混料設(shè)計(jì)優(yōu)化孜然、花椒、芥子混合精油對(duì)4 種果蔬采后真菌的抑菌效果

熊李波，秦 強(qiáng)，胡培芳，郭 佳，夏泆斌，張 忠,*，畢 陽(yáng),*，葛向珍

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省蘭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督管理中心，甘肅 蘭州 730030）

植物精油是從草本植物的花、苞、葉、枝、根、樹(shù)皮、果實(shí)、種子和樹(shù)脂等中，以蒸餾或壓榨等方式提煉出來(lái)的特有的芳香味油狀液體[1-3]。研究報(bào)道植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能夠抑殺細(xì)菌、真菌和病毒[4-6]。精油作為天然提取物，是新興的具有良好抑菌效果的抑菌劑[7-8]，利用單一精油組合的協(xié)同性和加和性是提高精油抗菌功效的新方法[9]。近年來(lái)由于化學(xué)合成防腐劑的使用對(duì)消費(fèi)者的健康和環(huán)境產(chǎn)生不利的影響；同時(shí)細(xì)菌、真菌等食源性微生物的耐藥性問(wèn)題也已引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注[10-11]。因此，開(kāi)發(fā)研究天然混合精油抑菌藥物越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注。

采后病害是導(dǎo)致果蔬供應(yīng)鏈中經(jīng)濟(jì)損失的主要因素之一，可能發(fā)生在供應(yīng)鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)，如采收、分級(jí)、包裝、運(yùn)輸、貯藏等，同時(shí)采后果蔬侵染病害中的一些真菌病原物能夠產(chǎn)生毒素，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[12]。精油作為芳香植物體中提取的揮發(fā)性混合化合物，具有抑菌活性和抗氧化性，被認(rèn)為是天然環(huán)保的控制食源性致病微生物的抗菌藥物替代品[13-14]。研究表明植物精油的主要成分為萜烯、醇、酯、醛、酚類(lèi)和一些含烴類(lèi)化合物[15]，不同精油之間不同類(lèi)型的化合物含量存在差異，且不同類(lèi)型的化合物抑菌活性不同，從而導(dǎo)致抑菌效果差異顯著；混合植物精油由于化合物之間的組合相互作用，對(duì)目標(biāo)菌株具有多靶點(diǎn)抑菌作用[16]。據(jù)報(bào)道，食品需要高濃度精油才能達(dá)到較佳的抑菌效果[9,17]，但這些高濃度的精油則會(huì)改變食物感官特性或者產(chǎn)生毒性[1,9,18]，為了減少精油的有效劑量并提高其抑菌效果，研究表明可以將不同精油進(jìn)行組合[19-20]；因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定試用菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）和菌落直徑，利用單純型增強(qiáng)質(zhì)心混料設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型設(shè)計(jì)3 種植物精油混合作用下對(duì)4 種果蔬真菌的最優(yōu)混料比例，以實(shí)現(xiàn)在較低精油用量下較優(yōu)的抑菌效果，為天然抑菌劑減量使用提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆孜然采購(gòu)于甘肅敦煌種業(yè)有限公司；大紅袍花椒購(gòu)于甘肅省天水市張家川回族自治縣；黃芥子采購(gòu)于安徽亳州市中藥材市場(chǎng)。

葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、Tween-80、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 北京Solarbio公司。

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、互隔交鏈孢（Alternaria alternata）、硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）分離自發(fā)病果實(shí)，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)箱、DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FS1C生物顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機(jī) 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；GC6890N/MS5973N型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精油的制備及GC-MS分析

采用水蒸氣蒸餾法制備精油，收集精油后用無(wú)水硫酸鈉干燥，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參照李偉等[21]的方法，GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 mh250 μm，0.25 μm）。柱溫：65～250 ℃程序升溫。初始溫度為65 ℃，保持5 min；以8 ℃/min的速率升至180 ℃，保持2 min；再以20 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min。載氣為高純氮?dú)?，柱流量?.0 mL/min，以分流方式進(jìn)樣，分流比為20∶1，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。質(zhì)譜條件：采用電子電離方式，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑采集方式Scan，容劑遲延時(shí)間4.2 min。間隔時(shí)間0.3 s，開(kāi)始采集時(shí)m/z 50，結(jié)束時(shí)m/z 550，進(jìn)樣量0.2 μL。采用NIST02.1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索、分析。

