季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株對(duì)枇杷采后炭疽病的抑菌效果及保鮮作用

趙魯寧，周秋陽(yáng)，楊慧慧，鄭鴻儒，溫新宇，孫衛(wèi)紅*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）是中國(guó)東南部特產(chǎn)水果之一，因具有鮮嫩甜爽的口感和止咳潤(rùn)肺等功效而廣受歡迎，但由于其皮薄多汁、質(zhì)軟易腐等特點(diǎn)而不易存放。在一般條件下難以長(zhǎng)途運(yùn)銷及貯藏，因此果實(shí)采后損耗極高，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益不高[1]。采取合理的貯藏保鮮技術(shù)，有效地延長(zhǎng)新鮮枇杷的貯藏期，實(shí)現(xiàn)顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[2]。然而目前果蔬主要采用傳統(tǒng)的如低溫貯藏等物理方法及化學(xué)試劑處理等方式貯存保鮮，但存在實(shí)施成本較高、化學(xué)物質(zhì)殘留危害等缺陷，因此安全有效的生物防治方法現(xiàn)成為國(guó)內(nèi)外關(guān)于果蔬采后病害防治及保鮮儲(chǔ)藏的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)，研究人員不斷分離篩選得到能顯著抑制果蔬采后腐爛的拮抗酵母菌[3-5]。其中季也蒙畢赤酵母是一種研究較多、應(yīng)用較廣的生防酵母，其有多種優(yōu)勢(shì)：防治效果良好[6]；無(wú)毒且不產(chǎn)生有毒代謝物[7]；抑菌廣譜性高；可以與多種方法共同使用，如CaCl2溶液[8]、低溫處理[9]和熱處理[10]等；對(duì)宿主影響小[11]。其主要有以下幾種作用機(jī)理：空間與營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)[8]；分泌水解酶和重寄生作用[12]；誘導(dǎo)宿主防御反應(yīng)[6]。

進(jìn)而，一些酵母菌被注冊(cè)為果蔬采前采后生防制劑進(jìn)行推廣應(yīng)用，如西班牙的“Candifruit”、美國(guó)的“Biosave”等均有良好的果蔬病害生物防治效果[13]。針對(duì)生物拮抗菌是活體微生物的特點(diǎn)，生防制劑制備時(shí)要確保能夠達(dá)到或接近原種拮抗酵母菌的活力和效力[14]，生防制劑常被制備成液體型和干粉型制劑，并添加活力保護(hù)劑進(jìn)行應(yīng)用。

造成我國(guó)枇杷果實(shí)腐爛變質(zhì)的采后常見(jiàn)病害包括炭疽病等，亟待解決的問(wèn)題是探明能夠抑制枇杷炭疽病產(chǎn)生的安全有效方法[15]，劉曉菲等[16]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖/納米蒙脫土復(fù)合涂膜劑對(duì)枇杷保鮮具有一定的應(yīng)用效果，但目前關(guān)于生防酵母菌對(duì)枇杷炭疽病和保鮮貯藏方面的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了季也蒙畢赤酵母菌株對(duì)枇杷炭疽病原真菌膠孢炭疽菌的抑菌效果，并研究將其生防制劑應(yīng)用在枇杷貯藏保鮮方面的效果。

本研究利用從無(wú)受傷、無(wú)腐爛的枇杷果實(shí)表面分離篩選的拮抗酵母菌季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株對(duì)枇杷炭疽病病原真菌膠孢炭疽菌的抑菌效果。采用海藻糖作為酵母菌的保護(hù)劑，對(duì)液體和固體的兩種生防劑型進(jìn)行存放效力評(píng)價(jià)，并在枇杷果實(shí)貯藏保鮮方面進(jìn)行初步應(yīng)用，明確其對(duì)枇杷果實(shí)貯藏期的抑菌及保鮮效果。此研究可為季也蒙畢赤酵母應(yīng)用在果蔬采后生物防治方面提供更多理論依據(jù)及實(shí)踐應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷果實(shí)：于江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)高橋鎮(zhèn)一家未施用農(nóng)藥的果園，在5月中下旬枇杷進(jìn)入商業(yè)成熟期時(shí)，采摘大小和成熟度一致，無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的枇杷果實(shí)，迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室備用。

