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      葫蘆素E 通過誘導(dǎo)自噬抑制人膀胱癌細(xì)胞T24 的增殖

      2019-03-08 03:07:20周毅彬王永昌高鵬朱進(jìn)臧亞晨許立軍金露馬麒
      實用醫(yī)學(xué)雜志 2019年4期
      關(guān)鍵詞:換液培養(yǎng)箱膀胱癌

      周毅彬 王永昌 高鵬 朱進(jìn) 臧亞晨 許立軍 金露 馬麒

      1蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科(江蘇蘇州215000);2蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科(江蘇蘇州215000)

      膀胱癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,2012年的統(tǒng)計結(jié)果顯示,當(dāng)年膀胱癌預(yù)計新發(fā)病例429 800 例,其中165 100 例患者因為膀胱癌而死亡[1]。膀胱癌主要發(fā)生在男性,且與吸煙密切相關(guān)。近些年來,由于吸煙人群的減少,歐美大多數(shù)國家膀胱癌的發(fā)病率有所降低[2]。另外,多進(jìn)食水果和蔬菜有助于減少膀胱癌的發(fā)生[3]。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,出現(xiàn)了很多膀胱癌的治療方案,包括手術(shù)及術(shù)后化療和(或)放療,但是膀胱癌的致死率仍然很高。同時,術(shù)后放∕化療副作用大,患者往往難以耐受[4]。因此,研發(fā)有效且副作用低的新型化療藥成為當(dāng)前重要的研究課題之一。近十年來,植物提取劑因其潛在的抗腫瘤特性越來越受到研究者的關(guān)注,且目前批準(zhǔn)用于治療腫瘤的藥物中,有約70%為天然植物的提取成分[5]。葫蘆素E(cucurbitacin E,CuE)為葫蘆科植物的主要成分之一,研究發(fā)現(xiàn)其除了能抗氧化、抗炎外,還有很強的抗腫瘤能力[6]。CuE 能夠通過誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞周期阻滯和自噬性細(xì)胞死亡抑制包括卵巢癌和胰腺癌在內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞的增殖,同時還能夠通過抑制多種信號通路抑制腫瘤血管新生[7-9]。研究報道CuE 能夠誘導(dǎo)G2∕M 周期阻滯和凋亡抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[10],CuE 是否能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬以及所誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞增殖是何影響,目前并不清楚。本研究旨在研究CuE 是否誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞T24 發(fā)生自噬,并進(jìn)一步闡述所誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞增殖的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料及試劑 DMEM 培養(yǎng)基(購于美國Corning 公司),青霉素∕鏈霉素雙抗、BCA 蛋白定量試劑、PBS 和TBS(購自上海碧云天公司),無內(nèi)毒素胎牛血清(購自杭州四季青公司),CuE、MTT、BAFA1 和3-MA(購于美國Sigma 公司),脂質(zhì)體2000(購于美國賽默飛公司),LC3A∕B、p62 及GAPDH一抗和山羊抗兔及驢抗鼠二抗(購于美國CST 公司),GFP-RFP-LC3 質(zhì)粒和T24 細(xì)胞(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所饋贈)[11]。細(xì)胞工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、電泳和轉(zhuǎn)膜儀(購于美國Biorad 公司)、熒光顯微鏡(購于日本Nikon 公司)等常用設(shè)備均由蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素∕鏈霉素雙抗的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中。置于37 ℃、CO2濃度5%和濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一天或按照需要實驗需要換液。待細(xì)胞狀態(tài)良好呈對數(shù)生長時,細(xì)胞經(jīng)PBS 洗2 次后0.25%胰酶消化、培養(yǎng)基中和后1 000 r∕min離心5 min。離心后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基重懸后按照實驗試講進(jìn)行種板等操作。

      1.2.2 MTT 試驗細(xì)胞 按3 000 個∕孔懸于200 μL培養(yǎng)基種于96 孔板中。次日換液,按照實驗設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理,每種處理設(shè)4 個副孔,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后每孔加入20 μL MTT,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。2~4 h 后棄去舊培養(yǎng)基并向每孔加入150 μL DMSO。微型振蕩器振蕩5 min,待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后于置于多功能酶標(biāo)儀中,于490 nm 波長下檢測吸光值。

