納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶及其代謝特性分析

趙謀明，鄒 穎，林戀竹,*，吳 見

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.紐斯葆廣賽（廣東）生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510931）

納豆激酶是一種在納豆發(fā)酵過程中由納豆菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶[1-3]，具有高效溶血栓活性，極具開發(fā)價值[4-5]。近年來利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)納豆激酶已經(jīng)成為趨勢。選擇特色的發(fā)酵底物，并對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化以實現(xiàn)發(fā)酵底物的高效利用，是降低納豆激酶生產(chǎn)成本的重要途徑。蕎麥含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、礦物元素等營養(yǎng)成分[6]。黃酮類化合物如蘆丁，是蕎麥最重要的生物活性物質(zhì)之一，具有很強的抗氧化活性，對心血管疾病以及高血糖、高血脂等慢性疾病具有較好的防治作用[7-8]。前期研究結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蕎麥可以促進納豆菌產(chǎn)納豆激酶并提高發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性[9]。

肽類物質(zhì)是優(yōu)良的氮源，具有促進微生物生長發(fā)育和加速新陳代謝的作用[10]。枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基多使用蛋白胨作為氮源。蛋白胨成本較高，且市場上綠色安全的食品級蛋白胨較少。以大豆蛋白為原料，采用食品級蛋白酶法制備大豆蛋白酶解物具有綠色、安全的特點[11]，可以取代國內(nèi)發(fā)酵工業(yè)中所用的價格高昂蛋白胨類產(chǎn)品，達到降低成本提高食用安全性目的。

本實驗擬優(yōu)化納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶揺瓶、發(fā)酵罐條件，制備高納豆激酶活力、富含谷物多酚且具有強抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物。對比大豆分離蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨作為補充氮源時菌體生長規(guī)律以及代謝物質(zhì)（酶、可溶性蛋白、還原糖、多酚及抗氧化物質(zhì)）變化規(guī)律，為工業(yè)化放大生產(chǎn)納豆激酶提供理論與方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌（Bacillus subtilis natto） 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院；蕎麥 南沙舊鎮(zhèn)天匯百貨超市；大豆分離蛋白 廣州合誠實業(yè)有限公司；凝血酶、纖維蛋白原 上海源葉生物科技有限公司；BCA試劑盒 廣州鼎國生物科技有限公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）、熒光素、Trolox（純度99%）美國Sigma公司；大豆蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰酶、NS37071、復(fù)合蛋白酶、α-淀粉酶（10 000 U/g） 諾維信公司；福林-酚試劑根據(jù)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》規(guī)定方法配制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash型酶標儀 美國Thermo公司；UV-721型紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；LRH-250A-II生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器 江蘇蘇昆儀器有限公司；BioStat B2.5 L發(fā)酵罐 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 揺瓶條件優(yōu)化

種子液的制備：取試管斜面上保藏的納豆菌接種于種子培養(yǎng)基中（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，100 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。

蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，分別加入不同添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%）的α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，得到蕎麥糖化液，調(diào)節(jié)混懸液pH 7.0，將種子液以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（25 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，考察α-淀粉酶添加量對納豆菌產(chǎn)納豆激酶的影響。

大豆分離蛋白酶解物的制備：取大豆分離蛋白，按料液比1∶15（g/mL）加入去離子水，攪拌至大豆分離蛋白充分水化，分別加入1%胰酶（以大豆分離蛋白質(zhì)量計）、NS37071、復(fù)合蛋白酶，分別于55 ℃酶解4、8、12 h，沸水浴滅酶10 min，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取上清液，減壓濃縮后冷凍干燥，得到大豆分離蛋白酶解物。

在經(jīng)過優(yōu)化后的蕎麥糖化液中，分別補充不同大豆分離蛋白酶解物及商業(yè)大豆蛋白胨（添加量0.4%），調(diào)節(jié)混懸液pH 7.0，按上述搖瓶條件進行發(fā)酵，考察氮源對納豆菌產(chǎn)納豆激酶的影響。

在經(jīng)過優(yōu)化后的蕎麥糖化液中，補充經(jīng)過上述優(yōu)化得到的大豆分離蛋白酶解物，調(diào)節(jié)混懸液pH 7.0，按上述搖瓶條件進行發(fā)酵，考察發(fā)酵時間對納豆菌產(chǎn)納豆激酶的影響。