病原真菌：由中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），實(shí)驗(yàn)期間在4 ℃條件下的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）（200 g馬鈴薯切條，加蒸餾水煮沸20 min，4 層紗布過(guò)濾，加蒸餾水至1 000 mL，再添加20 g瓊脂、20 g葡萄糖）試管斜面上保藏。

供試拮抗酵母菌：由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保存的Y35-1季也蒙畢赤酵母菌（Pichia gulliermondii）株系，并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO：M2016719）。

磷酸、鹽酸、蒽酮、酚酞、2,6-二氯靛酚、抗壞血酸、葡萄糖均為分析純；瓊脂、酵母提取物、牛肉浸膏均為生化試劑。所有試劑均購(gòu)自鎮(zhèn)江國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-500F恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ULT1386-3-V40超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Revco公司；Pilot1-2MD真空干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TA-XT2i物性儀 英國(guó)Stable Micro System公司；PAL-BX/RT手持折光儀 上海人和科學(xué)儀器有限公司；DDS-11C電導(dǎo)率儀 上海精密儀器儀表有限公司；BM2000光學(xué)顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株最佳濃度及抑菌效果的測(cè)定

季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株離體最佳濃度的確定參照Chanchaichaovivat等[12]的方法進(jìn)行。超凈工作臺(tái)中倒板的PDA培養(yǎng)基中添加10%無(wú)菌枇杷汁，在平板中央打直徑6 mm的孔。小孔中注入20 μL濃度分別為1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的酵母菌懸液，2 h后小孔內(nèi)再注入20 μL濃度為5×104spores/mL的膠孢炭疽菌孢子懸液，無(wú)菌蒸餾水為酵母菌懸液的對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈大小。

Y35-1菌株體內(nèi)最佳濃度的確定參照He Dan等[17]方法進(jìn)行。枇杷果實(shí)傷口（滅菌打孔器在0.1% NaClO溶液消毒并在水清洗的枇杷果實(shí)赤道上打深度3 mm、直徑5 mm的孔）替代平板小孔，酵母菌及病原菌注入方法同離體測(cè)定方法，5 d后觀察果實(shí)發(fā)病率并測(cè)定病斑直徑。酵母菌處理至少30個(gè)枇杷果實(shí)傷口，每種處理3 次平行，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次。

Y35-1菌株對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響參照Droby等[5]的方法進(jìn)行。采用去除培養(yǎng)基、濃度為1×108CFU/mL的Y35-1酵母菌懸液（由上述最佳濃度實(shí)驗(yàn)確定），膠孢炭疽菌孢子懸浮液[18]為5×107spores/mL。在光學(xué)顯微鏡下觀察，至少觀察100個(gè)孢子，每種處理3 次平行，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次。

Y35-1菌株的寄生作用參照徐春青[19]的方法進(jìn)行。在PDB培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基配方減除瓊脂，50 mL/250 mL）中同時(shí)接種活化好的Y35-1菌株（1×108CFU/mL）和膠孢炭疽菌（5×104spores/mL）進(jìn)行共培養(yǎng)，吸取共培養(yǎng)物用無(wú)菌蒸餾水沖洗掉未寄生的酵母菌后放在光學(xué)顯微鏡下觀察。

Y35-1菌株不揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果參照Walker等[20]的方法進(jìn)行。采用Y35-1拮抗酵母菌（1×108CFU/mL）和膠孢炭疽菌（6 mm菌絲塊接入）同步不接觸對(duì)峙培養(yǎng)，分別采用PDA平板和NYDA（8 g牛肉浸膏、5 g酵母提取物、10 g葡萄糖、20 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL）平板培養(yǎng)。每種處理3 次平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少2 次。拮抗酵母菌對(duì)膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)抑制率計(jì)算如（1）式所示：

