毛細管區(qū)帶電泳法檢測硝苯地平

張 劍， 張 博， 韓 祿， 楊 陽， 劉春葉

(西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安 710021)

硝苯地平是第一代二氫吡啶類鈣通道阻滯藥，其化學性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解。在臨床應(yīng)用中，硝苯地平具有抑制鈣離子內(nèi)流作用，可增加冠脈血流量，降低外周血管阻力。在心血管疾病方面，主要用于治療高血壓。此外，硝苯地平還可用于治療穩(wěn)定型和變異型心絞痛、暈動病、偏頭痛、抑制癌癥的擴散等。同時，硝苯地平具有作用快而強、療效確切、毒副作用小等特點[1 - 2]。常用硝苯地平含量的測定方法有：鈰量法[3]、紫外-可見分光光度法[4]、高效液相色譜法[5 - 7]等。此外，還有文獻報道使用活化玻碳電極電化學法[8]、流動注射-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]等方法測定硝苯地平含量。

毛細管電泳法具有簡便、快速、高效、樣品用量少、分析成本低，近年來發(fā)展迅速，已被廣泛應(yīng)用于藥物含量測定。目前，尚未有人采用毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)測定硝苯地平含量。本實驗擬建立CZE法測定硝苯地平含量的分析方法，希望可以對其他藥物含量測定新方法的建立提供參考[11 - 12]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BeckmanP/ACEMDQ毛細管電泳儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司北京分公司)，配二極管陣列檢測器(DAD)；熔融石英毛細管(60 cm×50 μm i.d.,有效長度為50 cm；河北永年銳灃色譜器件有限公司)；PB-10型pH計(德國，賽多利斯股份有限公司)；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

硝苯地平對照品(中國藥品生物制品檢定所，約100 mg)；NaH2PO4(≥99.0%)，Na2HPO4(≥99.0)(天津市紅巖化學試劑廠)；其余試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。樣品溶液及緩沖溶液使用前均用0.45 μm濾膜過濾。

硝苯地平緩釋片分別購自陜西步長高新制藥有限公司，南京白敬宇制藥有限公司，山西云鵬制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1毛細管的預(yù)處理及平衡新毛細管在使用前分別用水、1 mol/L NaOH溶液、水、1 mol/L HCl、水依次沖洗10、30、15、30、15 min。為了確保實驗的重現(xiàn)性，每兩次運行之間依次用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水、緩沖溶液各沖洗5、5、5、3 min。運行緩沖溶液為20 mmol/L磷酸鹽溶液(pH=8.0)，電動進樣3.45 kPa×5 s，分離電壓20.0 kV，檢測波長254 nm。

1.2.2實際樣品中硝苯地平的含量測定(1)CZE法測定硝苯地平含量:取4個不同批號(批號分別為：C130104、120101、F160910、160302)的硝苯地平片劑各10片，稱量后計算平均片重，分別研磨后，各稱取硝苯地平粉末2 mg。制備硝苯地平供試品溶液，每個供試品溶液配制好后用0.45 μm的微孔濾膜過濾，進行電泳分離，重復(fù)3次，記錄峰面積平均值，代入標準曲線計算其濃度，進一步得到進樣硝苯地平的質(zhì)量，根據(jù)硝苯地平的平均片重可計算出每片藥物中含有硝苯地平的質(zhì)量。(2)紫外-可見分光光度法測定硝苯地平含量：根據(jù)《中國藥典》二部(2005版)的方法，取硝苯地平片劑20片，稱量后研磨，稱取硝苯地平粉末適量(大概相當于含有硝苯地平30 mg)，用三氯甲烷溶解，溶解后用無水乙醇定容，取濾液5 mL定容至50 mL容量瓶中，在333 nm波長處測定溶液的吸光度，依據(jù)公式[13]計算硝苯地平含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作曲線

