周智友，許張柯，張慶華，劉孟熒，黎秋玲，李漢廣

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330045)

化石燃料是目前國(guó)際上的主要能源物質(zhì)，但由于其儲(chǔ)存量的不斷下降及世界各國(guó)對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷增加，尋找可替代化石能源的新型環(huán)保性能源物質(zhì)近年來(lái)成為能源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1-3]。生物丁醇是一種全新的、可再生的綠色生物能源，與其他可代替汽油的燃料(如乙醇)相比，丁醇具有許多優(yōu)勢(shì)，如燃燒值高、疏水性強(qiáng)，被認(rèn)為是最具有潛力的第二代可再生的綠色新型生物燃料[4-5]。

丙酮丁醇發(fā)酵(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，簡(jiǎn)稱(chēng)ABE)的研究至今已有150多年的歷史，在20世紀(jì)80年代以前，發(fā)酵法生產(chǎn)生物丁醇工業(yè)是僅次于生物乙醇的第二大發(fā)酵工業(yè)[6]，然而由于石化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展、原料成本的上升以及丁醇對(duì)細(xì)胞的毒性作用導(dǎo)致生物法獲取丁醇逐漸被化學(xué)合成法所取代。近年來(lái)隨著全球氣候的惡化和能源價(jià)格的不斷攀升，發(fā)展環(huán)境友好型經(jīng)濟(jì)是將來(lái)必然的選擇，因此發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇由于其環(huán)保、可再生等優(yōu)勢(shì)迅速成為生物燃料和生物質(zhì)能源領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[7]。

目前ABE發(fā)酵常用菌種主要包括Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumbeijerinckii、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum和Clostridiumsaccharobutylicum四種菌種[8]。其中在工業(yè)上最為常用的菌株是拜氏梭菌(Clostridiumbeijerainckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)[9]。在A(yíng)BE發(fā)酵產(chǎn)物中溶劑(特別是丁醇)對(duì)生產(chǎn)菌株具有抑制甚至毒害作用[10]。有研究表明，當(dāng)發(fā)酵液中丁醇濃度達(dá)13～14 g/L 時(shí)菌體的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制作用[11]。而產(chǎn)生抑制的結(jié)果必將導(dǎo)致ABE發(fā)酵結(jié)束時(shí)出現(xiàn)低產(chǎn)物濃度與低生產(chǎn)強(qiáng)度現(xiàn)象。因此，篩選出高丁醇耐受性的優(yōu)良菌株是解決此現(xiàn)象的有效方法之一[12]。

為選育出高丁醇耐受性、高丁醇產(chǎn)量菌株，本文采用自行設(shè)計(jì)的“三明治”篩選方法從74份土樣中分離篩選出4株較高丁醇耐受性菌株，并對(duì)其中發(fā)酵性能最好的菌株a914進(jìn)行了16S rDNA鑒定，最后對(duì)該菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行了初步研究，以期提高ABE(主要是丁醇)的生產(chǎn)強(qiáng)度，本論文的研究結(jié)果可為快速、簡(jiǎn)捷地選育出高丁醇耐受性丁醇生產(chǎn)菌株提供較為有益的初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖(工業(yè)級(jí))，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉(分析純)，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；玉米粉、木薯粉(食品級(jí))，市售；刃天青(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丁醇、正丁醇(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉(生化試劑)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧盒、厭氧袋(2.5L)，日本三菱公司；GC7890B型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；高速離心機(jī)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；PHS-3C pH計(jì)、電子天平，德國(guó)Sartirius公司；厭氧培養(yǎng)試管(18 mm×180 mm)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 富集培養(yǎng)基

將集市購(gòu)買(mǎi)的新鮮土豆切成大小為0.2 cm3的土豆塊莖，若不及時(shí)使用則存放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 分離純化培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40.0，可溶性淀粉40.0，酵母浸粉3.0，胰蛋白胨6.0，KH2PO41.0，K2HPO41.0， FeSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，將pH調(diào)至6.0，瓊脂20.0，蒸餾水1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

