畢晶晶 李琳琳 麻娜娜 夏丁丁 仉華 張志國 劉統(tǒng)信 張貴生

摘?要?設計并合成了兩個對稱的1，2，3-三氮唑類蒽醌衍生物K1、K2， 采用1H NMR、13C NMR和HRMS表征其結構， 并考察了光譜性質(zhì)。利用GaussView 9.0量化程序及含時密度泛函TD-DFT方法對K1及K1-Ag+的結構性質(zhì)及理論光譜進行了計算。結果表明， 計算與測得的紫外-可見吸收光譜一致， 在370 nm左右出現(xiàn)蒽醌的吸收峰;熒光光譜表征實驗表明，探針K1與Ag+結合后，出現(xiàn)兩個吸收峰（466和522 nm），466 nm處熒光強度與單獨K1相比增強9倍; 探針K1在H2O-DMSO （7∶1， V/V， HEPES， pH=7.4）中對Ag+具有良好的選擇性識別性能， 常見共存離子及pH值對其測定無明顯影響，通過Job's plot 曲線確定二者之間的結合比為1∶1，結合常數(shù)為1368 L/mol，檢出限為21.2 μmol/L（S/N=3）。利用DFT方法對探針K1結構和K1-Ag+可能的絡合結構進行了分子構型優(yōu)化， 并計算絡合物中Ag+與K1的結合能，結果表明，Ag+與兩個三氮唑環(huán)和蒽醌單元絡合結構結合能最大，與核磁滴定實驗的結果吻合。K1和K1-Ag+的優(yōu)化結構顯示，K1與Ag+結合后，分子的三氮唑環(huán)發(fā)生轉位， 蒽醌平面發(fā)生輕度彎曲。熒光共聚焦成像結果表明， 探針K1對Ag+有較好的選擇性和靈敏度，可實現(xiàn)人肝癌細胞（HepG2）中微量Ag+的檢測。

關鍵詞?蒽醌;三氮唑;熒光探針;銀離子;熒光成像

1?引 言

銀離子（Ag+）具有殺菌、催化等特性[1，2]， 可作為抗生劑、動植物的轉錄抑制劑、耐質(zhì)粒轉變靶標等[3，4];同時，銀在電子產(chǎn)品、攝影、影像、制藥、醫(yī)療和生物學等領域應用廣泛。然而，這也造成了環(huán)境中的Ag+污染，威脅人類健康，引起了廣泛關注。如高濃度的Ag+可通過食物鏈在體內(nèi)累積， 對大腦、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等造成損害。另外， 由于一些含銀鹽藥物的過度及不合理使用， 也使Ag+積聚在肝臟組織，可引起肝癌等疾病[5～8]。因此， 開發(fā)快速、靈敏的Ag+的分析檢測方法具有重要意義。

目前，檢測Ag+的方法包括熒光法[9，10]、電化學法[11]、比色法[12]、原子吸收法[13]和表面增強拉曼散射（SERS）[14]等。其中熒光傳感方法具有簡單、成本低、快速、高選擇性和靈敏度等特性， 廣泛用于檢測陽離子、陰離子等[15，16]。近年來， 文獻報道了許多檢測重金屬離子，如Zn2+、 Pb2+和Hg2+的新型熒光探針[17，18]， 以及檢測Ag+的熒光探針， 如羅丹明、喹諾酮和BODIPY衍生物等[19，20]，然而，具有優(yōu)良性能的Ag+熒光探針仍然是目前的研究熱點。

蒽醌類衍生物，如阿霉素、柔紅霉素等， 具有多種藥理活性， 以及抗腫瘤、抗細菌、抗病毒、抗真菌、增強免疫力等多種生物學和藥學特性[21]。此外， 蒽醌類衍生物具有剛性平面結構， 并含有大環(huán)共軛體系， 具有熒光發(fā)射波長適中、光穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高的特點， 更主要的是其熒光和紫外吸收波長均出現(xiàn)在可見光區(qū)。因此， 它還是一類重要的染料。由于可以絡合金屬離子， 氨基和羥基取代的蒽醌衍生物也被廣泛用作發(fā)色團。近年來，蒽醌類熒光探針逐漸成為科研人員關注的熱點[22，23]，但蒽醌衍生物熒光探針用于Ag+檢測的研究尚未見報道。

