乳及乳制品中常見“活的非可培養(yǎng)態(tài)”食源致病菌研究進展

張竟豐，王 麗，陳 洵，謝 會，曹 瀟，趙力超,*

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.暨南大學 食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632；3.廣州雙螺旋基因技術有限公司，廣東 廣州 510006）

隨著我國經濟發(fā)展水平的增長和居民飲食健康意識的提升，乳及乳制品作為膳食結構中重要的一環(huán)，其消費需求也日益增大。根據國家統(tǒng)計局數據，我國城鎮(zhèn)居民家庭人均鮮奶購買量從1996年的4.6 kg逐年上升到2006年的18.3 kg，自2007年起有所下降，之后一直維持在14 kg左右[1]。然而，我國乳及乳制品的安全問題不容樂觀，其主要集中在抗生素殘留、食品添加劑濫用、微生物污染等方面，其中微生物污染問題是最主要的。國家食品藥品監(jiān)督管理總局關于2017年1ü11月嬰幼兒配方乳粉抽檢情況顯示，不合格項目主要集中在標簽問題和微生物污染，其中共檢出阪崎腸桿菌2 批次。據美國疾病預防控制中心數據[2]，在2011ü2017年5月近6 年間美國共發(fā)生13 起由單核增生李斯特氏菌引起的食物安全事件，其中有8 起與乳制品有關。此外，由乳及乳制品中沙門氏菌[3]、金黃色葡萄球菌[4-5]、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）[6]、大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）[8]、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）[9]等致病菌引起的中毒事件在國內外也屢有報道。乳及乳制品中微生物污染問題成因較為復雜。首先，污染途徑廣是導致其微生物污染的重要原因。引起乳制品微生物污染的環(huán)節(jié)很多[10]，其中原料乳本身攜帶較多的微生物，在擠乳、貯運過程中易造成源頭污染，而且加工過程中添加劑的使用、生產環(huán)境、運輸條件等因素都可能造成微生物的后期污染；其次，乳及乳制品中“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”（viable but nonculturable state，VBNC）致病菌的發(fā)現使得微生物安全問題愈加不容忽視。大量的研究表明，乳及乳制品的生產、加工和貯運條件（如不銹鋼管道運輸、巴氏殺菌等）能夠使各種致病菌產生脅迫適應能力，進入VBNC，而致病菌一旦進入VBNC，無法通過傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法檢測，但仍具有可測量的代謝活性，能夠進行轉錄和翻譯，進而產生毒力和致病性，對公共安全造成嚴重威脅[11-13]。

現行有效的GB 4789.18ü2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳與乳制品檢驗》中常規(guī)平板計數法仍廣泛應用于乳及乳制品中各類病原微生物的檢測，可以檢出大多數活的可培養(yǎng)的食源性致病菌。然而，針對VBNC致病菌的檢測，其在平板上無法培養(yǎng)，但仍具有可測量的代謝活性，在合適的條件下可以快速復蘇為可培養(yǎng)的細胞，產生毒力，從而避開傳統(tǒng)的檢測方法。目前VBNC致病菌的檢測方法報道較多的有：吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計數法、基于DNA分子的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術和環(huán)介導恒溫核酸擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術、基于mRNA分子的反轉錄PCR技術[14-16]。然而，熒光顯微鏡觀察常用于定性分析VBNC致病菌，在定量方面存在隨機誤差大等局限；至于基于DNA分子的檢測技術，死菌DNA的存在使得檢測結果高估了樣品中的活菌水平；基于mRNA分子的檢測技術則存在mRNA提取量少、代謝活躍容易發(fā)生降解等問題，而通過復蘇致病菌再進行檢測的方法也不可行，因為復蘇耗時較長，往往需要幾個月甚至更長的時間。因此，VBNC致病菌檢測往往還需要結合其他的前處理手段，如利用乙錠單疊氮化合物（ethidium monoazide bromide，EMA）或疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）染料，基于細胞的膜完整性對死、活細胞進行區(qū)分檢測[15]；也有報道采用基于細胞酯酶代謝活性的疊氮噻唑橙熒光染料（thiazole orange monoazide，TOMA）[17]，能夠更為精確地區(qū)分死、活細胞；此外，對于基質復雜的待測樣品，有研究采用基于抗原抗體反應的免疫磁珠或者基于對細胞壁組分保留親和力的溶菌酶進行特異性富集[18-19]。目前對于VBNC致病菌的檢測尚無統(tǒng)一的標準，相關檢測體系尚未完善。