1.3.2 2.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化

將種子液以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（經(jīng)1.3.1節(jié)優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基，25 mL/250 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。將搖瓶預(yù)培養(yǎng)后的菌體接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，固定發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間36 h，分別考察通氣量（2.0、3.0、3.5 L/min）、攪拌速率（200、300、400 r/min）、裝液量（1、1.2、1.5 L）、接種量（2.0%、3.0%、4.0%）對納豆菌產(chǎn)納豆激酶的影響。

1.3.3 2.5 L發(fā)酵罐中菌體生長和代謝特性分析

分別于蕎麥糖化液中補充大豆分離蛋白酶解物和商業(yè)大豆蛋白胨，在發(fā)酵罐優(yōu)化條件下，使用pH電極和復(fù)膜氧電極在線監(jiān)測發(fā)酵過程中pH值與溶氧的變化。發(fā)酵過程中，每間隔6 h取樣，分別測定生物量、納豆激酶活力、可溶性蛋白、還原糖、總酚含量、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）。

1.3.4 指標的測定

1.3.4.1 納豆激酶活力

纖維蛋白平板法：參照Astrup等[12]的方法并加以改進。將13.35 mg纖維蛋白原溶于15 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制成0.89 mg/mL的纖維蛋白原緩沖溶液，50 ℃保溫5～10 min。將7.5 U凝血酶溶于1 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中制得凝血酶緩沖溶液。配制1%瓊脂糖溶液，50 ℃保溫10 min，將1 mL 7.5 U/mL凝血酶緩沖溶液、15 mL纖維蛋白原溶液以及20 mL瓊脂糖溶液迅速混勻，立即倒平板，凝固后進行打孔，取10 μL發(fā)酵產(chǎn)物加樣于纖維蛋白原平板孔中，37 ℃孵育18 h，用游標卡尺測量透明圈直徑，并計算透明圈面積。一個酶活力單位（U）定義為1 min內(nèi)水解纖維蛋白產(chǎn)生0.01 mm2透明圈所需要的酶量。

紫外分光光度計法[13]：將1.4 mL的Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8）和0.4 mL 0.72 g/100 mL的纖維蛋白原溶液混合，振蕩后于37 ℃放置10 min；加入0.1 mL凝血酶溶液（20 U/L）充分混勻，37 ℃放置10 min，于上述溶液中加入0.1 mL樣品溶液（對照組不加），37 ℃水浴保溫反應(yīng)1 h。每隔20 min振蕩一次，最后加入2 mL 0.2 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止反應(yīng)（對照組同時添加樣品溶液），37 ℃水浴中放置20 min，將上述反應(yīng)于10 000 r/min離心10 min，測定275 nm波長處的吸光度。一個酶活力單位（FU）定義為1 min內(nèi)在275 nm波長處吸光度變化0.01所需要的酶量。

1.3.4.2 生物量

采用萬春艷[11]的方法（細胞干重法），準確量取25 mL發(fā)酵液，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2 次后，將菌體轉(zhuǎn)移到干燥皿中，105 ℃烘干至恒質(zhì)量。

1.3.4.3 可溶性蛋白

按BCA試劑盒方法，以牛血清蛋白為標準品測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.4.4 還原糖

還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]。

1.3.4.5 總酚

采用Lin Lianzhu等[15]的方法，取樣0.5 mL，加蒸餾水至6 mL，搖勻，加入0.5 mL福林-酚試劑搖勻，在1～8 min內(nèi)加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸餾水至10 mL搖勻，40 ℃保溫2 h，迅速冷卻后，立即在760 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸為標準品做標準曲線，計算總酚含量。

1.3.4.6 ORAC

參考林戀竹等[16]的方法，在微孔板中分別加入25 μL樣品溶液或Trolox溶液或緩沖液（75 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，pH 7.4），然后加入75 μL 0.159 μmol/L熒光素鈉溶液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL 38.25 mmol/L AAPH，保持反應(yīng)體系溫度恒定為37 ℃，設(shè)定激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，開始計時反應(yīng)并讀數(shù)（f0），每分鐘讀一次數(shù)（f1、f2、…、f70）共讀71 次數(shù)（共計反應(yīng)70 min），將每次讀數(shù)連成曲線。計算見公式（1）、（2）：