1，2，3-三氮唑化合物是一類具有重要生物活性的五元氮雜環(huán)化合物， 多數(shù)基于三氮唑基團的探針主要是通過三氮唑形成一個結合口袋， 當被分析物與探針逐漸結合后， 由于熒光機制不同，如PET （光誘導電子轉移）、ICT （電荷轉移）等， 探針的熒光或增強或淬滅， 因此，三氮唑基熒光探針通常具有良好的選擇性和強的結合能力[24，25]。本研究以具有優(yōu)良生物學特性和光學特性的蒽醌為母體，設計合成了一類基于分子內(nèi)電荷轉移（ICT）可用于細胞成像的高選擇性銀離子熒光探針。利用蒽醌作為熒光團， 以1，2，3-三氮唑為結合位點， 通過Click反應合成了含有不同羥烷基鏈的蒽醌衍生物K1和K2， 并利用DFT理論計算等手段研究了探針K1與Ag+的絡合結構和光致發(fā)光的機理，實現(xiàn)了對Ag+的專一性、高靈敏性檢測，并可用于生物成像檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

UV-2600紫外可見分光光度計 （日本島津公司）;AC400 型超導核磁共振儀 （TMS作內(nèi)標，瑞士布魯克公司）;UPLC-TQD液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 （美國沃特斯公司）;F-4500 熒光分光光度計 （日本日立公司）;FV 1000激光共焦顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）。

葡萄糖、溴己醇、溴丙醇、疊氮化鈉、五水硫酸銅、抗壞血酸鈉（北京伊諾凱科技有限公司）;三氟化硼乙醚 （分析純，百靈威科技有限公司）;1，8-二羥基蒽醌、溴丙炔 （上海達瑞精細化學品有限公司）;金屬硝酸鹽與硫酸鹽為結晶水合物。所用試劑均為分析純;實驗用水為二次亞沸蒸餾水。

2.2?熒光探針K1和K2的合成

銀離子熒光探針K1和K2的合成路線：

2.2.1?1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2的合成[26] 將1，8-二羥基蒽醌 （2.013 g， 8.38 mmol）溶于100 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中， 加入K2CO3 （5.96 g， 42 mmol） 和3-溴-1-丙炔 （2.6 mL， 33.5 mmol）， 室溫攪拌反應20 h后， 用二氯甲烷萃取，水洗滌，無水Na2SO4干燥， 過濾并濃縮， 用柱層析 （石油醚-乙酸乙酯，4∶1，V/V） 分離得到2.330 g黃色固體1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2， 產(chǎn)率為88%。1H NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 7.92 （dd， J=8.0， 0.8 Hz， 2H）， 7.67 （t， J=8.0 Hz， 2H）， 7.50 （dd， J=8.4， 0.8 Hz， 2H）， 4.94 （d， J=2.4 Hz， 4H）， 2.55 （t， J=2.4 Hz， 2H）。

2.2.2?化合物 3a和3b的合成[27] 將1-溴丙醇 （2 mL， 22.3 mmol， 1.0 equiv） 溶于20 mL DMF中， 加入疊氮化鈉（4.34 g， 66.9 mmol， 3.0 equiv）， 90 oC 加熱攪拌。薄層色譜（TLC）監(jiān)測原料反應完全后， 加入水，用二氯甲烷萃取，旋轉蒸干有機相， 柱色譜分離，得到無色油狀液體 1-疊氮基丙醇3a （2.1962 g， 97%）。采用同樣方法制得無色油狀液體 1-疊氮基己醇3b，產(chǎn)率為 85%。3a： 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 3.74～3.71 （m， 2H）， 3.43 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.85～1.78 （m， 2H）。 3b： 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ 3.64 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.26 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.64～1.54（m， 4H）， 1.45～1.38 （m， 4H）。