綜上所述，乳及乳制品中微生物污染問題不容忽視，尤其食源致病菌VBNC的發(fā)現大大增加了檢測的難度。因此，本文綜述了乳及乳制品中幾種常見VBNC食源致病菌細菌的研究進展，包括致病菌的誘導和復蘇因素、生物學特性及其檢測方法，旨在提高人們對乳及乳制品中食源VBNC細菌研究的重視程度，尤其是關注致病菌VBNC的相關研究，以期為其檢測方法的更新提供參考，也為完善乳及乳制品中常見致病菌的檢測體系提供理論依據。

1 VBNC細菌研究進展

1.1 VBNC細菌研究概述

早在20世紀50年代末，海洋微生物學領域的工作者就報道了由顯微鏡直接計數法和平板計數法測得的細菌數量之間存在的顯著性差異[20]。盡管存在細胞聚集現象和非生物顆粒的干擾，但這項研究也表明了基于細菌可培養(yǎng)性的平板計數法可能低估了樣本中活細胞數量。1982年，Xu Haishu等[21]首次正式報道了大腸桿菌和霍亂弧菌存在VBNC這一現象，即存在“不可恢復”但仍保持活性的狀態(tài)。到目前為止，研究人員已經確認了自然界有85 種細菌能夠進入VBNC，其中包括18 種非致病菌和67 種致病菌。這18 種非致病菌普遍在發(fā)酵飲料中被發(fā)現，而另外67 種致病菌中目前已知有16 種對人類健康無害，但能感染其他生物體，如植物[22]。關于細菌VBNC的定義，目前主流的觀點認為細菌受環(huán)境脅迫后，逐漸喪失在常規(guī)培養(yǎng)基上的“可培養(yǎng)性”，但仍保持活性的狀態(tài)，即細菌的VBNC[23-24]。細菌VBNC的研究對于食品安全包括乳制品微生物污染問題具有重要意義。首先，VBNC可以看作是細菌適應環(huán)境脅迫的一種普遍生存策略[25]，其中被報道能進入VBNC的細菌，囊括34 個屬，涵蓋擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門。自然界中各種脅迫因素無處不在，如低溫、寡營養(yǎng)、紫外線、化學物質等均可能導致細菌進入VBNC狀態(tài)[26]，且細菌在環(huán)境脅迫下具有自適應能力，能夠調整或改變代謝途徑，進入VBNC，從而避免特定脅迫因素引起的代謝或結構破壞[27]。其次，雖然VBNC細菌通常無法引發(fā)疾病，但致病菌的毒性可以在復蘇后恢復，進而感染人群、引起疾病[28-29]。

1.2 VBNC細菌的生理學特性

自然界中，與VBNC相似的細菌存活狀態(tài)包括休眠、芽孢等。目前，VBNC僅存在于非芽孢細菌的觀點被廣泛接受，而休眠態(tài)與VBNC的關系尚存在爭議。Mukamolova等[30]認為VBNC與休眠狀態(tài)的區(qū)別就在于VBNC細胞表現出可測量的代謝活性，而在休眠細胞中無法檢測到。還有學者認為VBNC是休眠態(tài)細胞的一種形式，因為VBNC細胞與休眠態(tài)細胞一樣，都具有不可培養(yǎng)的特性，且能夠在宿主體內復蘇[31]。表1比較了幾種常見細胞狀態(tài)下的代謝活性、復蘇能力、細胞完整性和平板培養(yǎng)能力。

表1 不同狀態(tài)下細胞的部分生物學特性比較Table1 Comparison of biological characteristics of difference cells under different states

大多數進入VBNC的細菌的體積、形態(tài)等都會發(fā)生變化。革蘭氏陰性菌在進入VBNC狀態(tài)后，形態(tài)一般由桿狀變?yōu)榍驙罨蚯驐U狀，體積變小，如大腸桿菌、副溶血性弧菌等[32-33]。但目前也有報道VBNC的大腸桿菌仍為短棒狀[34]。而革蘭氏陽性菌進入VBNC后其形態(tài)變化較為復雜，如空腸彎曲桿菌在低溫環(huán)境下會呈螺旋狀或者保持原狀不變 。此外，復蘇后的VBNC大多與正常細菌形態(tài)類似[35]。

目前科學界已廣泛認同VBNC致病菌對公眾健康具有潛在威脅，但關于VBNC狀態(tài)下致病菌的毒力及其致病性仍存在爭議。如牛乳中常見的腸出血性大腸桿菌O157:H7是重要的食源性致病菌之一，主要通過產生志賀毒素、溶血素和黏附素在腸道上皮細胞表面形成擦拭性損傷，引起腸炎等疾病，損害人體健康。趙鳳[36]的研究表明，VBNC大腸桿菌O157:H7仍然具備在宿主細胞上黏附的能力及引起擦試性損傷?？漳c彎曲桿菌的毒力也通過類似的途徑表現，Patrone等[37]通過檢測VBNC空腸彎曲桿菌CadF蛋白的表達，證實其仍具備在腸道黏膜上的黏附能力。但也有研究表明，VBNC細菌不具有致病性，只有在其復蘇為正常細胞時，才能表現出毒力和致病性[26]。無論如何，VBNC致病菌作為微生物污染中重要的組成部分，在食品安全方面存在重大的隱患。