式中：AUC為曲線下的面積；NetAUC為樣品曲線下面積與空白曲線下面積之差。

Trolox濃度與NetAUC呈線性關(guān)系，換算得到樣品的ORAC值，即達到每千克樣品的ORAC所需Trolox的量（mmol/kg）。ORAC值越高，則樣品抗氧化活性越強，抗氧化活性以Trolox當(dāng)量表示。

1.3.4.7 菌體比生長速率與代謝物質(zhì)比合成速率

菌體比生長速率（μm）是指菌體生長速率與菌體濃度之比，代謝物質(zhì)比合成速率（μp）是指代謝物質(zhì)合成速率與代謝物質(zhì)濃度之比，其計算分別見式（3）、（4）：

式中：x為不同發(fā)酵時間時菌體質(zhì)量濃度/（g/L）；y為不同發(fā)酵時間代謝物質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶搖瓶條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1α-淀粉酶添加量對納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶活力的影響

圖1 α-淀粉酶添加量對納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響Fig. 1 Effect of α-amylase addition on the production of nattokinase

如圖1所示，隨著α-淀粉酶添加量的增加，納豆激酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。未添加α-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基黏稠且流動性差，不利于納豆菌利用；添加α-淀粉酶后，蕎麥中淀粉被可控水解，更容易被納豆菌利用，納豆激酶活力從未添加α-淀粉酶時的420.12 U/mL提升到535.66 U/mL，故選擇α-淀粉酶添加量為0.4%。碳源供給菌體生命活動所需營養(yǎng)，對菌體產(chǎn)酶具有誘導(dǎo)或阻遏作用[17]。將麥芽糖或葡萄糖作為碳源時，納豆菌所產(chǎn)納豆激酶活力較高，以可溶性淀粉作為碳源時，納豆菌所產(chǎn)納豆激酶活力相對較低[18]。葡萄糖是易被吸收利用的碳源，屬于速效碳源，然而速效碳源在高濃度時可能會表現(xiàn)出阻遏作用；被菌體緩慢利用的碳源往往更有利于產(chǎn)物生成，尤其是次生代謝產(chǎn)物的合成，這是由于碳源的適中利用速率恰好滿足產(chǎn)物合成的需求[19]。因此，通過優(yōu)化碳源組成調(diào)控菌體產(chǎn)酶，是提高發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活力的重要途徑。α-淀粉酶可以快速將直鏈淀粉水解成麥芽糖和麥芽三糖，再將麥芽三糖水解成葡萄糖和麥芽糖[20]。通過對蕎麥淀粉進行適度水解優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源組成，可提高納豆激酶活力。

2.1.2 補充氮源對納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶活力的影響

納豆菌對氮源的選擇性較高，僅在以大豆蛋白胨為氮源時有較高的蛋白酶活力和納豆激酶活力，使用其他有機氮源時，菌體能生長，但酶活力相對較低[19]。大豆蛋白胨是大豆蛋白經(jīng)過酸、堿或酶水解而成的一種由肽類物質(zhì)、氨基酸組成的混合物，可大大加快酶的合成速率[21]。

表1 添加氮源對納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響Table 1 Effect of nitrogen sources on the production of nattokinase

如表1所示，大豆分離蛋白酶解物的水解度隨酶解時間延長而增加。3 種酶水解大豆分離蛋白所得酶解物水解度從高到低依次為胰酶＞NS37071＞復(fù)合蛋白酶。不同水解度的大豆分離蛋白酶解物作為補充氮源時，納豆激酶活力存在顯著性差異。然而，大豆蛋白酶解物的促產(chǎn)酶活力不隨其水解度的增加而增加。補充NS37071酶解產(chǎn)物，所得發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活力較補充胰酶/復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物高。不同蛋白酶促產(chǎn)酶活力不同，這可能是由于各種蛋白酶的酶切位點不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物組成不同[22]。補充NS37071酶解12 h時所制得的酶解物，發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活力可達595.64 U/mL，與添加商業(yè)大豆蛋白胨發(fā)酵所產(chǎn)納豆激酶活力無顯著性差異。