2.2.3?探針K1和探針K2的合成?將1-疊氮基丙醇3a （0.40 mL， 6.08 mmol） 和1，8-二-O-炔丙基-蒽醌1（0.50 g， 1.58 mmol） 溶于H2O-THF（1∶1，V/V）混合溶劑中，加入CuSO4·5H2O（59 mg， 0.24 mmol）和L-抗壞血酸鈉鹽（90 mg， 0.48 mmol）， 避光，于55℃加熱攪拌下反應，產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，水洗滌， 無水Na2SO4干燥， 過濾、濃縮， 用柱色譜分離（乙酸乙酯-甲醇，10∶1，V/V） ，得到黃色固體化合物K1（150 mg， 80%）。采用同樣方法制備黃色固體化合物K2（產(chǎn)率為95%）。 Compound K1：1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.25（s， 2H）， 7.76～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.68（t， J=4.4 Hz， 2H）， 4.43（t， J=7.2 Hz， 4H）， 3.40（dd， J=10.8， 6.0 Hz， 4H）， 1.99～1.92（m， 4H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ 183.2， 181.1， 157.5， 142.3， 134.2， 125.0， 123.9， 120.9， 118.8， 62.5， 57.4， 46.8， 33.0。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C26H26N6O6Na 541.1806， found 541.1802）。Compound K2： 1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.23（s， 2H）， 7.75～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.37～4.32（m， 6H）， 3.36～3.32（m， 4H）， 1.83～1.76（m， 4H）， 1.40～1.32（m， 4H）， 1.30～1.67（m， 8H）。13C NMR（100 MHz， DMSO）： δ 183.1， 181.0， 157.4， 142.3， 134.2， 124.6， 124.0， 121.0， 118.8， 62.6， 60.5， 49.4， 32.3， 29.8， 25.7， 24.9。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C32H38N6O6Na 625.2745， found 625.2745）。

2.3?探針溶液的制備和檢測方法

配制濃度為1.0 × 102 mol/L的K1、K2探針DMSO儲備溶液、濃度為1.0 × 103 mol/L的不同陽離子儲備溶液以及pH=7.4 的HEPES（10 mmol/L）緩沖溶液。測試前用HEPES緩沖溶液將上述儲備液稀釋到所需濃度，在5 mL比色管中分別加入600 μL DMSO、 25 μL K1標準液和適量金屬離子標準液， 用HEPES緩沖溶液定容至5 mL， 搖勻， 靜置30 min后，測量紫外-可見吸收光譜和和熒光光譜（λex=340 nmf， 激發(fā)狹縫10.0 nm， 發(fā)射狹縫20.0 nm， 儀器靈敏度為高）。

2.4?細胞成像實驗

將復蘇的人肝癌細胞HepG2（Human hepatoma cell line，中國醫(yī)學科學院）用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)， 待其貼壁80%左右， 消化、離心、計數(shù)，接種到激光共聚焦皿中（50000個/皿）， 在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h， 待其貼壁后進行實驗。用培養(yǎng)基稀釋K1溶液至50 μmol/L，與貼壁后的細胞共培養(yǎng)30 min， 接著用PBS緩沖液洗滌細胞3次，進行共聚焦成像。另外，將細胞與50 μmol/L Ag+溶液培養(yǎng)30 min，然后用探針染色30 min ， PBS緩沖液洗滌3次后，成像分析。

3?結果與討論

3.1?探針K1和K2對金屬離子的識別

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜考察了探針K1和K2對不同離子的響應。分別測定含有探針K1（50 μmol/L）和金屬離子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+（1.0 mmol/L， 20 equiv.）的HEPES-DMSO（7∶1， V/V）溶液的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜。加入Ag+后，探針的紫外吸收峰從378 nm藍移到364 nm處。由熒光光譜可見， 未加入離子前， 探針K1在466和522 nm處的熒光峰強度很低;只有加入Ag+時的熒光強度明顯增強， 而其它金屬離子的加入對探針K1的熒光強度幾乎沒有影響，說明探針K1對Ag+具有選擇性識別的特性。探針K2對不同離子的響應，只有加入Ag+時，K2熒光強度增強，但增強程度不及K1顯著，表明含羥基的長烷基鏈可降低Ag+的響應。因此， 選擇化合物K1作為Ag+熒光探針，進行后續(xù)實驗。