1.3.2 植物精油抑菌效力測(cè)定

1.3.2.1 培養(yǎng)基的制備

分別配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基待用（自然pH值）。

1.3.2.2 孢子懸浮液的配制

分別取25 ℃下培養(yǎng)7 d的4 種真菌（粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）培養(yǎng)皿，加入含有體積分?jǐn)?shù)為0.05% Tween-80的無(wú)菌水約10 mL，用玻璃涂布棒刮下平板上的真菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL的三角瓶中，4 層紗布過(guò)濾，充分振蕩后，濾液用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，稀釋至濃度為1h106～3h106個(gè)/mL備用。

1.3.2.3 菌落直徑的測(cè)定

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性，參考Cakir等[22]的方法并略作修改，使用直徑9 cm的培養(yǎng)皿，每皿加入20 mL的PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用無(wú)菌金屬打孔器（d＝8 mm）在平板中央處打一小孔，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，再用移液槍吸取一滴未凝固的PDA培養(yǎng)基溶液封底，待到孔內(nèi)瓊脂凝固后，加入5 μL菌懸液至完全吸收后將平板倒置，用無(wú)菌鑷子取一濾紙片（d＝25 mm）置于皿蓋中央，在濾紙上加入100 μL無(wú)菌水，再加入3 μL精油，以不添加精油的設(shè)為空白對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，然后在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育72 h。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，結(jié)果取其平均值，菌落直徑越大則說(shuō)明該種精油對(duì)此真菌的抑菌效果越差，反之則抑菌效果越好。

1.3.2.4 MIC和MBC測(cè)定

通過(guò)采用微量稀釋法測(cè)定每種菌株的MIC和MBC，參考Haba[23]和Tian Jun[24]等的方法并略作修改。使用24 微孔板培養(yǎng)，分別配制所需濃度，每孔板分別依次加入1.9 mL含Tween-80（體積分?jǐn)?shù)0.01%）和精油的PDB培養(yǎng)基、80 μL菌懸液，最后加入20 μL指示劑MTT（0.5 mg/mL）溶液，并略微振動(dòng)10 min至混勻，然后將微孔板置于28 ℃下恒溫孵育24～28 h。在孵育期后，觀察孔板中指示劑（MTT）溶液顏色變化情況，并評(píng)估菌株生長(zhǎng)活性，將MIC視為最低精油抑菌濃度，測(cè)定并記錄MIC，為防止MTT指示劑顏色變化，繼續(xù)孵育至72 h，測(cè)定MBC，MBC對(duì)應(yīng)于在28 ℃孵育72 h后不產(chǎn)生培養(yǎng)物的精油為最低殺菌濃度，實(shí)驗(yàn)每次重復(fù)3 次進(jìn)行。

1.3.2.5 混料設(shè)計(jì)

為了評(píng)估精油的一元、二元、三元混合抑菌效果，使用單純型增強(qiáng)質(zhì)心混料設(shè)計(jì)[25]，每種精油所占混合物的百分比范圍為0～1，對(duì)設(shè)計(jì)空間比例無(wú)限制。

混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要點(diǎn)是三角形的3 個(gè)頂點(diǎn)（1、2、3）（分別對(duì)應(yīng)于3 種植物精油）、三邊中點(diǎn)（4、5、6）、中心點(diǎn)（重心7）和3 個(gè)增強(qiáng)點(diǎn)（8、9、10）由三元組合的二進(jìn)制設(shè)計(jì)組成（圖1）；每種真菌的完整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括21 個(gè)實(shí)驗(yàn)（表1），其中包含3 個(gè)中心點(diǎn)的增強(qiáng)設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)以隨機(jī)順序進(jìn)行。

圖1 三元混合物的單純型增強(qiáng)質(zhì)心混料設(shè)計(jì)圖Fig.1 Schematic diagram of enhanced simple-centroid mixture design

表1 不同菌株MIC測(cè)定的混料設(shè)計(jì)矩陣和實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值Table1 Mixture design matrix with experimental MICs against different strains