1.3.2 酵母菌液體菌劑的制備及其效力評(píng)價(jià)

Y35-1酵母菌液體菌劑的制備參照徐春青[19]的方法調(diào)整進(jìn)行。將富集培養(yǎng)的Y35-1酵母菌發(fā)酵液制成菌懸液調(diào)整好濃度。同時(shí)，用pH 6.5的0.05 mol/L磷酸緩沖液配制成終濃度為1×108CFU/mL的Y35-1酵母菌，并含5%海藻糖、0.01%抗壞血酸的液體生防菌劑。以上物質(zhì)混合均勻后分裝到多個(gè)離心管中，分為3 組多管，分別于25、4、－20 ℃保存。

液體菌劑酵母菌存活率的評(píng)價(jià)：將Y35-1酵母液體生防菌劑采用梯度稀釋涂平板法確定初始活菌數(shù)。25 ℃保存的液體菌劑每隔10 d取樣測(cè)定其活菌數(shù)；4 ℃和－20 ℃保存的液體菌劑每隔1 月取樣測(cè)定其活菌數(shù)；統(tǒng)計(jì)不同保存條件下液體菌劑中酵母細(xì)胞的存活率。

液體菌劑生防效力的評(píng)價(jià)：枇杷果實(shí)消毒及傷口打孔同1.3.1節(jié)方法。吸取最初制備的液體生防菌劑10 μL接種于枇杷傷口處，2 h后接入10 μL濃度為5×104spores/mL的膠孢炭疽菌孢子懸浮液于果實(shí)傷口處。同樣方法用1×108CFU/mL Y35-1酵母懸液（用pH 6.5的0.05 mol/L磷酸緩沖液配制）處理枇杷果實(shí)傷口，無(wú)菌水處理為空白對(duì)照。室溫晾干后將枇杷果實(shí)放于塑料筐（保鮮膜密封）中，于 28 ℃、相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏；每隔5 d觀察枇杷果實(shí)的發(fā)病率并測(cè)定病斑直徑。每處理組至少30 個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.3 酵母菌凍干粉生防菌劑的制備及效力評(píng)價(jià)

Y35-1酵母菌凍干粉菌劑的制備：參照張紅印[21]的方法調(diào)整進(jìn)行。對(duì)Y35-1酵母菌進(jìn)行富集培養(yǎng)后將酵母發(fā)酵液制成酵母菌懸液備用。先配制10%的海藻糖溶液[22]，高壓滅菌后再與酵母菌懸液等體積混合?；旌暇鶆蚝蟮谷? cm直徑的平板中，厚度約0.5 cm。用保鮮膜將平板封口后迅速放入－80 ℃超低溫冰箱預(yù)冷凍。3 h后將平板迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷至－30 ℃以下的冷凍干燥機(jī)中，真空凍干36 h，冷阱溫度為－50 ℃。凍干完成后迅速于超凈工作臺(tái)內(nèi)用封口膜和保鮮膜將平板密封。以上多份凍干粉均分為3 組，分別在25、4 ℃和－20 ℃條件下保存。

凍干前后酵母菌存活率的評(píng)價(jià)：凍干前先測(cè)定活菌數(shù)。凍干后菌粉用無(wú)菌水處理懸液至冷凍干燥前的體積，梯度稀釋涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定活菌數(shù)。酵母菌存活率計(jì)算如式（2）所示：

酵母菌凍干粉菌劑貯藏期間活性的測(cè)定：每隔1 月稱取0.01 g的凍干粉，融于2 mL無(wú)菌水中，于37 ℃復(fù)水活化0.5 h后梯度稀釋涂布，平板于28 ℃倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)，存活率以每克凍干粉計(jì)。

凍干粉菌劑生防效力的評(píng)價(jià)：采用1.3.1節(jié)方法對(duì)枇杷果實(shí)進(jìn)行消毒并打孔處理后備用。將上述凍干粉菌劑用無(wú)菌蒸餾水溶解并混合均勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整至1×108CFU/mL，吸取10 μL調(diào)整好的菌懸液接種于枇杷傷口處，處理方法同于1.3.2節(jié)，觀察枇杷果實(shí)的腐爛情況并測(cè)定果實(shí)病斑直徑。每處理組至少30 個(gè)枇杷果實(shí)傷口，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少2 次。