2.1.3 發(fā)酵時間對納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響

在發(fā)酵過程中，在產(chǎn)酶總量達到峰值時應(yīng)及時停止發(fā)酵，否則酶活力就可能會出現(xiàn)回落的現(xiàn)象[9]。如圖2所示，在發(fā)酵前期，納豆激酶活力隨發(fā)酵時間的延長不斷增加，至36 h，達到最高值；在發(fā)酵后期隨發(fā)酵時間的延長，納豆激酶活力逐漸降低。故選定36 h為最佳發(fā)酵時間。

圖2 發(fā)酵時間對納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on the production of nattokinase

納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶的揺瓶條件為蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，加入0.4%α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，補充NS37071酶解12 h時所制得酶解物為氮源，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0，裝液量10%，接種量3%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間36 h，酶活力從420.12 U/mL提升至756.96 U/mL。

2.2 2.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

圖3 通氣量（A）、轉(zhuǎn)速（B）、裝液量（C）、接種量（D）對納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響Fig. 3 Effects of ventilation (A), stirring speed (B), loading volume (C)and inoculum size (D) on the production of nattokinase

納豆菌發(fā)酵屬于極其好氧發(fā)酵，通氣量直接影響發(fā)酵罐中的溶氧。如圖3A所示，當(dāng)通氣量為2.0 L/min時，納豆激酶活力較低，隨著通氣量的增加，納豆激酶活力增加。因通氣量較大時容易起泡，選擇通氣量為3.5 L/min。攪拌速率直接影響培養(yǎng)基的溶氧，在通氣量不變的條件下，提高攪拌速率可以提高傳氧速率，但轉(zhuǎn)速過高，產(chǎn)生的剪切力可能損害微生物菌體，使菌體生長變緩，也可能影響產(chǎn)物活性[23]，選擇轉(zhuǎn)速300 r/min（圖3B）。裝液量增加至1.5 L時，納豆激酶活力降低，因此選擇裝液量為1.2 L（圖3C）。接種量對于發(fā)酵尤其是大規(guī)模發(fā)酵有重要影響，合適的接種量可以使微生物迅速增殖，減少雜菌污染機會，提高發(fā)酵效率；過大的接種量會導(dǎo)致細胞生長過快，造成有害物質(zhì)的大量積累和培養(yǎng)液黏度的改變，反而影響產(chǎn)物的合成[24]。隨接種量增加，納豆激酶活力呈先升高后降低的趨勢，因此選擇3%接種量（圖3D）。最終得到優(yōu)化后的發(fā)酵罐最佳條件為通氣量3.5 L/min、轉(zhuǎn)速300 r/min、裝液量1.2 L、接種量3%、發(fā)酵36 h，酶活力達到834.91 U/mL，相當(dāng)于152.5 FU/mL（為方便與文獻所報道的納豆激酶酶活力水平進行對比，采用紫外分光光度計法測定納豆激酶活力），與文獻[25-28]報道未經(jīng)過基因重組的納豆菌液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)納豆激酶活力（≤130.96 FU/mL）相比有一定的優(yōu)勢。

2.3 2.5 L發(fā)酵罐中菌體生長和代謝特性分析

自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨作為補充氮源時，在搖瓶條件下，納豆菌所產(chǎn)納豆激酶活力并無顯著性差異。然而，兩者的水解度、氨基酸組成與分子質(zhì)量分布不同。在菌體放大培養(yǎng)時，兩者可能會對菌體的生長和代謝有不同的影響。本實驗通過對比研究補充自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨時，2.5 L發(fā)酵罐中菌體生長和代謝特性，揭示自制大豆蛋白酶解產(chǎn)物作為補充氮源的優(yōu)勢。

2.3.1 氮源對納豆菌發(fā)酵過程生物量和比生長速率的影響

如圖4A所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨組均幾乎沒有延滯期，立即進入生長對數(shù)期，隨發(fā)酵時間延長，生物量快速增加。商業(yè)大豆蛋白胨組發(fā)酵18 h后緩慢生長趨于穩(wěn)定，在24 h時達到最大生物量（5.81 g/L）。而大豆分離蛋白酶解物組發(fā)酵前期生長速率較慢，但對數(shù)期較長，在30 h左右生物量趨于穩(wěn)定達到最大值（6.68 g/L）。

