核糖產(chǎn)量達(dá)到最大值35.71 g/L，酵母浸粉添加量＞7.5 g/L之后，D-核糖產(chǎn)量開始下降。玉米漿干粉添加量對菌株產(chǎn)D-核糖影響結(jié)果如圖4b所示，對D-核糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，表明玉米漿干粉添加量對菌株產(chǎn)D-核糖影響差異顯著（P＜0.05），玉米漿干粉含量為1～3 g/L時，菌株SFRCP-100 D-核糖產(chǎn)量呈上升趨勢，當(dāng)玉米漿干粉添加量為3 g/L時，D-核糖產(chǎn)量達(dá)到最大值36.11 g/L，當(dāng)玉米漿干粉添加量＞3 g/L之后，D-核糖產(chǎn)量開始下降。在有機(jī)氮源優(yōu)化基礎(chǔ)上，對無機(jī)氮源硫酸銨進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖4c所示，對D-核糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，表明硫酸銨添加量對D-核糖產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）；其中硫酸銨添加量為1～7 g/L時，隨著添加量增加，菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵產(chǎn)量增加，當(dāng)硫酸銨含量為7 g/L時，D-核糖產(chǎn)量達(dá)到最大值37.23 g/L，當(dāng)硫酸銨添加量＞7 g/L之后，D-核糖產(chǎn)量開始下降。因此，酵母浸粉、玉米漿及硫酸銨最適添加量分別為7.5 g/L、3 g/L及7 g/L。氮源優(yōu)化后菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了7.32%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基總氮源添加量與菌株SFR-3A相比有所下降，說明菌株SFR-4的一些優(yōu)良性能在重排菌株中得到顯現(xiàn)。

圖4 氮源組成對菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵的影響Fig. 4 Effects of nitrogen source composition on D-ribose fermentation by strain SFRCP-100

2.3 發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

圖5 菌株SFRCP-100在5L-發(fā)酵罐D(zhuǎn)-核糖發(fā)酵曲線Fig. 5 D-ribose fermentation curve of strain SFRCP-100 in 5 L-fermentor

為研究菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵工業(yè)化應(yīng)用潛力，本實驗采用5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐考察菌株發(fā)酵產(chǎn)D-核糖的發(fā)酵性能，結(jié)果如圖5所示。菌株SFRCP-100 在52 h發(fā)酵周期內(nèi)D-核糖產(chǎn)量達(dá)38.2 g/L，其轉(zhuǎn)化率和整體生產(chǎn)效率分別達(dá)到35%和0.73 g（/L·h）。發(fā)酵過程中，工程菌株SFRCP-100在前8 h內(nèi)，發(fā)酵液幾乎檢測不到D-核糖，8 h后，即對數(shù)生長期后期以后，發(fā)酵液中的D-核糖濃度明顯提高，且直至發(fā)酵結(jié)束D-核糖仍維持相對穩(wěn)定的產(chǎn)物生成速率；同時，工程菌株展現(xiàn)出了較強(qiáng)的菌體生長速率和底物消耗速率，在前12 h內(nèi)，菌體生長較快，12 h后即達(dá)到穩(wěn)定期，菌體量OD600nm值維持在10左右；培養(yǎng)基中葡萄糖在8 h后至發(fā)酵結(jié)束均能維持相對穩(wěn)定的消耗速率；說明菌體代謝及產(chǎn)物生產(chǎn)能力隨發(fā)酵時間的延長衰減較少，這可能是由于相比搖瓶發(fā)酵，采用發(fā)酵罐分批發(fā)酵可以維持穩(wěn)定的發(fā)酵液pH值，且可通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速實現(xiàn)相對較高的溶解氧條件，這均為菌體生長和產(chǎn)物生成創(chuàng)造了有利條件。發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步表明基因組重排技術(shù)能快速提高菌株優(yōu)勢表型、優(yōu)化代謝途徑、增強(qiáng)菌株環(huán)境耐受性，在工業(yè)化生產(chǎn)菌株選育方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

基因組重排技術(shù)兼具了多種育種技術(shù)的優(yōu)勢，且操作簡單、易推廣、見效快，可在微生物基因結(jié)構(gòu)功能以及相關(guān)產(chǎn)物代謝表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不清楚的情況下，迅速將某一理想表型的多個甚至數(shù)十個突變基因優(yōu)化組合，并有效剔除負(fù)突變，改善菌種性能。本實驗通過在D-核糖生產(chǎn)工程菌株SFR-3A中添加正、反向篩選標(biāo)記，實現(xiàn)基因組重排后目的菌株的高效篩選，選育獲得D-核糖高產(chǎn)菌株SFRCP-100抗逆性強(qiáng)，D-核糖產(chǎn)量提高32.15%，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌株SFRCP-100 D-核糖發(fā)酵產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了7.32%，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵D-核糖產(chǎn)量達(dá)到38.2 g/L，其轉(zhuǎn)化率和整體生產(chǎn)效率分別達(dá)到35%和0.73 g（/L·h）。本實驗成功添加正反向篩選標(biāo)記，提高了基因組重排技術(shù)在枯草芽孢桿菌優(yōu)良菌株選育中的有效性和高效性，并為結(jié)合相關(guān)生物技術(shù)發(fā)展，探索菌株選育中表型改良、耐受性增加、代謝途徑調(diào)控等機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。