1.3.4 酵母生防制劑對(duì)枇杷的貯藏保鮮及抑腐效果

將供試枇杷果實(shí)隨機(jī)分組做如下處理：1）液體菌劑處理組：將枇杷果實(shí)浸泡在1.3.1節(jié)方法制備的Y35-1酵母菌液體生防菌劑中10 min，自然晾干后于塑料筐中存放于室溫環(huán)境（實(shí)驗(yàn)期間室溫溫度19～28 ℃）貯藏。2） 凍干粉菌劑處理組：按照1.3.3節(jié)方法制備的酵母菌活性凍干粉菌劑復(fù)水后調(diào)整濃度為1×108CFU/mL，將枇杷果實(shí)浸泡在上述菌液中10 min，自然晾干后于塑料筐中存放于相同的室溫環(huán)境。3）磷酸緩沖液處理組：利用配制菌劑中用到的pH 6.5的0.05 mol/L磷酸緩沖液與液體生防菌劑做對(duì)照，將枇杷果實(shí)浸泡10 min，自然晾干后存放在相同的室溫環(huán)境中。4）對(duì)照組：不做任何處理的枇杷果實(shí)為空白對(duì)照。

枇杷果實(shí)腐爛指數(shù)確定：每隔5 d取樣一次，依據(jù)果實(shí)腐爛面積占原果實(shí)面積的百分比情況劃分5級(jí)：0級(jí)，無(wú)腐爛；1級(jí)，小于25%；2級(jí)，25%～50%；3級(jí)，50%～75%；4級(jí)，大于75%。腐爛指數(shù)計(jì)算如式（3）所示：

1.3.5 不同保鮮方法處理的枇杷貯藏期間果實(shí)生理指標(biāo)的測(cè)定

貯藏期間，每隔5 d取樣一次，測(cè)定枇杷果實(shí)相關(guān)的生理指標(biāo)。以下每組測(cè)定5～10 個(gè)枇杷，每組3 次平行，結(jié)果取平均值。

枇杷質(zhì)量損失率的測(cè)定：分別稱取果實(shí)初始質(zhì)量和每次取樣時(shí)的質(zhì)量，計(jì)算如式（4）所示：

果實(shí)硬度的測(cè)定：枇杷果實(shí)剝皮，用物性儀測(cè)定，采用P/5探頭測(cè)試果實(shí)硬度。參數(shù)如下：測(cè)前速率2.0 mm/s；測(cè)試速率1.0 mm/s；測(cè)后速率2.0 mm/s；距離10 mm；觸發(fā)力值0.05 N。根據(jù)質(zhì)地特征曲線得知枇杷果肉的硬度。

果皮細(xì)胞膜透性的測(cè)定：0.5 g果皮用去離子水沖洗3 次，試管中再加入20 mL去離子水，于搖床振蕩20 min，使用電導(dǎo)率儀測(cè)電導(dǎo)率L0，煮沸10 min并迅速冷卻后，再測(cè)電導(dǎo)率L1，相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算如式（5）所示：

果實(shí)可溶性固形物含量的測(cè)定：參照Weaver等[23]的方法，使用手持折光儀測(cè)得；果實(shí)VC含量的測(cè)定：參照李合生[24]的2,6-二氯靛酚滴定法進(jìn)行；果實(shí)可溶性總糖含量的測(cè)定：參照謝筆鈞等[25]的蒽酮比色法進(jìn)行；枇杷果實(shí)總酸含量的測(cè)定：參照謝筆鈞等[25]的酚酞指示劑滴定法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中的病原菌孢子萌發(fā)率、病原菌生長(zhǎng)抑制率、酵母細(xì)胞存活率、果實(shí)發(fā)病率等數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s Multiple Range Test新復(fù)極差法比較不同酵母菌株的每組處理之間及不同處理組之間數(shù)據(jù)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y35-1酵母菌株的最佳抑菌濃度