      1.2.3 Western-blot 將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出后置于冰上,4 ℃預(yù)冷的PBS 洗3 次后加入RIPA裂解液。將懸有細(xì)胞的裂解液移至1.5 mL EP 管中,于冰上靜置5 min 使細(xì)胞充分裂解。4 ℃離心機12 000 r∕min 離心15 min 后棄去管底沉淀。取部分上清通過BCA 法定量,剩余上清加入4×上樣緩沖液,混合均勻后沸水煮5 min。取30 μg 蛋白加到10% SDS-PHAGE 膠孔中,經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)膜后,使用5%脫脂牛奶對膜進(jìn)行封閉,4 ℃過夜或室溫孵育1 h。室溫孵育一抗2 h 或4 ℃過夜。TBST 洗3 次后室溫孵育二抗1 h,TBST 洗3 次后通過ECL法顯影。通過Image-J 軟件計算各條帶的灰度值。

      1.2.4 CuE對T24自噬的影響與LC3翻轉(zhuǎn)實驗 細(xì)胞按500 000 個∕皿種于6 cm 皿中,共4 個皿,分別為對照組、CuE 組、BAFA1 組和CuE+BAFA1 組。次日換液,對照組和BAFA1 組更換為新鮮正常培養(yǎng)基,CuE 組和CuE+BAFA1 組更換為含有1 μmol∕L CUE 的培養(yǎng)基,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后BAFA1組和CuE+BAFA1組加入濃度為10 nmol∕L的BAFA1。12 h 后提取總蛋白并通過western-blot檢測LC3A∕B、p62 和GAPHD 內(nèi)參的表達(dá)。

      1.2.5 GFP-RFP-LC3 雙熒光試驗 細(xì)胞按300 000 個∕孔種于6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后按照脂質(zhì)體2000 的說明書進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染操作。24 h 后消化細(xì)胞離心后按1 000 個∕孔種于腔室載玻片的小室中,共種2 個孔,分別為對照組和CuE 組,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。次日換液。對照組加入含DMSO 的培養(yǎng)基,CuE 組加入終濃度為1 μmol∕L的培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。室溫PBS洗3 次后4%多聚甲醛固定10 min。PBS 洗3 次后將載玻片取出,滴加含DAPI 的封片液后封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

      1.2.6 細(xì)胞計數(shù)試驗 細(xì)胞按300 000 個∕孔種于6 孔板中,設(shè)4 組,分別為對照組、CuE 組、3-MA 組和CuE+3MA 組,每組5 個孔。次日換液,對照組和CuE 組更換為新鮮正常培養(yǎng)基,3-MA 組和CuE+3MA組更換為含有5 mmol∕L3-MA的新鮮培養(yǎng)基。4 h 后,CuE 組和CuE+3MA 組加入CuE,使終濃度為1 μmol∕L,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后消化并重懸于PBS,總體積為5 mL。使用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗均重復(fù)3 次且趨勢一致。使用GraphPad Prism 7.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)作圖并通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P<0.05 視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 CuE抑制T24的增殖如圖1所示,0.25 μmol∕L 的CuE 對細(xì)胞的增殖無明顯影響,隨著濃度的增加,細(xì)胞的增殖逐漸被抑制,24 h 的IC50 約為0.75 μmol∕L。

      圖1 CuE 對細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Determined proliferation inhibition capacity of CuE on T24 By MTT

      2.2 CuE 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬 如圖2所示,CuE處理后自噬標(biāo)記物L(fēng)C3A∕B II表達(dá)升高(P<0.05),LC3A∕B II∕I 的比值升高(P<0.05),同時自噬的底物蛋白p62 表達(dá)減少(P<0.05),提示自噬的發(fā)生。BAFA1 為經(jīng)典的自噬下游抑制劑,其處理后細(xì)胞LC3A∕B II 表達(dá)升高(P<0.05),LC3A∕B II∕I 的比值升高(P<0.05),當(dāng)CuE 與BAFA1 聯(lián)用時,LC3A∕B II 的表達(dá)和LC3A∕B II∕I 的比值進(jìn)一步升高(P<0.05),說明LC3A∕B II 和LC3A∕B II∕I 比值的升高是因為自噬誘導(dǎo)引起,而非阻斷自噬抑制LC3A∕B II 的降解引起,即CuE 誘導(dǎo)了自噬流的發(fā)生。

      2.3 CuE 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬流 為了進(jìn)一步證明CuE 誘導(dǎo)自噬流的發(fā)生,筆者進(jìn)行了GFP-RFP-LC3雙熒光試驗。當(dāng)自噬體形成時,表現(xiàn)為綠色熒光顆粒,當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時,表現(xiàn)為黃色熒光顆粒。如圖3所示,CuE 處理后,黃色熒光顆粒和紅色熒光顆粒的數(shù)目均明顯增多(P<0.05),進(jìn)一步說明了自噬流的發(fā)生。