因變量是對(duì)4 種果蔬真菌粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌的抑菌效果，通過(guò)1.3.2.4節(jié)所述的微量稀釋法測(cè)得MIC，然后將數(shù)據(jù)擬合并應(yīng)用最小二乘回歸的特殊三次多項(xiàng)式模型中，以預(yù)測(cè)方程式中的未知系數(shù)。

式中：Y是響應(yīng)值；bx是單組分響應(yīng)值效應(yīng)大??；bxy是雙組分響應(yīng)值效應(yīng)的大小；bxyz是3 個(gè)組分對(duì)響應(yīng)值交互效應(yīng)的大?。籜x表示混合物中組分的比例。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及響應(yīng)面圖采用Minitab 17軟件處理，用Duncan’s法進(jìn)行多重顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，菌落直徑柱狀圖采用Origin 9.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油的提取率及組分分析

從孜然、花椒、芥子原料中提取的精油含量分別為2.29、2.52、1.12 mL/g。

通過(guò)GC-MS分析，孜然精油檢測(cè)48 種化合物，占總量的99.93%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），主要成分為枯茗醛（21.89%）、β-蒎烯（20.49%）、γ-萜品烯（18.37%）、4-丙-2-環(huán)己基-1,4-二烯-1-甲醛（10.98%）、p-傘花烴（8.89%）、4-丙-2-環(huán)己基-3-烯-1-甲醛（7.95%）；據(jù)Teneva等[26]報(bào)道孜然精油中的25 種化合物主要包括枯茗醛（30.834%）、3-蒈烯-10-醛（17.223%）、β-蒎烯（14.837%）、γ-萜品烯（11.928%）、2-蒈烯-10-醛（8.228%）和p-傘花烴（6.429%）；同時(shí)李大強(qiáng)[27]報(bào)道中國(guó)新疆和甘肅的孜然精油主要由萜類(lèi)化合物組成，包括萜醛、萜烯、萜醇，從化合物種類(lèi)來(lái)看，兩地精油的主要成分均有2-蒈烯-10-醛、枯茗醛、3-蒈烯-10-醛、γ-松油烯、p-傘花烴、α-蒎烯等。

花椒精油檢測(cè)出43 種化合物，占總量的95%，主要成分為芳樟醇（15.05%）、雙戊烯（11.79%）、乙酸芳樟酯（11.17%）、β-蒎烯（9.33%）、（－）-4-萜品醇（6.04%）、桉葉油醇（4.62%）；唐裕芳等[28]的研究發(fā)現(xiàn)花椒精油中主要有22 種化學(xué)成分，包括烯醇（芳樟醇29.69%、4-松油醇10.79%、α-松油醇8.35%）及其酯類(lèi)衍生物（芳樟醇酯36.89%）、萜烯類(lèi)化合物6.76%（β-月桂烯、（＋）-2-蒈烯、檸檬烯、α-側(cè)柏烯、順-α-羅勒烯、γ-松油烯、α-石竹烯）、苯酚、桉葉油素等主要成分。

芥子精油檢測(cè)出22 種化合物，占總量的99.97%，主要成分為烯丙基異硫氰酸酯（50.97%）、4-異硫氰基-1-丁烯（44.91%）；陳密玉等[29]報(bào)道芥子精油的主要化學(xué)成分為烯丙基異硫氰酸酯（35.897%）、4-異硫氰基-1-丁烯（57.658%），這兩種化合物的相對(duì)含量占總含量的93.555%，由此可見(jiàn)，芥子精油是以含有異硫氰基化合物為主的混合物。

總體而言，植物精油是一類(lèi)含有烴類(lèi)與其他物質(zhì)（如萜烯、醇、酯、醛和酚類(lèi)化合物）的混合物，其中萜烯、醇、酯、醛和酚類(lèi)化合物具有抑菌活性[15]；由植物精油提取出的化合物組合可能受植物品種、氣候條件、地理區(qū)域及植物收集季節(jié)的影響[30]，造成不同報(bào)道之間同種精油的組分存在部分差異。