在離體情況下，拮抗酵母菌懸液不同濃度處理組的病原菌菌絲直徑的大小如表1所示，隨著Y35-1酵母菌濃度的提高，測(cè)試平板中抑菌圈的直徑隨之減小，說(shuō)明在離體情況下，Y35-1酵母菌株對(duì)膠孢炭疽菌起到了明顯抑制效果。

表1 不同濃度Y35-1酵母菌懸液處理對(duì)枇杷果實(shí)炭疽菌的抑菌效果及對(duì)果實(shí)發(fā)病的影響Table 1 Effects of different concentrations of Y35-1 on mycelium diameter of C. gloeosporioides and loquat disease incidence

如表1所示，4 種濃度的酵母菌懸液處理的果實(shí)發(fā)病率均明顯小于對(duì)照組的發(fā)病率，且與對(duì)照組均存在顯著性差異，說(shuō)明在枇杷果實(shí)體內(nèi)，Y35-1酵母菌株能夠顯著抑制膠孢炭疽菌引起的果實(shí)腐爛病害，減輕果實(shí)的病害發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1×108CFU/mL和1×109CFU/mL濃度菌株抑菌效果顯著，最終選用1×108CFU/mL為下述Y35-1拮抗酵母菌抑菌效果測(cè)試和貯藏保鮮制劑應(yīng)用的最佳濃度。

2.2 Y35-1酵母菌株對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用

Y35-1酵母菌懸液作用下的膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)率結(jié)果顯示，相比于對(duì)照83.86%的孢子萌發(fā)率，膠孢炭疽菌孢子的萌發(fā)率僅為14.92%，明顯受到Y(jié)35-1酵母菌的抑制。說(shuō)明Y35-1酵母菌株對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制是其生防機(jī)理，這也正是多數(shù)拮抗酵母菌的生防機(jī)理之一[26]。

圖1 Y35-1酵母菌株對(duì)膠孢炭疽菌菌絲的吸附作用（×400）Fig. 1 Adsorption of Y35-1 toward C. gloeosporioides (× 400)

共培養(yǎng)的拮抗酵母菌寄生作用結(jié)果如圖1所示，培養(yǎng)板用無(wú)菌水多次沖洗過(guò)后，仍有許多酵母吸附在膠孢炭疽菌菌絲上，說(shuō)明Y35-1酵母菌株可能在病原真菌菌絲上進(jìn)行寄生作用，同時(shí)顯示了拮抗酵母菌的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)及空間競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制[27]，從而更好地抑制病原菌正常的生長(zhǎng)。

Y35-1酵母菌株對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的抑制率結(jié)果（表2，圖2）顯示，酵母菌株在PDA平板和NYDA平板上對(duì)膠孢炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率分別高達(dá)87.0%和89.0%，能夠顯著抑制膠孢炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)（P＜0.05）。在培養(yǎng)過(guò)程中，兩者之間一直存在明顯的分界線，膠孢炭疽菌的菌絲始終沒(méi)有接觸覆蓋酵母菌落，在兩者相交界限處，膠孢炭疽菌菌絲呈現(xiàn)溶解狀態(tài)。推測(cè)Y35-1酵母拮抗菌能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制病原菌菌絲的擴(kuò)展或使其溶解，這也類似于Ren Xueyan等[28]關(guān)于拮抗酵母生防機(jī)理的研究。

表2 Y35-1菌株在PDA和NYDA平板上對(duì)膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)抑制Table 2 Inhibition rates of Y35-1 against C. gloeosporioides when cultured on PDA plates and NYDA plates

圖2 Y35-1菌株在PDA（A）和NYDA（B）平板上對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的抑制Fig. 2 Inhibition of Y35-1 against C. gloeosporioides on when cultured on PDA and NYDA plates

2.3 Y35-1酵母菌液體菌劑的存放條件及其生防效果

圖3 Y35-1酵母菌液體生防菌劑在不同存放條件下的存活率Fig. 3 Survival rate of the liquid culture of Y35-1 under different storage conditions