1.3.3 篩選培養(yǎng)基

在分離純化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0.02 g/L的刃天青及8～10 g/L的異丁醇。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

(1)P2培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉3.0，KH2PO41.0，K2HPO41.0，CaCO33.0，121 ℃熱壓滅菌20 min，無(wú)機(jī)鹽溶液(MgSO4·7H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01)，維生素(對(duì)氨基甲苯0.001、維生素B10.001、生物素0.000 01)，用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。

(2)玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基：取80.0 g的玉米粉加入適量的蒸餾水(約1.3 L)糊化30 min，糊化結(jié)束后用蒸餾水定容至1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

(3)木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基：干的木薯?xiàng)l經(jīng)粉碎并過(guò)30目篩，取80.0 g的木薯粉加入適量的蒸餾水(約1.3 L)糊化20 min，糊化結(jié)束后用蒸餾水定容至1.0 L，121 ℃熱壓滅菌20 min。

1.4 產(chǎn)丙酮丁醇微生物的分離篩選

1.4.1 樣品的采集

樣品為采自距離地表15～25 cm的土壤，每份樣品大約100 g，將樣品裝入無(wú)菌的密封袋中(記錄好采樣時(shí)間、地點(diǎn)等信息)并盡快進(jìn)行分離篩選。

1.4.2 富集培養(yǎng)

樣品采集完成之后利用“三明治”的篩選方法進(jìn)行富集培養(yǎng)[13]，“三明治”的篩選方法：取1～2 g的土樣放入?yún)捬跗恐?，再向厭氧瓶?dāng)中加入12 g/L的異丁醇將樣品和土豆浸沒(méi)，在100 ℃的沸水浴中熱激120 s，冷卻后于37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)至大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象。

1.4.3 可視化的分離篩選

在固體分離純化培養(yǎng)基中加入0.02 g/L的刃天青(氧化還原指示劑)[14]以及8 g/L的異丁醇，并在培養(yǎng)基當(dāng)中加入40 g/L的淀粉，以此為丙酮丁醇篩選平板，以篩選出高丁醇耐受性及具備產(chǎn)淀粉酶能力菌株。

1.4.4 分離純化

將大量產(chǎn)氣并出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象的厭氧瓶挑出，用移液管取1 mL的樣液，將其接入玉米醪液或P2培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，將略有溶劑味并大量產(chǎn)氣且出現(xiàn)醪蓋現(xiàn)象的厭氧管取出，涂布于固體分離純化培養(yǎng)基中，并將平板置于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，將長(zhǎng)出的單菌落接入?yún)捬跖囵B(yǎng)試管中進(jìn)行ABE發(fā)酵。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 總糖的測(cè)定

發(fā)酵培養(yǎng)基初始總糖的濃度利用硫酸-苯酚法進(jìn)行測(cè)定[15-16]。

1.5.2 溶劑的測(cè)定

取發(fā)酵液5 mL在 8 000 r/min條件下離心5 min，然后將1.0 mL上清液和4.0 mL異丁醇溶液(濃度為1.21 g/L)混勻，然后采用氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株a914的分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定是指從遺傳學(xué)的角度利用分子生物學(xué)的方法闡明微生物種群之間的進(jìn)化關(guān)系。GIOVANNONI等[18]首次用PCR產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的16S rDNA定位檢測(cè)細(xì)菌多樣，因此對(duì)未知細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序成為細(xì)菌鑒定的一個(gè)重要依據(jù)。

將分離純化得到的菌株a914送至南昌科暢生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，菌株a914的DNA用Omega細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行提取，用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物27F和1492R擴(kuò)增菌株a914的16S rDNA片段，其16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1所示。

圖1 菌株a914 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic pattern of 16S rDNA PCR product of a914 strain

登入NCBI，將菌株a914的16S rDNA序列與GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST軟件進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Clostridiumbeijerinckiistrain JCM 1390相似性達(dá)99%，選取相似性高的序列并下載，利用Mega5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)1 000次bootstrap重復(fù)驗(yàn)證系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的穩(wěn)定性，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示，再根據(jù)其發(fā)酵特性及生理生化特點(diǎn)，最終將菌株a914確定為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。