3.2?共存離子對探針K1識別Ag+的熒光強度的影響

為了進一步確認探針K1對Ag+的選擇識別作用， 采用常見的金屬陽離子作為干擾物， 研究了探針K1對Ag+的選擇性識別能力及抗干擾能力。向探針K1溶液（50 μmol/L）中分別加入濃度為1.0 mmol/L的金屬離子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+， 搖勻后靜置10 min， 測量466 nm處熒光強度;再分別加入濃度為1.0 mmol/L 的Ag+， 其濃度比為C（K1） ∶ C（Ag+） ∶ C（干擾離子）=1 ∶ 20 ∶ 20， 測量466 nm處熒光強度。結果表明，共存的干擾離子的熒光強度與Ag+單獨存在時相差很小，其它共存離子對Ag+的識別也未明顯受到干擾離子的影響（其它常見陰離子、有機小分子和生物大分子的干擾實驗結果見電子版文后支持信息S12）。上述結果表明，探針K1對Ag+具有良好的選擇性和抗干擾性。

3.3?不同濃度的Ag+對K1熒光光譜的影響

通過熒光滴定實驗研究探針K1對Ag+的響應情況。隨著溶液中Ag+濃度逐步加大， K1在466和520 nm處的熒光強度不斷增強， 466 nm處熒光強度變化尤其明顯，表明K1可作為開關型熒光探針檢測Ag+。Ag+濃度與熒光強度的工作曲線， 在0.05～0.50 mmol/L（1.0～10 equiv.）濃度范圍內(nèi)， 探針 K1 在466 nm處的熒光強度值與Ag+濃度呈良好的線性關系， 線性相關系數(shù)為0.9970，檢出限為21.2 μmol/L[28]。

配制了一系列探針K1與Ag+總濃度為0.25 mmol/L， 濃度比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的溶液， 測定其在λem=466 nm處的熒光強度，Job 's Plot曲線， 當探針K1與Ag+濃度比為1∶1時， 熒光強度達到最大值，表明探針K1與Ag+的結合比為1∶1。隨著Ag+的加入，探針K1在466 nm處的熒光強度不斷增強， 依據(jù)熒光滴定曲線數(shù)值，利用Benesi-Hildebrand方程[23～25]得到其絡合常數(shù)， 公式如下：

其中，F(xiàn)min為探針不加Ag+時的熒光強度， Fmax為加入Ag+后探針最大熒光強度， F為加入不同濃度Ag+時探針的熒光強度， [Ag+]表示Ag+的濃度。依據(jù)滴定曲線的數(shù)據(jù)，以1/[[Ag+]（Fmax-Fmin）]為橫坐標， 1/（F-Fmin）為縱坐標得到相應的點， 線性擬合得到線性方程y=7.31 × 104/Ka + 0.003（R2=0.978）， 根據(jù)上述方程可計算得結合常數(shù)為 Ka=1368 L/mol。

3.4?pH值對探針識別Ag+的影響

考察了體系pH值對探針K1在466 nm處熒光強度的影響。 在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)沒有變化，探針K1在466 nm處熒光強度變化很小。加入10倍當量Ag+后，在pH 6.0～9.0范圍時， 探針熒光強度變化較小。選擇在pH=7.4的HEPES緩沖溶液中進行探針的離子選擇性、競爭性、濃度滴定實驗。探針檢測Ag+的熒光響應隨時間的變化，探針K1與Ag+的結合在4 min內(nèi)即可達到平衡， 表明探針K1可快速檢測Ag+。

3.5?核磁滴定與DFT分析

探針K1與Ag+的核磁滴定實驗結果。研究了探針分子K1中Ha-Hi的化學位移的變化情況， 隨著Ag+的加入， Hg的化學位移保持不變， Ha、Hb、Hc整體向高場移動0.006 ppm， Hd向高場移動了0.035 ppm， He、Hf和Hi分別向低場移動0.055、0.010和0.021 ppm。上述結果表明，Ag+可能與兩個三氮唑環(huán)、蒽醌單元及烷基鏈的羥基絡合[23，29]。

