李朵璐，張待娣，楊 盟，柴玉娜

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中較為難治的特殊類型，具有雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體免疫組化標(biāo)記均為陰性的特點。TNBC的病因至今尚未明確，腫瘤細(xì)胞免疫逃逸是目前公認(rèn)的治療障礙。近年來發(fā)現(xiàn)，以程序性死亡-1因子(programmed death-1, PD-1)及其配體(programmed death ligand 1, PD-L1)為阻斷靶點進(jìn)行免疫治療，能夠抑制TNBC化療耐藥[1-2]。中醫(yī)學(xué)治療TNBC的關(guān)鍵在于益氣健脾。已有研究證明：益氣健脾方藥四君子湯可顯著提高乳腺癌患者的生存質(zhì)量[3]，調(diào)節(jié)乳腺癌患者的免疫系統(tǒng)功能，主要成分能夠降低PD-L1表達(dá)[4]。本研究以前期實驗篩選出的PD-L1高表達(dá)TNBC細(xì)胞為研究對象，觀察四君子湯對細(xì)胞增殖、凋亡及免疫相關(guān)因子PD-L1表達(dá)的影響，以期為深入研究TNBC的發(fā)病機制、尋找可能的藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人三陰性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞均使用含體積分?jǐn)?shù)100 mL/L 胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓及甘草4種中藥組成。藥材購自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，加入10倍體積純水浸泡1 h，然后煎煮提取1.5 h，紗布過濾收集濾液，靜置沉淀取上清液，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用烘干箱干燥，得到干粉。四君子湯提取干粉采用高效液相色譜進(jìn)行質(zhì)量控制。使用前用天平稱取四君子湯干粉10 mg，用5 mL培養(yǎng)基配成高劑量(2 g/L)溶液，用無菌濾膜過濾后用培養(yǎng)基依次梯度稀釋成中劑量(1 g/L)溶液和低劑量(0.1 g/L)溶液。紫杉醇(Paclitaxel，10 mM)，購自MCE公司。先將紫杉醇用DMSO稀釋成10 μM 的母液儲存，使用前再加入培養(yǎng)基稀釋至5 nM。 細(xì)胞增殖/毒性實驗(cell counting kit-8,CCK8)試劑盒,購自US Everbright 公司，Cat.No.C6005-500T，Lot.No.FC0720；FITC Annexin V/ PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自GeneCopoeia公司，Cat. No. A026，Lot. No. A2K1626。Odyssey CLX型紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司產(chǎn)品；MK3型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices分子儀器有限公司產(chǎn)品；FACSCanto II型流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的TBNC細(xì)胞MDA-MB-231接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度，每孔體積100 μL，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、50 mL/L CO2)培養(yǎng)；待細(xì)胞完全貼壁后，分別更換含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)的四君子湯提取物和紫杉醇，以及不含二者的培養(yǎng)液100 μL；分別在孵育24，48，72 h后，加入10 μL CCK-8溶液。另設(shè)調(diào)零孔，每組5個復(fù)孔，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度OD值，計算出各組細(xì)胞抑制率。抑制率=[(對照組OD值-本底OD值)-(給藥組OD值-本底OD值)]/(對照組OD值-本底OD值)×100%。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用FITC Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。選擇處于對數(shù)生長期的TBNC細(xì)胞MDA-MB-231接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁完全后，加入含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)的四君子湯提取物和紫杉醇，以及不含二者的培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。根據(jù)以下步驟操作：①用不含EDTA 的胰酶消化后，300×g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。②準(zhǔn)備陽性實驗對照組，使用合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時準(zhǔn)備未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為空白對照組。③用 4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300×g，4 ℃離心 5 min。④配制 1×Annexin-binding buffer。用去離子水按1∶5稀釋5×Annexin-binding buffer(組份C)(2 mL 5×Annexin-binding buffer+8 mL 去離子水)。⑤用 1×Annexin-binding buffer 重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106細(xì)胞/mL。⑥取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC Annexin V(組份 A)和 1～2 μL PI(組份B)，輕輕混勻。⑦室溫、避光、反應(yīng) 15 min。⑧加入400 μL 1×Annexin-binding buffer，輕柔混勻，冰上放置。⑨在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。FITC Annexin V綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測；PI 紅色熒光通過 PI 通道(FL2 或 FL3)檢測。

1.3.3 Western blotting檢測細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平

用細(xì)胞裂解液處理高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1g/L)四君子湯提取物和紫杉醇培養(yǎng)的TBNC細(xì)胞MDA-MB-231，提取總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度；取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，70 ℃變性10 min，聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉1h后依次加入相應(yīng)的一抗和二抗孵育。室溫下TBST漂洗孵育過的條帶3次，每次5 min。使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231抑制率對比

各時間點抑制作用以紫杉醇組最為顯著；四君子湯各劑量組，在72 h時抑制作用最明顯，但即使是高劑量四君子湯組，抑制率也顯著低于紫杉醇組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231抑制率對比