圖2 基于菌株a914 16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequence homology of strain a914

2.2 不同碳源對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響

在傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵過(guò)程中，主要以玉米、小麥等糧食作物作為發(fā)酵原料[19-22]，本文為研究不同碳源對(duì)菌株a914發(fā)酵的影響，以4種不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉)作為發(fā)酵原料，其實(shí)試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基與蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基除碳源不同外其他成分完全相同(添加量60 g/L)，木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基與玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基直接糊化而成(添加量80 g/L)，不添加任何其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

表1 不同碳源對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of different carbon sources on acetone butanol and ethanol fermentation

從表1可以看出，菌株a914以葡萄糖為碳源時(shí)丁醇產(chǎn)量達(dá)到5.44 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到8.26 g/L，而以蔗糖為碳源丁醇產(chǎn)量為4.16 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量為5.42 g/L，以葡萄糖為碳源時(shí)丁醇的得率均高于以其他3種碳源時(shí)丁醇的得率。而以木薯粉和玉米粉為碳源時(shí)的丁醇產(chǎn)量分別為3.02 g/L和4.03 g/L，總?cè)軇┓謩e為4.34 g/L和5.89 g/L。當(dāng)分別以玉米粉和木薯粉為碳源時(shí)，玉米粉的丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量高于木薯粉，可能的原因是玉米粉含有較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而木薯粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量比較匱乏。

根據(jù)市場(chǎng)調(diào)查，目前，葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉的價(jià)格為人民幣(3 800～4 500)元/t、(3 500～4 000) 元/t、(950～1 100)元/t、(2 000～2 500)元/t。從本試驗(yàn)可以看出每生產(chǎn)1 t丁醇需要葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉的量為10.98、14.49、26.49、14.92 t，以葡萄糖、蔗糖、木薯粉、玉米粉為培養(yǎng)基時(shí)的原料成本為人民幣(41 729～49 410)元/t、￥50 715～57 960)元/t、(25 165～29 139)元/t、(29 840～37 300)元/t。因此，從原料成本和糧食安全等方面考慮，木薯作為非糧作物成本最低，若能夠提高以木薯粉為原料時(shí)丁醇的產(chǎn)量，木薯粉將是這4種碳源物質(zhì)中最為理想的發(fā)酵原料(本文以下試驗(yàn)均以木薯粉為發(fā)酵原料)。

2.3 不同氮源對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響

氮源主要用于合成含氮目的產(chǎn)物和菌體細(xì)胞，而無(wú)機(jī)氮是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的速效氮源，有機(jī)氮在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中為菌體提供氮元素和必要的生長(zhǎng)因子[23]。最適氮源的加入可以提升菌體的生長(zhǎng)和丁醇的產(chǎn)量，本試驗(yàn)考察了5種不同的氮源(乙酸銨、酵母粉、硝酸銨、硫酸銨、胰蛋白胨)對(duì)菌株a914產(chǎn)丁醇的影響，添加量均為3 g/L，其結(jié)果如圖3所示。

從圖4可以看出，向培養(yǎng)基中加入不同的氮源，其發(fā)酵結(jié)果各不相同，即丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量各不相同，以酵母粉為氮源時(shí)，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量最高，分別達(dá)到6.54和9.65 g/L，與其他氮源相比，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量存在顯著性差異(P<0.05)。而以乙酸銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源時(shí)，總?cè)軇┊a(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)，且丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量都低于以酵母浸粉為氮源的產(chǎn)量，因此從本試驗(yàn)的結(jié)果可知，酵母浸粉可以作為后繼試驗(yàn)最優(yōu)的氮源。