如圖3A所示，隨著液體菌劑貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，25 ℃存放的液體菌劑中酵母細(xì)胞的存活率快速下降，但處理組的酵母細(xì)胞存活率要高于對(duì)照組，表明處理組中添加物海藻糖等對(duì)Y35-1酵母菌具有一定的維持保護(hù)作用。同時(shí)證明海藻糖因其在生物抗逆反應(yīng)中的作用而宜作為天然保護(hù)劑應(yīng)用于生防制劑的制備[29]。如圖3B所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4 ℃存放的液體生防菌劑中酵母細(xì)胞存活率緩慢下降，存放4 個(gè)月，仍能保持較高的存活率，說(shuō)明4 ℃的存放條件有利于維持酵母細(xì)胞的生活力。且添加海藻糖的處理組酵母細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組。如圖3C所示，－20 ℃存放的液體生防菌劑中酵母細(xì)胞存活率較快下降，但處理組中的酵母細(xì)胞存活率仍明顯高于對(duì)照組，表明在－20 ℃的條件下，添加物海藻糖等對(duì)液體菌劑中Y35-1酵母菌活力起到了一定的維持保護(hù)作用。以上液體菌劑的3 種存放結(jié)果表明，配制的液體菌劑中酵母細(xì)胞存活率均較高，且液體劑型更適宜存放于4 ℃溫度條件下。

表3 Y35-1酵母菌液體菌劑及凍干粉菌劑對(duì)枇杷果實(shí)病原菌的生防效力Table 3 Biocontrol ef ficacy of different preparations of Y35-1 against C. gloeosporioides of loquat fruit

如表3所示，不同菌劑處理后，Y35-1酵母菌液體菌劑處理的枇杷果實(shí)發(fā)病率與原酵母菌懸液處理組的無(wú)顯著差異（P＜0.05），二者均果實(shí)發(fā)病率均低于對(duì)照組，且與之存在顯著性差異（P＜0.05）。不同菌劑處理后，Y35-1酵母菌液體菌劑處理的枇杷果實(shí)病斑直徑小于原酵母懸液處理組，同時(shí)小于對(duì)照組，且與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。

以上結(jié)果顯示（圖3、表3），配制的液體菌劑能夠有效保留Y35-1酵母菌的細(xì)胞活力及生防效力，能有效抑制枇杷果實(shí)中的炭疽病害的發(fā)生與發(fā)展，液體劑型酵母菌適宜的存放溫度為4 ℃。

2.4 Y35-1酵母凍干粉菌劑的存放條件及生防效果

凍干前后酵母干粉存活率的評(píng)價(jià)顯示，添加海藻糖凍干保護(hù)劑制備的凍干粉中拮抗酵母的存活率（81.9%）要顯著高于對(duì)照組（55.3%），說(shuō)明在Y35-1酵母活性凍干粉的凍干過(guò)程中，海藻糖起到了明顯的保護(hù)作用，能夠有效提高其凍干后酵母菌的生活力。

圖4 Y35-1酵母菌活性凍干粉菌劑在不同存放條件下酵母菌的存活率Fig. 4 Survival rate of the freeze-dried powder under different storage conditions