2 乳及乳制品中VBNC致病菌的誘導和復蘇

乳及乳制品中包含豐富的營養(yǎng)元素，可以充分滿足人體對于各類營養(yǎng)物質的需求，與此同時也成為許多致病菌理想的培養(yǎng)基。乳制品中部分產品的酸性條件、巴氏殺菌工藝等環(huán)境條件能夠抑制致病菌增殖，但目前有越來越多的證據表明，乳及乳制品中的致病菌可以被誘導進入VBNC，能夠保留毒力并在合適的條件下復蘇。Gunasekera等[11]的研究表明，巴氏殺菌后的鮮乳中有明顯的細胞亞群處于VNBC，大量的細胞由于熱處理而不能形成菌落，但仍有可測量的代謝活性，能夠轉錄和翻譯基因，具有致病性。Gahan等[38]研究了單核增生李斯特氏菌在普通奶酪、酸奶、低脂奶酪和全脂奶酪中的酸適應能力，其中全脂奶酪和低脂奶酪中的單核增生李斯特氏菌突變體ATM56能夠在70 d后恢復活性，該研究結果也表明單核增生李斯特氏菌在乳制品中存在VBNC，且其誘導和復蘇因素也值得進一步研究。

表2 乳及乳制品中幾種常見的VBNC食源致病菌誘導因素和復蘇方法Table2 Induction and resuscitation of common VBNC pathogens in milk and dairy products

在乳及乳制品加工、貯藏和運輸的過程中，存在著各種各樣的脅迫因素，如高溫、低溫、寡營養(yǎng)、極端pH值等。這些因素均可能導致其中的致病菌進入VBNC，增大檢測難度；但同時，乳及乳制品中的VBNC致病菌通常只有在復蘇后才能表現出致病性，因此研究其復蘇因素同樣具有重要意義。表2總結了乳及乳制品中幾種常見的VBNC食源致病菌誘導因素和復蘇方法。

2.1 VBNC致病菌誘導

在乳及乳制品的生產、加工、貯藏過程中，有許多脅迫因素均可能導致致病菌進入VBNC。Suliantari等[12]發(fā)現，在模擬奶粉生產加工的條件（1/10 TSA、不銹鋼管道輸送）下，阪崎腸桿菌被誘導進入了VBNC。研究者用乳糖誘導型綠色熒光蛋白基因（gfp）標記大腸桿菌，并在63.5 ℃下加熱牛乳30 min，實驗發(fā)現基于染料排除的活菌計數法測得的活細胞數顯著高于基于細菌可培養(yǎng)性的平板計數法測得的數量，結果表明巴氏殺菌后的牛乳中大腸桿菌處于VBNC[54]。姜琛璐等[57]研究了阪崎腸桿菌在奶粉沖調溫度下的存活率，結果表明部分阪崎腸桿菌菌株處于65 ℃以下的沖調溫度環(huán)境時能夠保持一定的活性，可能進入VBNC。

此外，乳品加工過程中經常會接觸到一些化學脅迫因素，如使用添加劑以延長其貨架期。然而添加劑作為一種脅迫因素，同時也可能誘導細菌進入VBNC，從而避開傳統(tǒng)的檢測方法，對公共健康造成威脅。

