中國野生藍(lán)莓對非酒精性脂肪肝的保肝效果

丁歡歡，景志行，許劍鋒,*，劉海泉，趙 勇,3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 201306）

藍(lán)莓也稱越橘，是多年生常綠灌木，屬于杜鵑花科越橘屬，是第3代水果的典型代表之一[1]，藍(lán)莓果實中除含有常見的糖、酸和VC外，還富含VE、VA、VB、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、蛋白質(zhì)、花青苷、食用纖維以及豐富的K、Fe[2]。隨著人們收入的提升和保健意識的增強(qiáng)，藍(lán)莓作為一種重要保健水果，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。因為野生藍(lán)莓生長在自然環(huán)境中，相對于人工種植的品種口感較差，目前對于中國野生藍(lán)莓的報道和研究很少，主要集中在對野生藍(lán)莓的栽培方面，鮮有對中國野生藍(lán)莓的系統(tǒng)性研究[3-4]。然而，中國野生藍(lán)莓的花青素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的含量很高，花青素含量高達(dá)3.3～33.8 mg/kg，約是人工栽培品種的5～20 倍[5]。目前對藍(lán)莓花青素活性的研究很多。研究表明，藍(lán)莓花青素對黑色素瘤細(xì)胞和口腔癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用[6-7]。另外，藍(lán)莓花青素還具有抗氧化作用，其抗氧化活性比VE高50 倍，比VC高200 倍，且對人體的生物有效性是100%[8-10]。此外，藍(lán)莓花青素還具有保肝、保護(hù)視力等作用[11-16]。

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指無酗酒經(jīng)歷而出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性的肝臟疾病[17]，是臨床常見的疾病，主要是由肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積引起的[18-19]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和因此而導(dǎo)致的肝硬化[20-21]。病理性的氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，進(jìn)一步誘發(fā)肝細(xì)胞過度凋亡是NAFLD產(chǎn)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[22-23]。

近年來，NAFLD發(fā)病率持續(xù)增長，成為最常見的肝臟疾病之一，在正常人群中發(fā)病率為20%～30%，而在肥胖人群或糖尿病患者中其發(fā)病率可高達(dá)70%～90%[24]，已經(jīng)成為危害人類健康的三大肝病之一[25]。

本實驗在中國野生藍(lán)莓總花青素高效提取的基礎(chǔ)上[26]，以小鼠非酒精性脂肪肝模型體系為研究對象，通過檢測小鼠肝功能、肝臟病理損傷程度和氧化/抗氧化系統(tǒng)水平，評價藍(lán)莓勻漿和藍(lán)莓總花青素的保肝效果，為中國野生藍(lán)莓作為功能性食品和藥品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明小鼠160 只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，6 周齡，SPF級，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（滬）2012-0002）。

1.2 儀器與設(shè)備

B-220恒溫水浴鍋 河南鄭州南北儀器有限公司；202-2AB型電熱恒溫干燥箱 濟(jì)南海波實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中國野生藍(lán)莓中總花青素的提取

將藍(lán)莓打成勻漿后冷凍干燥成粉末狀，取150 g粉末與1.8 L甲醇-水-甲酸（體積比85∶15∶0.5）溶液混勻，漩渦振蕩30 s后超聲5 min，使樣品重新混勻且加速提取。靜置5 min后，再次漩渦振蕩30 s，靜置5 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。殘渣中加入1.8 L甲醇-水-甲酸（體積比85∶15∶0.5）溶液繼續(xù)提取，重復(fù)3～5 次，直至殘渣顏色不再變化，將所得上清液混合，4 ℃、8 000 r/min恒溫冷凍離心5 min除去殘渣，真空蒸發(fā)去除甲醇。

1.3.2 中國野生藍(lán)莓總花青素的純化

將1.3.1節(jié)中所得提取液經(jīng)XAD-7HP大孔樹脂柱純化，體積比為1∶3。其中大孔樹脂柱采用濕法裝柱，取95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇洗脫3 個柱體積后，用蒸餾水洗至無醇味。取3 倍體積0.5%甲酸溶液洗脫柱子，上樣，充分吸附后用0.5%甲酸酸化的醇洗脫，回收得到總花青素，去除酸化甲醇，用乙酸乙酯充分萃取3 次，最后將水層進(jìn)行真空蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，收集得到總花青素，冷凍干燥得到凍干粉，并置于－20 ℃保存。

