曹 君，王 紅，張 敏，劉俊杰，呂立濤

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161）

羊肚菌（MorchellaDill. Ex Pers.∶ Fr.）是可形成大型子實(shí)體的食藥用真菌，屬子囊菌門（Ascomycata）盤菌亞門（Pezizomycotina）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，因其子囊果表面呈現(xiàn)不規(guī)則的凹陷，形似羊肚而得名，羊肚菌味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是一種珍稀的食用菌品種，同時(shí)在中醫(yī)記載中也可以作為藥用菌。李時(shí)珍《本草綱目》（菜部二十八卷，菜之五，蘑菰蕈）記載“……一種狀如羊肚，有蜂窠眼者，名羊肚菜”，主要功能為“益腸胃，化痰理氣”。劉波《中國藥用真菌》記載羊肚菌“益腸胃，化痰理氣。治消化不良，痰多氣短”[2]。

羊肚菌在北美、亞洲、歐洲均有分布，在中國大部分區(qū)域也有廣泛的分布。遼寧地區(qū)羊肚菌研究起步較晚，以野生資源分布研究為主，主要記錄地點(diǎn)集中于朝陽、沈陽、遼陽以及東部山區(qū)，成為當(dāng)?shù)刂匾恼湎∈秤镁Y源[3-6]。近年來，部分經(jīng)選育后的南方羊肚菌品種進(jìn)入遼寧，在溫室大棚中實(shí)現(xiàn)了羊肚菌人工栽培。但是由于栽培面積、場地和技術(shù)所限，現(xiàn)有可人工栽培的羊肚菌產(chǎn)量有限，且栽培產(chǎn)品的風(fēng)味、口感以及價(jià)格等與遼寧野生羊肚菌差距較大，因而尚未見遼寧本地野生菌種實(shí)現(xiàn)人工栽培成功的報(bào)道。

為解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類造成的同種異名和同名異種問題，DNA分子標(biāo)記被引入應(yīng)用于食用菌遺傳多樣性分析。其中基于PCR技術(shù)的ITS序列分析和ISSR多態(tài)性分析等技術(shù)由于其特異性優(yōu)良、準(zhǔn)確性較高以及操作較為簡便等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用。ITS序列是rDNA基因中，5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列，其相對進(jìn)化速度較快，作為分子標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于真菌的親緣關(guān)系分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。Wipf等[7-8]對羊肚菌屬部分種的ITS序列的多態(tài)性進(jìn)行分析，并以此為依據(jù)將區(qū)分出黑色和黃色2個(gè)羊肚菌復(fù)合群。杜習(xí)慧[9-11]等利用包括ITS序列在內(nèi)的多基因譜系一致性系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種識別法（genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR），首次系統(tǒng)地進(jìn)行了中國范圍內(nèi)羊肚菌資源的系統(tǒng)發(fā)育研究，并確定了中國分布的30個(gè)羊肚菌物種，包括11種未命名物種。此外，許多研究均證明ITS序列對于不同區(qū)域范圍內(nèi)羊肚菌野生或栽培資源的分類鑒定具有重要作用[12-16]。ISSR技術(shù)是由SSR技術(shù)發(fā)展而來，具有模板質(zhì)量要求低、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行種內(nèi)個(gè)體遺傳差異性分析。劉文叢等[17]通過ISSR聚類分析將云南西北地區(qū)11個(gè)羊肚菌種群56個(gè)樣品分為三大組，證明不同的分組與地理距離有明顯的相關(guān)性。魏巍等[18]對四川地區(qū)16個(gè)野生羊肚菌樣品進(jìn)行ISSR聚類分析，并發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景個(gè)體的代謝產(chǎn)物或活性物質(zhì)存在明顯的差異。

本研究綜合運(yùn)用ITS序列分析和ISSR多態(tài)性分析技術(shù)，在分子水平上研究遼寧地區(qū)引進(jìn)的羊肚菌人工栽培菌種和本地野生菌種之間的遺傳多樣性，為擴(kuò)大羊肚菌人工栽培菌種范圍，合理開發(fā)和保護(hù)遼寧野生羊肚菌資源，實(shí)現(xiàn)遼寧野生品種人工栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人工栽培羊肚菌樣品為2015年～2016年于北鎮(zhèn)、蘇家屯、岫巖、寬甸等地日光溫室中采集，共收集樣品15株。野生羊肚菌樣品為2016年～2017年從遼寧省野生羊肚菌主要產(chǎn)區(qū)朝陽、凌源、康平以及沈陽東陵地區(qū)等地采集，共收集野生樣品14株，見表1，樣品采集后置于密封袋中低溫保存。

表1 野生羊肚菌樣品采集信息Tab.1 Information of Morchella samples collcted

1.2 總DNA提取

取子囊菌菌蓋內(nèi)部組織0.3 g左右，低溫充分研磨后，采用E.Z.N.A. Fungal DNA Kit試劑盒提取總DNA，提取物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分裝，于-20℃條件下保存。

