李文謙，施凱楠，朱星揚，茅燕勇

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003）

磷是作物產(chǎn)量形成和品質(zhì)保證的重要因素，影響著世界上很多國家的農(nóng)業(yè)發(fā)展[1,2]。只有那些溶解在水中的磷，才能被植物吸收利用，而在土壤栽培過程中由于磷的吸附和固定作用的存在，使得磷化肥的被作物利用的效率非常低，產(chǎn)生了一系列資源浪費問題[3-5]。在土壤磷元素轉(zhuǎn)化過程中，通過使用解磷微生物來溶解磷礦粉產(chǎn)生可溶磷，在目前看來能夠改善磷元素缺乏地區(qū)作物生長情況，同時能夠合理利用我國現(xiàn)有的磷礦資源，以減少資源浪費的情況，保持了土壤的肥沃性，還能達(dá)到節(jié)能減排的目的[6-8]。

我國的磷礦資源雖然豐富，但在品質(zhì)上卻以產(chǎn)出中低品位磷礦粉為主[9,10]，充分利用這些中低品位的磷礦粉，將其中的磷元素釋放出來，對我國磷礦資源的利用具有重要的意義。為此，本文以實驗室篩選自果園的解磷菌作為研究對象，通過試驗確定解磷菌對中低品位磷礦粉的最佳溶解工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和磷礦粉

菌株P(guān)R17為實驗室篩選的解磷真菌。

中低品位磷礦粉，購買自濟南榮冠化工有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水 1000 mL。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL。

1.2 方法

試驗在裝有50 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行，同時加入0.25 g中低品位磷礦粉，作為培養(yǎng)基中的磷源，將分離的細(xì)胞懸液按培養(yǎng)基液體體積比的10%接種到每個三角瓶中。緊接著放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃、0.1 MPa下，滅菌20 min。然后放入28℃的恒溫?fù)u床中，把振蕩速率調(diào)成180 r/min培養(yǎng)5 d。最后取樣，測定培養(yǎng)基液體中可溶性磷的含量。試驗重復(fù)3次。

1.2.1 培養(yǎng)時間對解磷菌溶磷能力的影響

設(shè)置7個初始條件全部相同的平行樣，分別于第1、2、3、4、5、6、7 d 取樣，測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量。

1.2.2 初始pH對解磷菌溶磷能力的影響

通過調(diào)節(jié)磷礦粉培養(yǎng)基的初始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，在接種后的第5 d進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.3 培養(yǎng)溫度對解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時搖床培養(yǎng)溫度設(shè)定為20、23、25、28、31 ℃，在接種后第 5 d進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.4 接種量對解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株按照接種量體積的1%、3%、5%、7%和10%接種到磷礦粉培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在接種后的第5 d對培養(yǎng)基進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.5 振蕩速率對解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時搖床振蕩速率設(shè)定為120、140、160、180、200 r/min，在接種后的第 5 d 進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.6 磷礦粉濃度對解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時的磷礦粉濃度分別設(shè)置為3.5、4、4.5、5、5.5g/L，在接種后的第 5 d 進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.2.7 碳氮比對解磷菌溶磷能力的影響

將解磷菌株溶解磷礦粉時的培養(yǎng)基溶液里的碳氮比分別設(shè)置為10:1、20:1、30:1、40:1和50:1，在接種后的第5 d對培養(yǎng)基液體進(jìn)行取樣，測定培養(yǎng)基中可溶性磷的含量、解磷菌菌體濕重。

1.3 測量指標(biāo)與方法

1.3.1 培養(yǎng)液中可溶性磷含量的測定

打開紫外分光光度計，調(diào)節(jié)好待測波長后，預(yù)熱30 min待用。將培養(yǎng)了5 d的三角瓶從搖床中取出，先將培養(yǎng)液過濾（使用無磷濾紙以減少實驗誤差），然后將過濾后得到的液體在10000 r/min、4℃下離心20 min，取出后吸取10 mL上清液，再次通過0.22 μm的微孔濾膜，取5 mL透過微孔濾膜后的液體，加入50 mL的容量瓶中，補加去離子水至35 mL，然后緩緩加入酚酞指示劑1～2滴，用0.1 mol/L濃度的NaOH溶液中和至待測液體剛出現(xiàn)微紅色，再精確加入10 mL鉬銻抗顯色劑[11]，搖勻定容后，靜置30 min，之后在700 nm波長的紫外分光光度計上，用1 cm光徑比色皿進(jìn)行比色（調(diào)節(jié)分光光度計的時候，以空白對照組的吸收值作為比色零點）。

1.3.2 解磷菌菌體濕重的測定

為考察菌體生長與培養(yǎng)液中可溶性磷含量的相關(guān)關(guān)系，在方法1.2.1～1.2.7中測定可溶性磷含量的同時測定菌體濕重。取100 mL培養(yǎng)液，在5000 r/min、4℃下離心10 min，棄上清，稱量濕菌濕重。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

接種解磷菌懸液之后，放入搖床培養(yǎng)。每天進(jìn)行可溶性磷含量的檢測，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，培養(yǎng)液中的可溶磷含量在培養(yǎng)第5 d達(dá)到最大值，為25.8 mg/L，說明磷礦粉達(dá)到了最大的溶解量，此時菌體生長量也最大，菌體濕重為85 g/L。因此，解磷菌溶解中低品位磷礦粉的最佳培養(yǎng)時間為5 d。