      2.4 3-MA抑制CuE誘導(dǎo)的自噬 3-MA為經(jīng)典的自噬抑制劑,能將自噬抑制在起始階段。如圖4所示,CuE能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,但是與3-MA(5 mmol∕L)聯(lián)用時,所誘導(dǎo)的自噬完全被抑制(P<0.05)。

      圖2 Western-blot 檢測CuE 對細(xì)胞自噬的影響Fig.2 Check the impacts of CuE treatment on autophagy by Western blot

      2.5 3-MA 抑制自噬后CuE 對細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)減弱 如圖5所示,在MTT 試驗和細(xì)胞計數(shù)試驗中,CuE 均能抑制細(xì)胞的增殖(P<0.05),但是與3-MA 聯(lián)合用,CuE 對細(xì)胞增殖抑制的效應(yīng)明顯減弱(P<0.05)。提示CuE 所誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞增殖起抑制作用。

      3 討論

      自噬為細(xì)胞新陳代謝調(diào)節(jié)的重要組成部分,對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時,細(xì)胞將激活一系列的信號通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,將細(xì)胞內(nèi)多余的或受損傷的蛋白、細(xì)胞器和病原微生物來源的蛋白降解,為細(xì)胞供給營養(yǎng),以維持細(xì)胞的正常功能[12]。研究報道CuE 在HeLa 細(xì)胞和MCF7 誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[9],但CuE 是否能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬,目前并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),CuE 能夠顯著誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞T24 發(fā)生自噬,表現(xiàn)為LC3A∕B2 的表達(dá)和LC3A∕B2∕1 比值的升高,同時自噬經(jīng)典底物蛋白p62 表達(dá)的減少。另外,LC-3 翻轉(zhuǎn)試驗陽性以及GFP-RFP-LC3 熒光試驗中黃色顆粒和紅色顆粒的明顯增多進(jìn)一步佐證了CuE 能夠在T24 中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

      自噬是把雙刃劍,其能通過為細(xì)胞提供營養(yǎng)維持或促進(jìn)細(xì)胞的正常增殖,如在膀胱癌的化療中,化療藥通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生削弱了化療藥的抗腫瘤增殖效應(yīng),為腫瘤對化療藥耐藥的機制之一[13];同時自噬也會通過降解重要細(xì)胞生長調(diào)節(jié)蛋白抑制細(xì)胞的增殖,如抑制G9a 的活性后能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[14]。CuE 所誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞增殖的影響,目前研究尚少。本研究發(fā)生,CuE 能夠抑制T24 細(xì)胞的增殖,同時誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。當(dāng)自噬被抑制后,CuE 對T24 增殖抑制的能力減弱,提示CuE 所誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞的增殖起抑制作用。另外,自噬被抑制后CuE仍能部分抑制T24 的增殖,提示其可能誘導(dǎo)了凋亡或周期阻滯的發(fā)生。CuE 所誘導(dǎo)的自噬對凋亡或周期阻滯有何影響,尚不清楚,有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

      圖3 GFP-RFP-LC3 熒光試驗檢測CuE 對細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Determine autophagy flux by GFP-RFP-LC3 fluorescent assay

      圖4 Western-blot 檢測3-MA 對自噬的抑制Fig.4 Check the autophagy inhibition ability of 3-MA on CuE treatment by Western blot

      圖5 3-MA 抑制自噬后CuE 對細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Influence of CuE-induced autophagy on cell proliferation with autophagy inhibition

      在自噬發(fā)生過程中,細(xì)胞內(nèi)的雙膜結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等將細(xì)胞內(nèi)功能異常的細(xì)胞器、異常折疊的蛋白或病原等包裹形成自噬體,然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體并最終降解。研究發(fā)現(xiàn)多種信號通路參與了自噬的調(diào)節(jié),其中最為經(jīng)典的上游信號包括ROS、AMPK、ERK、PI3K 和DNA損傷等[12]。在肺癌中,CuE 通過調(diào)節(jié)ROS 的活性激活自噬的發(fā)生[15];而在宮頸癌和乳腺癌中,CuE通過激活A(yù)MPK 并抑制mTOR 的功能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[9]。在膀胱癌中,CuE 所誘導(dǎo)的自噬是否與ROS 及AMPK 相關(guān),目前并無研究。另外,其他信號通路如ERK、PI3K 和DNA 損傷等是否參與了CuE 對自噬的誘導(dǎo),目前并不清楚。后續(xù)工作將對CuE 所誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬的具體機制進(jìn)行研究。

      綜上所述,CuE 在人膀胱癌細(xì)胞T24 中誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生,且誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞的增殖起抑制作用。此研究為將來CuE 用于臨床治療膀胱癌提供了新的實驗資料和理論基礎(chǔ)。

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