如圖4B所示，2 個組別的比生長速率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，商業(yè)大豆蛋白胨組在2.8 h時比生長速率最快（0.92 h－1），而大豆分離蛋白酶解物組在10.8 h時比生長速率最大（0.22 h－1）?？傮w而言，商業(yè)大豆蛋白胨作為補充氮源時，發(fā)酵前期菌體比生長速率更快，達到最大比生長速率時間提前，但后期動力不足?？赡苁且驗樗舛雀叩纳虡I(yè)大豆蛋白胨中小分子肽和氨基酸在發(fā)酵前期為納豆菌提供速效氮源，促進菌體生長，但后期培養(yǎng)基組成發(fā)生變化不利于納豆菌生長。

2.3.2 氮源對納豆菌發(fā)酵過程可溶性蛋白含量的影響

圖5 發(fā)酵過程中可溶性蛋白（A）及其比合成速率（B）的變化Fig. 5 Changes in soluble protein level (A) and its specific formation rate (B) during fermentation

如圖5A所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨組在發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量變化趨勢大致相同，均呈現(xiàn)先降低后略微增長的趨勢；隨著發(fā)酵過程中微生物對氮源的利用，體系內(nèi)可溶性蛋白含量逐漸減少，發(fā)酵后期可溶性蛋白有所增加，可能與發(fā)酵過程中酶蛋白的分泌與積累有關(guān)；如圖5B所示，可溶性蛋白的消耗速率先增加后減小，其中商業(yè)大豆蛋白胨組在發(fā)酵9.7 h時對可溶性蛋白的消耗速率最快（0.036 h－1），大豆分離蛋白酶解物組在發(fā)酵13.6 h時對可溶性蛋白的消耗速率最快（0.037 h－1）。

2.3.3 氮源對納豆菌發(fā)酵過程還原糖含量的影響

圖6 發(fā)酵過程中還原糖（A）及其比合成速率（B）的變化Fig. 6 Changes in reducing sugar level (A) and its specific formation rate (B) during fermentation

如圖6A所示，發(fā)酵液中糖類物質(zhì)逐漸被菌體利用，兩組還原糖含量均逐漸下降。大豆分離蛋白酶解物組在36 h還原糖含量趨于穩(wěn)定，即不再消耗碳源；而對于商業(yè)大豆蛋白胨組，24 h后還原糖含量趨于平穩(wěn)，說明納豆菌對碳源的消耗基本停止。從圖6B可知，大豆分離蛋白酶解物組在20.85 h還原糖比消耗速率最快（0.053 h－1），而商業(yè)大豆蛋白胨組在12 h后還原糖比消耗速率遠低于大豆分離蛋白酶解物組。商業(yè)大豆蛋白胨組對碳源的利用相對較少，且消耗速率較慢，使得發(fā)酵液中碳氮比發(fā)生較大變化，不利于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.3.4 氮源對納豆菌發(fā)酵過程pH值與溶氧的影響

圖7 大豆分離蛋白酶解物組（A）和商業(yè)大豆蛋白胨組（B）在發(fā)酵過程中pH值與溶氧的變化Fig. 7 Changes in pH and dissolved oxygen during fermentation with soy protein isolate hydrolysate (A), and commercial soybean peptone (B)as supplementary nitrogen source

如圖7所示，添加自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨組pH值變化趨勢整體上是一致的，初始pH 6.8左右，6 h左右降到最低值隨后上升，表明在前6 h，糖類被大量利用，分解成小分子酸、醇，使pH值迅速下降。隨著糖類的缺乏，開始大量利用氮源，氨基酸被利用后產(chǎn)生氨氣使pH值回升。溶氧量發(fā)酵初期急劇下降，因為高濃度發(fā)酵下菌體氧需求量大。特別是添加商業(yè)大豆蛋白胨組，溶氧下降速率更快，這是由于納豆菌快速生長需氧量急劇上升，與其比生長速率曲線相對應(yīng)（圖4B）。

2.3.5 氮源對納豆菌發(fā)酵過程納豆激酶活力的影響

圖8 發(fā)酵過程中發(fā)酵過程中納豆激酶活力（A）與產(chǎn)物比合成速率（B）的變化Fig. 8 Changes in nattokinase activity (A) and its specific nattokinase formation rate (B) during fermentation