2.4 不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響

過(guò)低的pH值對(duì)菌體的生長(zhǎng)存在抑制作用是因?yàn)槠鋾?huì)影響菌體細(xì)胞表面的電荷分布、細(xì)胞膜的通透性。譚秀花[21]利用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)進(jìn)行丁醇發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH低于4.0時(shí)，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，因此在丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程中預(yù)先在培養(yǎng)基加入適當(dāng)pH調(diào)節(jié)劑可以調(diào)整發(fā)酵液的pH值，避免在發(fā)酵過(guò)程中pH值過(guò)度下降，從而提高丁醇的產(chǎn)量，本文考察了5種不同pH調(diào)節(jié)劑(Na2CO3、NaHCO3、CaCO3、K2HPO4/KH2PO4、NH3·H2O)對(duì)菌株a914產(chǎn)丁醇的影響，添加量均為3.0 g/L，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different pH regulators on acetone butanol and ethanol fermentation

由圖4可以看出，當(dāng)以CaCO3為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到6.73 g/L和9.83 g/L，且與其他pH調(diào)節(jié)劑相比，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量存在顯著性差異(P<0.05)；其次當(dāng)用K2HPO4/KH2PO4時(shí)，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量為6.02 g/L和8.72 g/L，但與NaHCO3為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)。以NH3·H2O為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量為4.32 g/L和6.51 g/L，結(jié)果表明兩者都明顯低于CaCO3為pH調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)量，究其原因可能是以NH3·H2O為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)其初始的pH過(guò)高不利于菌體的生長(zhǎng)，因此從本試驗(yàn)的結(jié)果可知，CaCO3可作為最適pH調(diào)節(jié)劑。

2.5 不同CaCO3濃度對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響

CaCO3是比較常見(jiàn)的pH調(diào)節(jié)劑，當(dāng)其與菌體產(chǎn)生的酸發(fā)生反應(yīng)后不僅為菌體提高Ca2+，同時(shí)能起到恒定pH的作用[24]。為研究不同濃度的CaCO3對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響，依次向木薯粉培養(yǎng)基中加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L的CaCO3，其試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同質(zhì)量濃度碳酸鈣對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different concentrations of calcium carbonate on acetone butanol and ethanol fermentation

從圖5中可以看出，當(dāng)CaCO3質(zhì)量濃度為3.0 g/L，時(shí)丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量為6.73 g/L和9.83 g/L；而當(dāng)CaCO3質(zhì)量濃度為4.0 g/L，時(shí)丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量達(dá)到最大，分別為7.27 g/L和10.32 g/L，與對(duì)照組相比分別提高了310.68%和250.73%。隨著CaCO3添加量的繼續(xù)增加，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量之間無(wú)明顯變化。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)CaCO3添加量為3.0、4.0、5.0、6.0 g/L時(shí)丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量之間差異不顯著(P>0.05)，在丁醇發(fā)酵初期會(huì)大量產(chǎn)生有機(jī)酸(乙酸、丁酸等)，從而導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中pH值快速下降，當(dāng)發(fā)酵液中存在CaCO3時(shí)，可以中和乙酸、丁酸等酸性物質(zhì)，起到緩沖pH的作用，鐘潔[25]在進(jìn)行CaCO3對(duì)丁醇發(fā)酵影響試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)量的CaCO3并不會(huì)對(duì)丁醇的產(chǎn)量造成太大的變化，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。因此從本試驗(yàn)的結(jié)果以及從原料成本考慮，在培養(yǎng)基當(dāng)中添加3.0 g/L的CaCO3最佳。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用“三明治”篩選方法從74份土樣中分離篩選出4株高丁醇耐受性菌株，其中菌株a914發(fā)酵性能最佳，根據(jù)菌株a914的發(fā)酵特性、生理生化特征及分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，最終將菌株a914確定為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。然后對(duì)菌株a914產(chǎn)溶劑性能進(jìn)行了初步研究，具體研究了不同碳源、氮源及pH調(diào)節(jié)劑對(duì)其產(chǎn)溶劑的影響。結(jié)果表明在最優(yōu)的條件下，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到6.73 g/L 和9.83 g/L。本試實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“三明治”的篩選方法是一種快速有效的篩選模式，可為通過(guò)該種方法獲得更多的溶劑耐受性菌株提供有益的參考。