2.2 單一精油的抑菌效果

表2 3 種精油對(duì)4 種果蔬真菌的抑菌活性Table2 Antimicrobial activity of three essential oils against four fungi

所測(cè)試的精油通過(guò)微量稀釋方法和瓊脂紙片擴(kuò)散法來(lái)測(cè)定其抑菌效果（表2、圖2），在測(cè)試的菌株中，互隔交鏈孢的耐藥性最強(qiáng)（MBC≥2.0 μL/mL），且孜然、花椒精油不能在2.0 μL/mL條件下殺死該菌株；相反，硫色鐮刀菌相比于其他3 種菌株是最敏感的菌株；從菌落直徑和MIC可以看出，芥子精油相比于孜然精油、花椒精油，其對(duì)4 種菌株均具有較強(qiáng)的抑菌效果，且花椒精油的抑菌效果最弱。根據(jù)每種菌株在不同精油處理組間顯著性分析可知，混合精油和單種芥子精油處理后抗菌效果最佳；互隔交鏈孢相比于其他3 種菌株菌落直徑較大、活力最強(qiáng)，但芥子精油對(duì)其抑菌效果最佳，這可能與精油的化學(xué)成分組成和所測(cè)目標(biāo)菌株的種類(lèi)有關(guān)，芥子精油所含的異硫氰基化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到95.88%，而孜然、花椒精油所含的萜類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)和酚類(lèi)化合物相對(duì)復(fù)雜，且各物質(zhì)含量相對(duì)比例較少。據(jù)報(bào)道，不同的植物精油對(duì)同一種菌的抑制活性不同，如丁香精油、百里香酚和蒔蘿精油對(duì)鏈格孢菌的MIC分別為600 μg/mL、2 μL/mL和0.5 μL/mL[31-33]；同一種精油對(duì)不同菌種的抑制效果也存在差異，亞香茅精油對(duì)炭疽菌的抗性很強(qiáng)，當(dāng)添加量達(dá)到0.2%時(shí)平板中沒(méi)有檢出菌落，對(duì)柯柯豆毛色二孢的抑制作用較差，添加量為2%才可以完全抑制菌的生長(zhǎng)[34]。由此可知，抑菌強(qiáng)弱與所用精油和所測(cè)目標(biāo)菌株種類(lèi)有關(guān)。

表3 不同菌株在混合精油處理下的響應(yīng)模型方差分析Table3 Analysis of variance for the antifungal activity of oil blends against different strains

圖2 不同處理方式下菌株的菌落直徑Fig.2 Diameters of inhibition zones of fungal strains when exposed to individual and blended essential oils

2.3 三元混合物及其抑菌作用

研究混合精油之間相互抑菌作用較為復(fù)雜，要根據(jù)混合精油比例關(guān)系和其化合物組成成分進(jìn)行量化分析，才能確保結(jié)果的可靠性。棋盤(pán)和時(shí)間抑菌法曲線是評(píng)估混合精油抑菌效果的最常用的方法[9,35-36]，但其無(wú)法得出最佳的混合比以及擬合出最佳混合響應(yīng)值。因此，本實(shí)驗(yàn)采用單純型增強(qiáng)質(zhì)心混料設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)3 種混合精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）對(duì)4 種果蔬真菌（粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）的抑菌效果。

2.3.1 建立響應(yīng)預(yù)測(cè)模型

通過(guò)1.3.2.5節(jié)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單純型增強(qiáng)質(zhì)心混料設(shè)計(jì)響應(yīng)分析（表1），并為每種菌株建立響應(yīng)預(yù)測(cè)方程，通過(guò)特殊立方模型描述響應(yīng)變量與因子之間的關(guān)系，確定系數(shù)R2和調(diào)整后的系數(shù)R2分析所選模型數(shù)據(jù)擬合的最佳組合（表3），再根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析確定最優(yōu)回歸模型（表3）。通常擬合模型系數(shù)為負(fù)表示降低因子響應(yīng)變量能力，為正表示增強(qiáng)因子響應(yīng)變量能力。本研究應(yīng)用混料設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型的目的是提高混合精油抑菌聯(lián)合作用，即最小響應(yīng)變量（MIC），因此，系數(shù)為負(fù)表示混合精油相關(guān)因素增加抗菌作用的能力。