1.3.3 動物模型的建立與干預(yù)實驗分組

在實驗室進(jìn)行一周適應(yīng)性飼喂后，將160 只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、脂肪肝模型組、不同劑量藍(lán)莓勻漿組、總花青素組，每組20 只。除空白對照組外，其余各組小鼠用TP23400 60%小鼠用高脂肥胖模型飼料規(guī)律性飼養(yǎng)3 周。高脂飼料可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)高脂血癥以及肝臟脂代謝紊亂，使肝內(nèi)TG堆積，引起肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟結(jié)構(gòu)和功能受損。高脂模型建立完成后再進(jìn)行干預(yù)治療，治療介入6 周。實驗設(shè)藍(lán)莓勻漿低（10 g/（kggd））、中（20 g/（kggd））、高（40 g/（kggd））劑量組（以體質(zhì)量計，下同）及藍(lán)莓總花青素低（0.006 g/（kggd））、中（0.012 g/（kggd））、高（0.024 g/（kggd））劑量組；空白對照組將前期未經(jīng)高脂飼料飼養(yǎng)的小鼠灌胃同體積生理鹽水（20 g/（kggd））；脂肪肝模型組將前期經(jīng)高脂飼料飼養(yǎng)的小鼠灌胃同體積生理鹽水（20 g/（kggd））。每日灌胃1 次，共6 周，灌胃期間自由取食和飲水。

另外，過去數(shù)月，股價下跌使A股市場的高質(zhì)押風(fēng)險浮出水面。今年榜單的前百位富豪中，有五位富豪控股上市公司股份已被質(zhì)押過半，其中排名第74位的盧志強(qiáng)所持有的泛?？毓晒善币讶抠|(zhì)押。

1.3.4 實驗樣本收集及處理

實驗結(jié)束前12 h，各組小鼠禁食但不禁水，心臟取血l mL左右，置于EP管中靜置15 min，然后4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，－80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠處死后解剖分離肝臟，隨機(jī)選取并于10%中性甲醛溶液中保存?zhèn)溆?，將其余肝組織冷凍后置于EP管中，－80 ℃保存，用于其余各項生化指標(biāo)檢測。

1.3.5 肝組織的病理切片觀察

將解剖取得的小鼠肝組織用10%中性甲醛溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋，穩(wěn)定后進(jìn)行切片，厚度5 μm，隨機(jī)間隔10 張取一切片，蘇木精-伊紅染色之后在顯微鏡下進(jìn)行肝組織病理形態(tài)的觀察[27]。

1.3.6 血清生化指標(biāo)的檢測

1.3.6.1 血清轉(zhuǎn)氨酶活力的測定

AST和ALT活力是臨床用于診斷反映肝細(xì)胞損傷的兩個最敏感的指標(biāo)[28]。其中ALT活力異常升高表明肝細(xì)胞損傷，AST活力異常升高則表示線粒體損傷，兩種指標(biāo)能夠聯(lián)合反映肝細(xì)胞受損程度。AST活力的檢測采用AEROSET全自動生化分析儀。ALT活力的測定采用賴氏法。其原理是ALT在37 ℃、pH 7.4的條件下和α-酮戊二酸、丙氨酸相互結(jié)合，最終生成谷氨酸以及丙酮酸，0.5 h后加入脫氧核糖核蛋白鹽酸溶液進(jìn)行終止，繼而使2,4-二硝基苯肼與丙酮酸結(jié)構(gòu)上的羰基相結(jié)合，生成紅棕色的丙酮酸苯腙，后者在505 nm波長處有最強(qiáng)吸光度，由此計算ALT活力。測定步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6.2 血清脂質(zhì)代謝水平的測定

血清脂質(zhì)代謝水平的測定包括TC、TG、HDL-C濃度和LDL-C濃度4 個生物活性指標(biāo)[29]。其中，采用酶比色法測定TC、TG濃度，通過磷鎢酸-鎂沉淀法測定HDL-C與LDL-C濃度，測定步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6.3 肝組織勻漿液中氧化損傷指標(biāo)的測定

以4 ℃生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，對肝臟組織以質(zhì)量比1∶9進(jìn)行勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃穩(wěn)定保存，嚴(yán)格按照試劑盒說明書及文獻(xiàn)[30]檢測小鼠肝勻漿樣本的T-AOC、GSH含量和MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并對各組數(shù)據(jù)的組間差異性進(jìn)行比較，將3 個不同劑量實驗組分別與對照組進(jìn)行獨立樣本的t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。所測數(shù)據(jù)均以fs表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝組織病理學(xué)變化結(jié)果