組別 劑量24 h抑制率/%48 h抑制率/%72 h抑制率/%空白對照組----紫杉醇組5 nM8.1629.5849.88四君子湯高劑量組2.0 g/L3.337.9210.21四君子湯中劑量組1.0 g/L0.451.172.97四君子湯低劑量組0.1 g/L0.050.080.12

2.2 各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231凋亡率對比

空白對照組、紫杉醇組、四君子湯高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1 g/L)組的MDA-MB-231凋亡率依次是12.23%、21.40%、24.25%、16.90%、15.37%。與空白對照組對比，四君子湯高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A.空白細(xì)胞組；B.四君子湯低劑量組；C.四君子湯中劑量組；D.四君子湯高劑量組；E.紫杉醇組圖1 藥物處理48 h后各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231凋亡率

2.3 各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中PD-L1表達(dá)對比

與空白對照組對比，四君子湯高(2 g/L)、中(1 g/L)、低劑量(0.1g/L)組PD-L1表達(dá)量均有所降低，其中四君子湯高劑量組較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

與空白對照組對比，*P<0.05圖2 藥物處理48 h后各組TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中PD-L1表達(dá)

3 討 論

三陰性乳腺癌由于具有特殊的免疫表型，對大多數(shù)內(nèi)分泌治療及針對HER2過表達(dá)、雌孕激素受體表達(dá)陽性的乳腺癌的靶向治療不敏感，目前臨床以化療為主，5年生存率<15%，預(yù)后較其他類型乳腺癌差[5]。免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞逃避機體殺傷作用的重要途徑。和正常人相比，腫瘤患者外周血單核細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量均會減少，同時，這些免疫細(xì)胞的功能和活性也會下降，例如細(xì)胞毒活性、細(xì)胞因子的分泌，以及抗原加工與提呈細(xì)胞能力。隨著腫瘤的動態(tài)發(fā)展，免疫細(xì)胞的特殊成分和性質(zhì)發(fā)生高強度的動態(tài)變化而形成的腫瘤微環(huán)境會不斷變化[6]。越來越多的研究證明，免疫逃逸相關(guān)分子對判斷TNBC的預(yù)后和預(yù)測其治療靶標(biāo)有重要作用。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞作為免疫逃逸的重要參與者，其表面的CD4/CD8比例變化對TNBC預(yù)后有指導(dǎo)價值[7]。TNBC中免疫抑制性代謝物吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO1)的表達(dá)能較好反應(yīng)腫瘤的突變量，阻斷IDO1通路可能成為該病有效的治療途徑[8]；跨膜粘蛋白MUC1能夠作用于NF-κB及CD8+T細(xì)胞等途徑抑制TNBC細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)[9]。這些最新研究均提示免疫逃逸分子在TNBC靶向治療中的重要意義。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，TNBC細(xì)胞系中PD-L1高表達(dá)，降低PD-L1的表達(dá)能夠增加乳腺癌耐藥細(xì)胞的藥物敏感性?，F(xiàn)在越來越多的實驗研究表明，中藥可以干預(yù)乳腺癌的免疫效應(yīng)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，健脾補腎方、疏肝健脾方等能夠影響IFN-γ、IL-2、TGF-β，以及腫瘤細(xì)胞的凋亡，CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、Treg等淋巴細(xì)胞的分化，對抑制腫瘤細(xì)胞免疫耐受有明顯作用[10-11]。徐川等的研究顯示，益氣健脾方能夠?qū)θ橄侔┟庖吣褪苡休^好的改善作用[12]。以上研究表明，益氣健脾在本質(zhì)上和西醫(yī)學(xué)降低腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、提高機體免疫力的認(rèn)識是一致的。健脾益氣方四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，具有補益氣血、益氣健脾之功效。方中人參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃。臣以苦溫之白術(shù)，健脾燥濕，加強益氣助運之力。佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術(shù)相配，則健脾祛濕之功益著。使以炙甘草，益氣和中，調(diào)和諸藥。四藥配伍，共奏益氣健脾之效。最新研究發(fā)現(xiàn)：四君子湯中君藥人參能夠抑制乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長，能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[13-14]，對免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫因子均有調(diào)控作用[15]，并能夠抑制PD-L1的表達(dá)[16]。本研究中，四君子湯雖然對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用，但是流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，高劑量四君子湯具有能夠誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。

此外，本研究觀察了不同劑量的四君子湯對三陰性乳腺癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：四君子湯高、中、低劑量組PD-L1表達(dá)量均有所降低。PD-1是TNBC發(fā)生免疫逃逸的重要參與者，以PD-1和其配體PD-L1為阻斷靶點是TNBC免疫治療領(lǐng)域的重要突破。通過應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生，增強機體免疫力。有研究表明，在乳腺癌小鼠模型及乳腺癌患者中，應(yīng)用PD-1抑制劑顯示了較好的抗腫瘤活性[17-18]。因此，TNBC在目前缺少明顯的靶向藥物和化療耐藥的情況下，以增強和調(diào)控患者免疫功能的免疫療法具有潛力。本研究為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥治療TNBC的作用機制、探索TNBC的靶向治療奠定了實驗基礎(chǔ)。