2.3.2 混合精油相互作用的影響

據(jù)報(bào)道，不同的化合物相互作用可以提高或者降低精油的抑菌效果[9]。其相互作用可以產(chǎn)生4 種類(lèi)型的效果：無(wú)關(guān)、相加、拮抗和協(xié)同作用。

圖3 3 種精油對(duì)4 種果蔬真菌在不同植物精油組合作用下響應(yīng)的MIC 2D、3D輪廓圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of interaction between essential oils on MICs against four fungi

表4 不同模型系數(shù)擬合值及差異顯著性水平分析Table4 Response coeff i cients and signif i cance test

從表4和圖3中可以看出，芥子精油的響應(yīng)系數(shù)最小，其次是孜然精油，花椒精油的響應(yīng)系數(shù)較大，這一發(fā)現(xiàn)也反映出3 種精油抑菌能力的強(qiáng)弱，精油之間的相互作用程度可能與精油組成成分和受試菌株有關(guān)[16]。孜然精油和花椒精油對(duì)硫色鐮刀菌表現(xiàn)出高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），而對(duì)互隔交鏈孢菌沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的協(xié)同作用（P＞0.05），然而，這兩種精油對(duì)粉紅單端孢和擴(kuò)展青霉的響應(yīng)系數(shù)為正，相比另外兩種真菌具有相對(duì)較弱的抑菌能力，表現(xiàn)出極顯著的拮抗作用（P＜0.01），據(jù)報(bào)道酚類(lèi)單萜與醇類(lèi)的組合會(huì)對(duì)部分微生物產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用[37]；孜然精油和芥子精油對(duì)硫色鐮刀菌具有高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），對(duì)粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉和互隔交鏈孢不能確定協(xié)同或拮抗抑菌作用（P＞0.05）；花椒精油和芥子精油對(duì)擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢和硫色鐮刀菌具有顯著的協(xié)同抑菌效應(yīng)（P＜0.05），這一結(jié)果可能與花椒精油的主要成分醇類(lèi)、酯類(lèi)和芥子精油的主要成分異硫氰基化合物之間的化學(xué)組成成分相互作用有關(guān)。當(dāng)3 種精油混合作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)均顯示負(fù)響應(yīng)系數(shù)，表明對(duì)4 種真菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、硫色鐮刀菌均具有高度顯著的協(xié)同抑菌作用（P＜0.001），且擴(kuò)展青霉、硫色鐮刀菌響應(yīng)值（MIC）距三角形最佳混合區(qū)域中心較接近（圖3B1、D1），表現(xiàn)出較優(yōu)混合精油組合下的抑菌效果最佳，這一結(jié)果可能與混合精油各化學(xué)成分相互作用的原因有關(guān)。由于精油的生物活性與其化學(xué)成分直接相關(guān)，即使是在同一精油內(nèi)也可能發(fā)生顯著的變化，導(dǎo)致這些差異性來(lái)源可能包括提取的植物部位、植物的生長(zhǎng)氣候以及生長(zhǎng)環(huán)境條件[38-39]。精油的生物活性也受其組成組分之間相互作用的影響，即使含量較小的化合物也會(huì)由于其化學(xué)類(lèi)別的不同，導(dǎo)致其產(chǎn)生協(xié)同作用、拮抗或相加作用的化學(xué)反應(yīng)[15,38,40-41]。

Pekmezovic等[42]利用動(dòng)力學(xué)模型研究百里香、肉桂精油混合作用對(duì)黃曲霉菌的抑菌效果，結(jié)果表明其混合精油對(duì)黃曲霉菌具有協(xié)同性和加和性；de Azeredo等[43]發(fā)現(xiàn)牛至精油和迷迭香精油對(duì)單核增生性李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有協(xié)同作用；此外Ghabraie等[44]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)肉桂和肉桂皮精油對(duì)4 種致病菌（大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌）表現(xiàn)出加和的抗菌作用；劉曉麗等[45]研究丁香、肉桂及黑胡椒精油單獨(dú)和復(fù)配后對(duì)單核增生性李斯特菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)單一精油的最低抑菌濃度分別為96、72、48 mg/L，復(fù)合精油最低抑菌濃度為16 mg/L，說(shuō)明不同精油之間有協(xié)同作用，可以增強(qiáng)抑菌效果。通過(guò)前人的研究也充分說(shuō)明精油之間的相互作用對(duì)一些細(xì)菌、真菌性微生物相比于單種精油作用具有較優(yōu)的抑菌效果，混料設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型適用于不同種精油組合對(duì)受試菌株產(chǎn)生較優(yōu)的抑菌效果。