25 ℃存放條件下，凍干粉菌劑復(fù)水后酵母菌細(xì)胞存活率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢下降，存放4 個(gè)月，仍保持45.0%的存活率（圖4A），表明凍干粉菌劑的酵母菌細(xì)胞存活率高于對(duì)照組，存在顯著性差異（P＜0.05），且海藻糖在凍干粉酵母菌存放過(guò)程中起到了保護(hù)作用。4 ℃存放條件下，凍干粉菌劑復(fù)水后酵母細(xì)胞存活率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而小幅度下降，添加海藻糖的凍干粉菌劑的酵母細(xì)胞存活率高于對(duì)照組，存在顯著性差異（P＜0.05），存放4 個(gè)月，凍干粉菌劑中酵母細(xì)胞存活率約是對(duì)照的19.0 倍，且高于25 ℃下的凍干粉菌劑存活率（圖4B），說(shuō)明4 ℃條件保存凍干粉菌劑比常溫更有利于維持酵母菌的細(xì)胞生活力。－20 ℃存放條件下，凍干粉菌劑復(fù)水后酵母細(xì)胞存活率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而更緩慢下降，添加海藻糖的凍干粉菌劑組酵母細(xì)胞存活率高于對(duì)照組。且－20 ℃條件下存放的凍干粉菌劑的酵母菌存活率均高于4 ℃和25 ℃存放條件（圖4C），說(shuō)明－20 ℃的溫度條件存放最有利于維持凍干粉酵母細(xì)胞生活力。由上可見(jiàn)，以上常溫、低溫和冷凍存放條件比較，Y35-1酵母活性凍干粉菌劑更適宜存放于－20 ℃溫度條件下。

Y35-1酵母菌活性凍干粉菌劑復(fù)水后作用于枇杷果實(shí)上的生防效力如表3所示，不同處理后，Y35-1酵母菌活性凍干粉菌劑處理和原酵母菌懸液處理的枇杷果實(shí)發(fā)病率低于對(duì)照組，且與之存在顯著性差異（P＜0.05）。不同處理后，Y35-1酵母菌活性凍干粉菌劑處理的枇杷果實(shí)病斑直徑小于原酵母菌懸液處理組，更小于對(duì)照組，且與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果顯示（圖4、表3），Y35-1酵母菌活性凍干粉菌劑能夠有效保留拮抗酵母菌的細(xì)胞活力及生防效力，凍干粉菌劑復(fù)水后能有效抑制枇杷果實(shí)的炭疽腐爛病害。－20 ℃條件下更適宜存放，且海藻糖的添加有效保護(hù)維持了凍干粉貯藏期間酵母菌的生活力和生防效力。

2.5 不同酵母生防制劑處理對(duì)貯藏枇杷果實(shí)的抑腐效果

季也蒙畢赤酵母已被研究證實(shí)為一種安全無(wú)毒、有效抑制果蔬腐爛變質(zhì)的拮抗菌[30]，但尚鮮有報(bào)道將此應(yīng)用到枇杷貯藏保鮮方面。將Y35-1酵母菌液體菌劑和活性凍干粉菌劑采用浸泡法分別處理枇杷果實(shí)，果實(shí)在貯藏期間的腐爛指數(shù)如圖5所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組中果實(shí)的腐爛指數(shù)隨之增加，但液體菌劑和活性凍干粉菌劑處理的果實(shí)腐爛指數(shù)明顯低于磷酸緩沖液組和對(duì)照組，且與它們存在顯著性差異（P＜0.05）。貯藏至20 d，液體菌劑和凍干粉菌劑處理的果實(shí)腐爛指數(shù)分別僅為2.25%和3.60%，分別是對(duì)照的12.5%和20.0%。結(jié)果表明在枇杷貯藏過(guò)程中，這兩種生防菌劑能夠有效控制果實(shí)炭疽病病害的發(fā)生，具有顯著的抑腐保鮮效果。

圖5 不同菌劑處理后枇杷貯藏期間果實(shí)的腐爛情況Fig. 5 Decay indexes of loquat fruit with different treatments of Y35-1 during storage period

2.6 不同酵母生防制劑處理對(duì)枇杷貯藏保鮮期間果實(shí)生理變化的影響

圖6 不同酵母制劑處理后枇杷貯藏期間指標(biāo)變化Fig. 6 Changes in quality indexes of loquat fruit with different treatments of Y35-1 during storage period

在貯藏期間，枇杷果實(shí)質(zhì)量損失率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)增加，液體菌劑處理的果實(shí)質(zhì)量損失率低于其他組（圖6a），說(shuō)明液體菌劑有效減緩枇杷果實(shí)貯藏期間水分及其他物質(zhì)的流失，采用液體菌劑處理效果最好。