圖1 小鼠肝組織病理學(xué)變化Fig.1 Pathological changes of liver tissues from mice

由圖1可知，和空白對照組（圖1A）相比，脂肪肝模型組（圖1B）中可見肝臟脂肪變性情況嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量小型的脂肪空泡，情況較為嚴(yán)重者融合成較大的脂肪空泡，并將質(zhì)核擠向一邊；隨著藍(lán)莓勻漿劑量的增大，小鼠肝臟脂肪變性程度也隨之降低（圖1C～E）；和藍(lán)莓勻漿相比，藍(lán)莓花青素的保肝效果更為明顯（圖1F～H），可以觀察到藍(lán)莓總花青素中、高劑量組小鼠肝臟脂肪變性程度明顯減輕。

2.2 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力分析

圖2 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的活力Fig.2 Effect of blueberry on serum transaminase activity in mice

由圖2可知，與空白對照組相比，高脂飼料使AST和ALT活力顯著上升（P＜0.05）；與脂肪肝模型組相比，藍(lán)莓勻漿中劑量組對AST和ALT的活力有顯著的抑制作用（P＜0.05），而與其相比，低、高劑量的藍(lán)莓勻漿反而提高了兩種轉(zhuǎn)氨酶的活力；與脂肪肝模型組相比，中、高劑量藍(lán)莓總花青素均顯著降低了AST和ALT的活力（P＜0.05），且效果較藍(lán)莓勻漿中劑量組更好。

2.3 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂作用分析

圖3 小鼠血漿脂質(zhì)水平Fig.3 Effect of blueberry on plasma lipid levels in mice

由圖3可知，與空白對照組相比，脂肪肝模型組小鼠出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂情況，TC、TG和LDL-C濃度顯著高于正常值（P＜0.05），HDL-C濃度顯著低于正常值（P＜0.05）。經(jīng)過6 周的治療介入，與脂肪肝模型組相比，藍(lán)莓勻漿和藍(lán)莓總花青素各劑量組TC、TG濃度顯著下降（P＜0.05），但均不能使HDL-C濃度有效提高（P＞0.05）；藍(lán)莓總花青素中、高劑量組降低LDL-C濃度作用最明顯（P＜0.05）。

2.4 對肝組織氧化損傷修復(fù)作用分析

圖4 藍(lán)莓對小鼠肝組織氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of blueberry on oxidative liver injury in mice

由圖4可知，與空白對照組相比，脂肪肝模型組小鼠肝組織的T-AOC和GSH含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；和脂肪肝模型組相比，經(jīng)過6 周的治療介入，藍(lán)莓勻漿中、高劑量組和藍(lán)莓總花青素中、高劑量組小鼠肝組織T-AOC和GSH含量均明顯升高，MDA含量明顯降低，其中藍(lán)莓總花青素高劑量組基本達(dá)到了空白對照組水平；藍(lán)莓勻漿低劑量組和藍(lán)莓總花青素低劑量組小鼠3?種氧化損傷指標(biāo)的改變均較小。

3 結(jié) 論

目前使用最多的藍(lán)莓花青素的提取方式是添加HCl溶液到低沸點的醇溶液中，但有研究證明HCl溶液的加入可能會引起總花青素的分解。本實驗借鑒Prior等[26]的方法，采用甲醇替代乙醇進(jìn)行提取，取得了較好的效果，并且添加甲酸代替HCl溶液進(jìn)行提取也不易導(dǎo)致花青素的分解。

本研究顯示，中國野生藍(lán)莓勻漿在20 g/（kggd）的劑量下，對非酒精性脂肪肝小鼠體現(xiàn)出很好的保肝效果，降低了小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的活力，對脂質(zhì)代謝也有一定的調(diào)控效果，在小鼠肝組織氧化損傷各項指標(biāo)上也能夠有效減輕高脂飼料帶來的損傷。但同時，10 g/（kggd）的藍(lán)莓勻漿并沒有顯著的保肝效果，40 g/（kggd）的藍(lán)莓勻漿劑量反而沒有比20 g/（kggd）起到更好的保肝效果。

中國野生藍(lán)莓總花青素0.012、0.024 g/（kggd）劑量組在小鼠各項指標(biāo)中均顯示出很好的保肝效果，但0.006 g/（kggd）藍(lán)莓總花青素組各指標(biāo)和病理學(xué)切片都沒有顯示出很好的保肝作用，即不具有良好的保肝作用。但同時本研究也發(fā)現(xiàn)，各項指標(biāo)并沒有隨藍(lán)莓總花青素劑量增長而呈現(xiàn)出相應(yīng)的梯度變化，因此，推測中國野生藍(lán)莓總花青素存在一個有效保肝劑量范圍。