2.3.3 混合優(yōu)化模型分析

圖4 3 種混合植物精油對(duì)4 種果蔬真菌最佳抑菌區(qū)域Fig.4 The best antibacterial area of three kinds of mixed plant essential oils against four fruit and vegetable fungi

由圖4響應(yīng)優(yōu)化分析可知，3 種混合精油對(duì)4 種果蔬真菌擬合數(shù)據(jù)MIC均不大于（0.062 5f0.010 0）μL/mL，其復(fù)合合意性大于95.0%，且相對(duì)抑菌濃度最??；當(dāng)3 種混合精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時(shí)滿足4 種菌株最佳抑菌反應(yīng)期望（圖5），對(duì)4 種果蔬真菌（粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌）預(yù)測(cè)的最佳MIC分別為0.059 50、0.031 56、0.068 69、0.043 82 μL/mL（MIC＜＜0.125 μL/mL）；其合意性分別為93.97%、99.93%、92.01%、97.32%；總體復(fù)合合意性達(dá)到95.76%，具有顯著的期望值。分析得出當(dāng)3 種精油在較佳比例混合作用4 種菌株時(shí)，預(yù)測(cè)的MIC相對(duì)于單種精油作用符合最佳抑菌濃度要求，且對(duì)4 種菌株具有相對(duì)廣譜性的抑菌效果（圖4）。

圖5 3 種混合植物精油對(duì)4 種果蔬真菌的最佳混料組合Fig.5 Optimum blend ratio of three essential oils against four fungi in fruits and vegetables

2.4 混合優(yōu)化精油體外抑菌效果實(shí)驗(yàn)分析

通過(guò)混合優(yōu)化后的3 種精油（孜然精油、花椒精油、芥子精油）最佳混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時(shí)對(duì)4 種果蔬真菌進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，根據(jù)1.3.2.3節(jié)操作方法，混合精油處理后的粉紅單端孢、擴(kuò)展青霉、互隔交鏈孢、硫色鐮刀菌菌落直徑分別是未用精油處理的77.15%、32.14%、18.54%、16.9%（圖2）；相比孜然、花椒精油單獨(dú)作用具有較強(qiáng)的抗菌效果，但略弱于芥子精油單獨(dú)處理的抑菌效果，這可能是芥子精油的主要成分異硫氰基化合物含量多且單一性強(qiáng)所致；從組間對(duì)比也得出3 種精油混合作用時(shí)，對(duì)4 種菌株具有較強(qiáng)的協(xié)同抑菌效果，其對(duì)混合后精油敏感強(qiáng)度大小依次是硫色鐮刀菌、互隔交鏈孢、擴(kuò)展青霉、粉紅單端孢。這也充分證明混合精油相對(duì)較低濃度下對(duì)菌株具有較優(yōu)的抑菌效果。

3 結(jié) 論

混合植物精油相比于單種植物精油在較低濃度下具有較強(qiáng)的抗菌效果。根據(jù)混料設(shè)計(jì)分析得出，組合精油的抑菌功效取決于不同精油的成分與混料比以及受試菌株；在孜然、花椒、芥子混料比例分別為36.11%、19.45%、44.44%時(shí)，預(yù)測(cè)對(duì)4 種果蔬真菌具有最佳的抑菌效果，瓊脂紙片擴(kuò)散法體外實(shí)驗(yàn)也證明出混合精油相比于單種精油在較小用量下具有較優(yōu)抑菌效果。通過(guò)使用混料設(shè)計(jì)方法，不僅可以減少精油在抑菌防腐上的用量，而且能夠節(jié)約成本，為配制新型天然食品防腐劑提供了理論依據(jù)。