枇杷果實(shí)硬度變化的總趨勢(shì)是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，液體生防菌劑處理的果實(shí)硬度值始終較低，貯藏至20 d后，活性凍干粉菌劑處理的果實(shí)硬度值最小，且與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）（圖6b）。

枇杷貯藏期間果實(shí)可溶性固形物含量的變化隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，液體菌劑和活性凍干粉菌劑處理組的可溶性固形物含量均明顯高于其他處理組（圖6c）。表明在枇杷果實(shí)貯藏保鮮過(guò)程中，液體菌劑和凍干粉菌劑能有效維持果實(shí)中可溶性固形物含量而保證果實(shí)品質(zhì)不發(fā)生明顯變化。

枇杷貯藏期間果皮細(xì)胞膜透性的變化如圖6d所示，各個(gè)處理組中的相對(duì)電導(dǎo)率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而隨之上升，但液體菌劑和凍干粉菌劑處理的果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于其他處理組。隨著果實(shí)衰老和采后時(shí)間延長(zhǎng)，果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)受損而導(dǎo)致離子泄露增加，組織相對(duì)電導(dǎo)率會(huì)隨之上升，因此，果實(shí)細(xì)胞膜系統(tǒng)受破壞程度可用果皮相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)反映。結(jié)果表明：在枇杷貯藏過(guò)程中，液體菌劑和凍干粉菌劑對(duì)枇杷果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用，防止采后果實(shí)快速衰老和腐爛變質(zhì)。

各種處理?xiàng)l件下枇杷果實(shí)VC含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而隨之減少，其中凍干粉菌劑處理后果實(shí)VC含量最高，其次為液體菌劑處理的果實(shí)（圖6e）。表明在枇杷果實(shí)貯藏保鮮過(guò)程中這兩種生防酵母制劑對(duì)果實(shí)VC含量起到了維持作用，有利于保持枇杷果實(shí)的品質(zhì)新鮮。

枇杷貯藏期間果實(shí)可溶性總糖含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，液體菌劑和凍干粉菌劑處理的果實(shí)總糖含量要高于其他處理組（圖6f），說(shuō)明在枇杷果實(shí)的貯藏保鮮過(guò)程中，這兩種生防菌劑對(duì)果實(shí)總糖含量起到了一定的維持作用。

枇杷貯藏期間果實(shí)總酸含量的變化隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，至貯藏后期，幾種方式處理后的果實(shí)總酸含量變化差別不明顯（圖6g）。

以上結(jié)果顯示，季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株的液體型和凍干粉生防菌劑在枇杷貯藏期間的果實(shí)質(zhì)量損失率、果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、果皮細(xì)胞膜透性、VC含量、可溶性總糖含量、總酸含量方面均起到一定的維持保護(hù)作用，表明這兩種生防菌劑對(duì)枇杷果實(shí)采后貯藏保鮮存在良好的效果，具有進(jìn)一步的應(yīng)用研究前景。

3 結(jié) 論

諸多研究證實(shí)部分酵母菌能夠有效控制果蔬采后腐爛變質(zhì)問(wèn)題，避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失。從原生態(tài)枇杷果實(shí)上分離篩選的季也蒙畢赤酵母Y35-1菌株對(duì)病原真菌膠孢炭疽菌的抑菌實(shí)驗(yàn)表明：最佳抑菌效果的濃度為1×108CFU/mL，Y35-1酵母菌能夠抑制病原菌膠孢炭疽菌孢子的萌發(fā)和明顯抑制膠孢炭疽菌菌絲的擴(kuò)展和生長(zhǎng)。Y35-1酵母菌的液體菌劑和凍干粉菌劑在貯藏期間均能保持良好的生活力和生防效力。2 種劑型的酵母生防菌劑對(duì)枇杷果實(shí)貯藏期間的腐爛情況有顯著抑制效果，對(duì)枇杷果實(shí)采后貯藏方面存在顯著保鮮效果，具有一定的研究推廣價(jià)值。但同時(shí)，Y35-1季也蒙畢赤酵母菌對(duì)膠孢炭疽菌的生防機(jī)理及其中具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究探討。