1.3 ITS序列擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析

ITS序列PCR擴(kuò)增建立20 μL的PCR反應(yīng)體系，如表2所示。其中2條PCR引物分別為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性4 min，然后95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送檢目的條帶進(jìn)行測序。根據(jù)ITS測序結(jié)果利用Mega 6.0軟件進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab.2 PCR reaction system

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析

ISSR多態(tài)性分析PCR擴(kuò)增建立20 mL的PCR反應(yīng)體系，如表2所示。根據(jù)武冬梅[19]所用引物進(jìn)行進(jìn)一步的多態(tài)性篩選，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳結(jié)果通過人工分辨統(tǒng)計(jì)條帶，其中清晰度高、重復(fù)性好、分辨率高的條帶可以用于ISSR多態(tài)性分析。在Excel表格中將圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料，即通過“0/1”表型數(shù)據(jù)矩陣的二元數(shù)據(jù)模型來表現(xiàn)ISSR擴(kuò)增結(jié)果，每條可閱讀到的條帶可視為一個(gè)等位基因賦值為1，不同樣品中同一位置無條帶的賦值為0，由此建立原始數(shù)據(jù)矩陣，從中篩選具有足夠多態(tài)性的ISSR引物。獲得的高多態(tài)性ISSR數(shù)據(jù)，應(yīng)用NTSYS-pc 2.1軟件計(jì)算樣品之間的相似系數(shù)，并進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS分子鑒定

試驗(yàn)樣品提取總DNA經(jīng)ITS序列擴(kuò)增測序后，所得數(shù)據(jù)與羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫MorchellaMLST（http∶//www.cbs.knaw.nl/morchella/）進(jìn)行比對，15株栽培菌株屬于黑色系羊肚菌類群的Morchella sextelata（Mel-6）、Morchella septimelata（Mel-7）和Morchella importuna（Mel-10），而 14株野生菌株也均為羊肚菌屬物種，屬于黃色系的Morchellasp.（Mes-6）和Morchellasp.（Mes-9）。應(yīng)用 mega 6.0軟件，以肋狀皺盤菌Disciotis venosa（Pers.）Boud為外群，bootstrap次數(shù)1 000，采用最大似然法（maximum likelihood methods，ML）進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

從圖1可見，15株栽培菌株與14株野生菌株完全分離。其中栽培菌株中Y15Z001、Y16Z003、Y16Z007、Y16Z009和 Y16Z016與Mel-10聚 為 一支（bootstrap值100%），證明這5株栽培羊肚菌均在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類上為梯棱羊肚菌（Morchella importuna，Mel-10）；菌株Y16Z017與Mel-7聚為一支（bootstrap值98%），證明為七妹羊肚菌（Morchella septimelata，Mel-7）；其余9株栽培菌株均與Mel-6聚為一支（bootstrap值94%），證明為六妹羊肚菌（Morchella sextelata，Mel-6）。野生羊肚菌樣品中，6S2、7C1、7C2、7C3、7C4、7S1、7S2、7S3、7S4、7S5與Mes-6聚為一支（bootstrap值95%），而6A1、6S1、6S3和6S4與Mes-9聚為一支（bootstrap值87%）。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

ISSR引物通過進(jìn)行穩(wěn)定性、特異性和重復(fù)性篩選，其中12條引物的擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性較好且條帶較為清晰。同過對已收集到的29個(gè)羊肚菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，12條引物共獲得114個(gè)位點(diǎn)，片段大小分布在300 bp～2 000 bp，其中具多態(tài)性的位點(diǎn)106個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的93.0%，每條引物多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為5個(gè)～12個(gè)，平均8.83個(gè)，見表3。

2.3 ISSR聚類分析

應(yīng)用NTSYS-2.10e軟件對采集的14株羊肚菌野生菌株和15株栽培菌株的ISSR擴(kuò)增結(jié)果合并進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖如圖2所示，相關(guān)性系數(shù)r=0.93136，聚類結(jié)果較好。

表3 用于ISSR分析的12條引物及其擴(kuò)增位點(diǎn)Tab.3 12 primers a and their amplification sites for ISSR

圖2 羊肚菌ISSR分析遺傳聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram based on result of the ISSR

由圖中2可見，在相似水平在37%左右時(shí)，供試樣本分為野生和栽培2個(gè)大類群。在栽培類群中，相似水平43%左右時(shí)，收集的栽培菌株分為2個(gè)亞類群，Y15Z001、Y16Z003、Y16Z007、Y16Z009、Y16Z016和Y16Z017為聚為一支，其中Y16Z017在相似水平42%左右時(shí)又與該亞類群中其他5株樣品分開，而其他9株栽培菌株樣本在相似水平57%左右時(shí)仍然聚為一支。這一結(jié)果與ITS序列分析中Mel-10、Mel-7和Mel-6三種人工栽培羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育種分類結(jié)果相同。