劉德欣等[35]采用不同溫度和山梨酸鉀濃度誘導金黃色葡萄球菌，使其進入了VBNC。田娟等[58]采用食品防腐劑誘導副溶血性弧菌進入了VBNC。

2.2 VBNC致病菌復蘇

細菌經環(huán)境脅迫進入VBNC狀態(tài)后，喪失了在平板上的生長繁殖能力，但仍具有可測量的代謝活性，在適宜的條件下可以復蘇為正常的可培養(yǎng)細胞，這個過程是VBNC態(tài)致病菌可能開始大量繁殖并存在的基本條件。VBNC細菌的復蘇是一個復雜的過程，其復蘇機制尚未明確。目前研究較多的是“探索因子”和“群體感應”假說，其中隨機出現的探索因子和群體感應中的活化細胞菌有助于解釋細菌VBNC細菌的復蘇過程，兩者具有一定的內在聯系[59-60]。目前已知的復蘇因素包括升溫、共培養(yǎng)、添加營養(yǎng)物（如酵母浸膏）、添加化學物質（如丙酮酸鹽、Tween-80）、添加復蘇因子Rpf等。Ayrapetyan等[59]的研究表明，群體感應的自體誘導物AI-2可以誘導VBNC創(chuàng)傷弧菌復蘇，而不能產生AI-2突變體的VBNC細胞在培養(yǎng)物中補充外源AI-2也能復蘇。Morishige等[61]在VBNC沙門氏菌中添加丙酮酸鈉后，使得細胞復蘇，同時相關研究也證明了丙酮酸鹽在復蘇過程中是觸發(fā)大分子合成（如DNA和蛋白質）的關鍵分子之一。VBNC空腸彎曲桿菌與宿主細胞共培養(yǎng)一段時間后，同樣能夠復蘇形成菌落[62]。因此，乳及乳制品中致病菌進入VBNC狀態(tài)后，在加工、貯運條件中仍然可能復蘇為正常細胞，產生毒力。

3 乳及乳制品中幾種常見VBNC致病菌的檢測方法及應用前景

合理有效的細菌檢測方法對于乳及乳制品中食源致病菌檢測具有現實意義，對于那些只能應用非傳統(tǒng)檢測方法的VBNC細菌而言，正確的選擇適合的檢驗手段更是研究該類微生物的必要工作。表3列舉了多種檢驗VBNC致病細菌的手段，主要包括光學方法、免疫學方法、分子生物學方法和生物傳感器技術。

表3 乳及乳制品中幾種常見VBNC致病菌檢測方法Table3 Detection methods for common VBNC pathogenic bacteria in milk and dairy products

過去科學家常用熒光染色方法來觀察VBNC細胞，如活菌直接計數法、活/死菌試劑盒法，此類方法常用于定性判斷。目前應用分子生物學和傳感器方法對VBNC細胞進行定性、定量分析的報道越來越多。傳統(tǒng)PCR和基于mRNA的實時熒光逆轉錄PCR等方法敏感、快速，在實驗室檢測中應用最為廣泛。最新的生物傳感器結合了分子檢測與傳感系統(tǒng)，能夠產生可測定的光電信號，與傳統(tǒng)方法相比具有檢測迅速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，在VBNC致病菌的檢測方面具有很好的應用前景。Labib等[76]開發(fā)了一種基于核酸適配體的傳感器檢測方法，用于檢測VBNC沙門氏菌，能夠在30 mL的樣品中檢測到30 個活細胞。Said等[75]開發(fā)了基于噬菌體的傳染率的生物傳感器用以檢VBNC細菌。Liu Haibin等[73]開發(fā)了一種新的以表面增強拉曼散射為基礎的橫向流帶狀生物傳感器，結合RPA用于同時檢測單核增生李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌，兩種致病菌的檢測限分別為27 CFU/mL和19 CFU/mL。

在乳制品檢測中，傳統(tǒng)的國標檢測方法（如分離培養(yǎng)、生化鑒定）無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進行檢測，存在特異性差、操作繁瑣、耗時等缺點，無法實現及時有效的檢測。對于乳制品中VBNC態(tài)的致病菌，光學方法和免疫學方法都容易出現漏檢，且免疫學方法中酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術影響因素較多，結構類似物也會引起不同程度的交叉反應，容易出現假陽性的結果。而PCR方法與傳感器方法成本較高，不適于大規(guī)模推廣。LAMP技術、RPA技術在檢測VBNC菌方面具有較好的特異性和靈敏性，而且只需要簡單恒溫設備就能進行LAMP反應，成本較低。由于死菌和食品基質中蛋白質、脂肪等的干擾，單一的LAMP和RPA檢測方法仍存在缺陷，目前的研究通常將活性染色、免疫磁珠富集、傳感器技術與分子生物學方法結合，這不僅提供了新的檢測思路，而且可以有效避免單一方法的不足，進而提高對食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測的準確性。

4 結 語

乳及乳制品中VBNC細菌的污染問題不容忽視，容易成為逃避檢測的“隱性傳染源”，對食品安全構成潛在威脅。本文通過綜述乳及乳制品中幾種常見VBNC食源致病菌的誘導和復蘇因素、生物學特性及其檢測方法，為乳及乳制品微生物安全領域提供了新的研究對象及思路。同時由于乳制品中高脂肪、高蛋白的食品基質干擾以及細菌VBNC的特殊性，對現有的快速檢測技術也提出了更高要求，通過對活性染色、免疫富集、生物傳感器等技術整合，有利于構建新型微生物快速高通量檢測技術平臺，實現對食品中痕量食源致病細菌的快速定量檢測，進一步保障乳及乳制品的質量安全。