在1.2.1電泳條件下，硝苯地平對照品溶液與供試品溶液的電泳圖譜如圖1所示?？梢钥闯觯醣降仄匠龇鍟r間約為4.8 min，其理論塔板數(shù)分別為21654、17339。在此條件下硝苯地平分離效率較好，可保證整個實驗穩(wěn)定運行。

圖1 硝苯地平標準品(A)與供試品(B)電泳譜圖Fig.1 Electropherograms of nifedipine standard(A) and nifedipine sample(B)

配制系列硝苯地平標準溶液，按優(yōu)化后CZE條件測定，以硝苯地平的峰面積為縱坐標(y)，其濃度(x)為橫坐標進行線性擬合，得回歸方程:y=55633x+1019.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9998(n=5)。硝苯地平溶液濃度在0.03～0.11 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 加標回收率

精確吸取已知濃度的硝苯地平溶液9份，每份約相當于硝苯地平0.1118 mg，分別準確加入硝苯地平對照品儲備液(質(zhì)量為0.0590、0.1118、0.1677 mg(各3份))，制成低、中、高3種加標濃度的溶液。測定結(jié)果如表1所示，平均回收率分別為105.84%、104.60%、98.04%，能保證實驗的準確性。

2.3 精密度考察

準確吸取對照品儲備液70 μL，連續(xù)進行6次測定，計算峰面積的相對標準偏差(RSD)，得日內(nèi)峰面積RSD值為2.1%(n=6)；每天按照上述電泳條件運行3次，平行實驗5 d，得日間峰面積的RSD值為1.4%(n=5)。表明該方法的精密度較高，重現(xiàn)性良好。

2.4 重復(fù)性考察

將批號為C130104的硝苯地平片劑研磨，研細后稱取2 mg，平行配制5份供試品溶液進行測定，計算峰面積RSD值。實驗結(jié)果表明峰面積的RSD值為4.3%(n=5)，方法重復(fù)性良好。

表1 硝苯地平加樣回收率實驗

2.5 穩(wěn)定性考察

稱取批號為C130104的硝苯地平，配制供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h條件下進行測定，計算得峰面積RSD值為5.5%(n=5)，表明硝苯地平供試品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。此外，實驗中所配制的硝苯地平對照品儲備液應(yīng)置于棕色瓶中，并置于冰箱中保存，以免其見光分解。

2.6 實際樣品含量測定

硝苯地平CZE法含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，批號為C130104、F160910、160302的硝苯地平片劑均符合標注規(guī)格，而批號為120101的硝苯地平含量低于標注規(guī)格。截至測試時間(2017年4月)，批號為120101的硝苯地平片劑于2013年已經(jīng)過期，批號為C130104的硝苯地平片劑于2016年過期?？梢?，隨著硝苯地平片劑存放時間增加，硝苯地平的含量也會隨之呈現(xiàn)下降趨勢；同時，實驗也對此4個批號的硝苯地平按照《中國藥典》二部(2005版)方法進行了測定(表2)。結(jié)果顯示，4個批號的硝苯地平含量均符合標注規(guī)格，兩種測量方法相比較，測定結(jié)果差值范圍在0.06～0.479 mg(0.57%～4.78%)之間，差異性較小。因此本文所建立的CZE測定新方法，可作為一種硝苯地平片劑質(zhì)量控制的有效方法。

表2 硝苯地平含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了一種測定硝苯地平含量的毛細管區(qū)帶電泳法，采用該方法對4個不同批號的硝苯地平片劑進行含量測定，其中有3個批號的硝苯地平片劑符合標注規(guī)格，而不符合標注規(guī)格的硝苯地平片劑過期時間較長。通過比較可以看出，硝苯地平藥物的存放時間越長會使其含量減少，同時該實驗所建立的毛細管電泳測定新方法與藥典的紫外-可見分光光度法的測定結(jié)果差異較小(0.57%～4.78%)，說明毛細管區(qū)帶電泳法可作為一種硝苯地平片劑質(zhì)量控制的有效方法。