圖1 培養(yǎng)時間對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.1 Effect of culture time on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.2 初始pH對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于培養(yǎng)基的初始 pH 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5 條件下培養(yǎng)5 d，對含磷礦粉的培養(yǎng)液進(jìn)行可溶性磷含量的檢測，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 初始pH對對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.2 Effect of initial pH on dissolution of medium and lowgrade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖2可知，菌體生長量與可溶性磷含量的變化趨勢一致，均為先上升后下降。在pH 6.5時，菌體的溶磷效果最好，培養(yǎng)液中可溶磷含量達(dá)到最大值，為28.3 mg/L。這主要因為解磷菌生長和繁殖的時候，培養(yǎng)基中液體的pH值對其影響比較大，而在液體pH高于或低于菌體的最適pH的時候，都會對菌體生長產(chǎn)生較大的影響，所以培養(yǎng)基的最適pH為6.5。

2.3 培養(yǎng)溫度對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于 20、23、25、28、31 ℃的恒溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行5 d培養(yǎng)，檢測可溶性磷含量，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)溫度對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.3 Effect of culture temperature on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

由圖3可見，在28℃條件下，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到了最大值，為29.6 mg/L，高于或低于這個溫度，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量都會顯著降低；同時在此溫度下，菌體生長量也達(dá)到了最大值。說明培養(yǎng)菌體時的環(huán)境溫度對菌體生長和繁殖的影響比較大，當(dāng)環(huán)境溫度高出最適溫度或者低于最適溫度的時候，菌體生長都會受到影響。所以，菌體溶解磷礦粉最適溫度為28℃。

2.4 接種量對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

采用1%、3%、5%、7%和10%的接種量培養(yǎng)5 d，試驗結(jié)果見圖4。

由圖4可見，當(dāng)接種量為7%時，可溶性磷含量達(dá)到最大值，為31.3 mg/L，當(dāng)接種量低于這個值時，液體中的可溶性磷含量呈上升趨勢，但當(dāng)接種量大于這個值時，液體中的可溶磷含量下降。同時，菌體生長量在低于最適接種量時，呈明顯上升趨勢；當(dāng)接種量超過最適值的時候，菌體生長量便趨于平緩，這可能是因為接種量過大的情況下，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致解磷效果下降。因此，最適接種量為7%。

圖4 接種量對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.4 Effect of inoculating amount on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.5 振蕩速率對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

分別于 120、140、160、180、200 r/min 條件下培養(yǎng) 5 d，檢測可溶性磷含量，試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 振蕩速率對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.5 Effect of shaking speed on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖5可知，在速率為120～180 r/min時，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量呈明顯上升趨勢，在振蕩速率為180 r/min條件下，達(dá)到最大值27.8 mg/L，超過180 r/min的速率時，液體中可溶磷性含量又明顯降低。同時，菌體生長量也在180 r/min的速率下達(dá)到最大值，高于或低于這個轉(zhuǎn)速，都會對菌體生長和繁殖有較大影響。分析其主要原因，可能是由于振蕩速率太高的情況下，搖床高速振蕩產(chǎn)生過高的剪切力削弱了菌體的生長，減少了解磷菌的菌體數(shù)量，并降低了解磷菌的溶磷能力。因此，確定最佳振蕩速率為180 r/min。

2.6 磷礦粉濃度對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

在磷礦粉濃度分別為 3.5、4、4.5、5、5.5 g/L 條件下培養(yǎng)解磷菌，試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同磷礦粉濃度對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.6 Effect of concentration of phosphate rock powder on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由圖6可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基磷礦粉濃度為5 g/L時，發(fā)酵液中可溶性磷含量達(dá)到最大值，為30.5 mg/L，同時菌體生長量也達(dá)到最大值。當(dāng)培養(yǎng)基中磷礦粉濃度為3.5～5.5 g/L時，液體中可溶性磷含量和菌體生長量都呈明顯上升趨勢，但當(dāng)磷礦粉濃度超過5 g/L時，可溶性磷的含量隨著磷礦粉濃度的增加而明顯減少。分析其原因，可能是由于本實驗使用的是中低品位磷礦粉，較之質(zhì)量高的磷礦粉，含有較多的雜質(zhì)，包含一些金屬離子等，這些雜質(zhì)又使液體中的可溶性磷沉淀。因此，最佳的磷礦粉濃度為5 g/L。

2.7 碳氮比對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響

在碳氮比分別為 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，在碳氮比為20:1條件下，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到最大值，為28.8 mg/L，同時，菌體生長量也達(dá)到最大值。但是當(dāng)碳氮比低于或高于最適碳氮比時，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量和菌體生長量都呈明顯下降趨勢。培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時，解磷菌才能較好的生長和繁殖，營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時不能滿足解磷菌正常的生長需要，濃度過高時則可能對解磷菌生長起抑制作用。

圖7 碳氮比對解磷菌溶解中低品位磷礦粉的影響Fig.7 Effect of carbon-nitrogen ratio on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

3 結(jié)論

通過控制外部條件因素（培養(yǎng)時間、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、振蕩速率磷礦粉濃度、碳氮比），研究不同條件下，解磷菌對中低品位磷礦粉的溶解效果，從而確定解磷菌對中低品位磷礦粉的最佳溶解工藝條件，即最適初始pH為6.5，最適培養(yǎng)溫度為 28℃，最適接種量為7%，最適振蕩速率為180 r/min，最適磷礦粉濃度為5.0 g/L，最適碳氮比為20:1，培養(yǎng)5 d。通過使用解磷菌來溶解磷礦粉產(chǎn)生可溶磷，在目前看來能夠改善磷元素缺乏地區(qū)作物生長情況，提高作物的產(chǎn)量。同時能夠合理利用我國現(xiàn)有的磷礦資源，保持土壤的肥沃性。這對于高效利用我國現(xiàn)有的磷礦資源具有非常深遠(yuǎn)的意義。