如圖8A所示，商業(yè)大豆蛋白胨作為補充氮源時，24 h達到酶活力最高值（604.61 U/mL），之后酶活力急劇下降；而大豆分離蛋白酶解物組酶活力持續(xù)上升至36 h達到最大值（834.91 U/mL）才出現(xiàn)回落。從圖8B可知，商業(yè)大豆蛋白胨組產(chǎn)物比合成速率呈負增長，而大豆分離蛋白酶解物組納豆激酶比合成速率曲線呈鐘形曲線，在6 h左右達最大值0.41 h－1。自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨水解度、氨基酸組成與分子質(zhì)量分布不同，進而影響納豆激酶的合成速率。

2.3.6 氮源對納豆菌發(fā)酵過程酚類物質(zhì)及抗氧化物質(zhì)含量的影響

如圖9A所示，隨發(fā)酵時間延長，自制大豆蛋白酶解物與商業(yè)大豆蛋白胨組的總酚含量均逐漸增加，從初始的0.033 mg/mL分別增加到0.109 mg/mL（大豆分離蛋白酶解物組）和0.090 mg/mL（商業(yè)大豆蛋白胨組），說明酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中隨著菌體對蕎麥的利用逐漸溶出，而大豆分離蛋白酶解物組的總酚含量要高于商業(yè)大豆蛋白胨組，說明微生物對兩組中蕎麥的利用程度不同，后者酚類物質(zhì)溶出更多。如圖9B所示，兩組均呈現(xiàn)酚類物質(zhì)比生成速率呈先增加后減小的趨勢，在12 h左右達到最大速率。

谷物多酚、肽類物質(zhì)與微生物代謝產(chǎn)物是發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。如圖10A所示，隨著發(fā)酵時間的延長，兩組抗氧化物質(zhì)含量均增加，發(fā)酵36 h時，大豆分離蛋白酶解物組的抗氧化活性（27.43 μmol/mL）高于商業(yè)大豆蛋白胨組（22.71 μmol/mL），與發(fā)酵初期（16.69 μmol/mL）相比，抗氧化活性顯著提高。如圖10B所示，抗氧化物質(zhì)比生成速率均在6 h左右達到最大值，但大豆分離蛋白酶解物組抗氧化物質(zhì)比生成速率最大值（0.018 1 h－1）高于商業(yè)大豆蛋白胨組（0.014 8 h－1）。

圖9 發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)（A）及其比溶出速率（B）的變化Fig. 9 Changes in phenolics level (A) and its specific dissolution rate (B)during fermentation

圖10 發(fā)酵過程中抗氧化物質(zhì)（A）及其比生成速率（B）的變化Fig. 10 Changes in antioxidant activity (A) and its specific antioxidants formation rate (B) during fermentation

綜上所述，補充大豆分離蛋白酶解物時，納豆菌生長對數(shù)期較長，在30 h左右生物量趨于穩(wěn)定，達到最大值（6.68 g/L）；納豆菌對可溶性蛋白與還原糖的消耗量較大，在36 h趨于平穩(wěn)；納豆激酶活力持續(xù)上升至36 h達到最大值，為834.91 U/mL（152.5 FU/mL），遠高于補充商業(yè)大豆蛋白胨組（酶活力提高38%）；酚類物質(zhì)比溶出速率在12 h達到最大值，抗氧化物質(zhì)比生成速率在6 h達到最大值，發(fā)酵36 h時，發(fā)酵產(chǎn)物中酚類物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)含量分別達到0.109 mg/mL及27.43 μmol/mL，遠高于補充商業(yè)大豆蛋白胨組。

3 結(jié) 論

納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶2.5 L發(fā)酵罐最優(yōu)條件為蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打漿，加入0.4% α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，補充NS37071酶解12 h時所得酶解物，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0，接種量3%，通氣量3.5 L/min，轉(zhuǎn)速300 r/min，裝液量1.2 L，發(fā)酵36 h。

以蕎麥為原料，通過常溫浸泡、加水打漿、聯(lián)合耐高溫α-淀粉酶的前處理方法，獲得以蕎麥為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基。采用酶法制備大豆蛋白酶解產(chǎn)物，作為補充氮源添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，通過優(yōu)化納豆菌液態(tài)發(fā)酵條件，可制備具有高納豆激酶活力（152.5 FU/mL，與商業(yè)大豆蛋白胨組相比酶活力提高38%）、富含谷物多酚（0.109 mg/mL）且具有強抗氧化活性（27.43 μmol/mL）的發(fā)酵產(chǎn)物。