野生菌株中，相似水平50%左右時(shí)，分為2個(gè)亞類群，7S3、7S5、7S2、7S1、7S4、7C3、7C4、7C1和7C2聚為一個(gè)亞類群，其中7S1和7S2在相似水平達(dá)到97%時(shí)仍然聚為一支，遺傳相似性最大，說明這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系最近。而6S4、6S1、6S3、6S2和6A1在相似水平68%左右時(shí)仍然聚為一支。

綜合基于ITS序列構(gòu)建的ML樹和基于ISSR多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建的UPGMA聚類分析結(jié)果，二者均表明遼寧地區(qū)的野生羊肚菌資源與現(xiàn)有栽培品種具有明顯的差異，遺傳相似性較低。栽培菌株中，兩種遺傳標(biāo)記均可以對Mel-6、Mel-7和Mel-10進(jìn)行區(qū)分，但是ML系統(tǒng)發(fā)育樹中三者間分枝的bootstrap值較低（≤80%），且ISSR聚類分析中Mel-7和Mel-6相似性較高，與ITS數(shù)據(jù)分析存在差異，表明在數(shù)據(jù)上仍存在一定的爭議性。而野生菌株樣品劃分出的兩個(gè)亞類群中，6S2在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中歸于Mes-6，而在ISSR數(shù)據(jù)分析中與6A1、6S1、6S3和6S4（Mes-9）相似性更高，表現(xiàn)出較大的差異性，這可能是與兩種遺傳標(biāo)記進(jìn)化速度的差異有關(guān)。

3 結(jié)論

根據(jù)杜習(xí)慧[20]等觀點(diǎn)，中國羊肚菌分為黑色和黃色2個(gè)復(fù)合群，現(xiàn)有的可實(shí)現(xiàn)人工穩(wěn)定栽培的Mel-6（六妹）、Mel-7（七妹）和Mel-10（梯棱）等均屬于黑色羊肚菌復(fù)合群，而遼寧地區(qū)野生羊肚菌則屬于黃色羊肚菌類群。近幾年來，由于羊肚菌市場價(jià)格遠(yuǎn)高于香菇、木耳等傳統(tǒng)食用菌品種，羊肚菌的人工栽培成為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新熱點(diǎn)。遼寧地區(qū)的種植面積也在不斷地?cái)U(kuò)大，但所用的黑色野生羊肚菌組織分離菌種均原產(chǎn)于四川等地，由于生境變化劇烈，這些未經(jīng)過人工改良或選育的菌種，在日光溫室條件下也容易因外界氣候變化等因素造成生產(chǎn)過程中病害嚴(yán)重、子實(shí)體品質(zhì)下降等問題。因此亟需充分利用本地野生羊肚菌資源，經(jīng)馴化和改良后進(jìn)行人工栽培，從而滿足遼寧地區(qū)羊肚菌的生產(chǎn)需求。本研究為實(shí)現(xiàn)本地野生羊肚菌資源的合理利用，選育適合遼寧地區(qū)環(huán)境特征的羊肚菌品種做好基礎(chǔ)準(zhǔn)備和技術(shù)支撐。

本研究利用DNA分子標(biāo)記對遼寧省內(nèi)15株羊肚菌樣本及14株野生資源樣本進(jìn)行了分類鑒定和遺傳多樣性分析。綜合基于ITS序列構(gòu)建的ML樹和基于ISSR多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建的UPGMA聚類分析結(jié)果，證明了與引種自四川等地的栽培菌株相比，遼寧地區(qū)野生羊肚菌具有非常大的遺傳差異性。表明遼寧地區(qū)的野生羊肚菌資源與現(xiàn)有栽培品種具有明顯的差異，遺傳相似性較低。栽培菌株中，兩種遺傳標(biāo)記均可以對Mel-6、Mel-7和Mel-10進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果與杜習(xí)慧等人研究結(jié)果相似。但是ML系統(tǒng)發(fā)育樹中三者間分枝的bootstrap值較低（≤80%），且ISSR聚類分析中Mel-7和Mel-6相似性較高，與ITS數(shù)據(jù)分析存在差異，表明在數(shù)據(jù)上仍存在一定的爭議性。需要在后續(xù)研究中引入ef1-α、rpb和LSU rDNA等遺傳標(biāo)記進(jìn)行多基因聯(lián)合分析，提高遺傳信息的分析精度。而野生菌株樣品劃分出的2個(gè)亞類群中，6S2在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中歸于Mes-6，而在ISSR數(shù)據(jù)分析中與6A1、6S1、6S3和6S4（Mes-9）相似性更高，表現(xiàn)出較大的差異性，這可能是與兩種遺傳標(biāo)記進(jìn)化速度的差異有關(guān)，還可能是ISSR多態(tài)性位點(diǎn)對于所選樣本基因覆蓋程度不足造成的，在后續(xù)試驗(yàn)中需要進(jìn)一步篩選更多、更為合適的ISSR多態(tài)性位點(diǎn)。