Ag+可與蒽醌上的羰基O、三氮唑上的N、烷基鏈上的O配位。為了進一步探究探針K1-Ag+的絡合模式，利用密度泛函理論（DFT），在B3LYP/6-31G（d）/SDD（Ag）計算水平下，對探針K1結構和K1-Ag+可能的4種絡合結構-Ag（a～d）進行了分子構型優(yōu)化，給出部分結構參數(shù)。AgO和AgN鍵長為2.12～2.53 ， 屬于正常成鍵范圍。對絡合物中Ag+的結合能進行了計算， 結果表明，Ag+與2個三氮唑環(huán)和蒽醌單元絡合結構的結合能最大（119.08 kcal/mol）（表1）， 這與核磁滴定實驗的結果相同。探針K1和結合能最大的K1-Ag結構。探針與Ag+絡合后， 探針分子的三氮唑環(huán)發(fā)生轉位， 蒽醌平面發(fā)生輕度彎曲。進一步通過含時密度泛函理論（TDDFT）在ωB97XD/6-31+G（d）/SDD（Ag）水平下對它們的紫外光譜進行模擬， 結果表明，加入Ag+后， 探針K1在370 nm處的紫外吸收峰發(fā)生了藍移，此模擬結果與實驗結果相符， 說明本研究采用的泛函和基組在光譜模擬上是可靠的。根據(jù)以上數(shù)據(jù)， 結合文獻[23，29]， 推測與Ag+的結合方式。所有計算由 Gaussian09 軟件包[30]運行。

從測得的光譜數(shù)據(jù)可以推測， 與Ag配位后形成的K1-Ag具有穩(wěn)定的結構。當激發(fā)波長為340 nm時， 探針K1的熒光很弱， 而加入Ag+后， 熒光迅速增強， 原因可能是兩條含有羥基的烷基鏈在激發(fā)態(tài)自由旋轉較強， 加入Ag+后， 蒽醌上的O原子和三氮唑上的N原子同時與Ag螯合， 抑制分子旋轉， 使能量損失降低， 因此熒光顯著增強，對Ag+具有選擇性識別。分子內(nèi)電荷轉移（ICT）是對Ag+有離子選擇性的基礎，K1的吸收峰藍移可以歸因于ICT， Ag+與蒽醌環(huán)上的羰基及三唑環(huán)上的氮原子結合， 產(chǎn)生的螯合熒光增強（CHEF）效應也有利于Ag的識別和K1-Ag的穩(wěn)定[18，19]。

3.6?探針檢測HepG2細胞內(nèi)Ag+測試了探針K1對人體肝癌細胞HepG2的細胞毒性。實驗結果表明，培養(yǎng)濃度達到10 μmol/L時， 細胞活性仍超過85%，說明探針K1的細胞毒性較低，可用于活體細胞內(nèi)的實驗。

為評價探針K1在活細胞內(nèi)檢測Ag+的能力，將探針用于HepG2的激共聚焦熒光成像。使用FV 1000激光共焦顯微鏡觀察共焦熒光成像， 在探針K1的細胞成像中， 當細胞內(nèi)未加入Ag+時， 探針K1 的熒光信號相對較弱;當細胞加入Ag+孵育后，再加入探針K1染色， 探針K1 在兩個波段的熒光信號都明顯增強， 能夠明顯觀察到加入Ag+后HepG2細胞的熒光成像。

4?結 論

設計合成了兩個基于蒽醌的具有不同長度烷基鏈的新型Ag+熒光探針K1和K2，基于ICT和CHEF絡合機理實現(xiàn)對Ag+的識別。探針含羥基的烷基鏈的長度對識別有影響，烷基鏈長度太長， 如含有6個碳的K2，其響應能力下降。探針K1與Ag+結合后熒光強度隨Ag+濃度增加而逐漸增強。光譜分析表明，探針K1對Ag+具有較好的選擇性和靈敏度， 在0.05～0.50 mmol/L濃度范圍內(nèi)，探針熒光強度與Ag+濃度呈較好的線性關系， 且在人肝癌細胞（HepG2）內(nèi)成功實現(xiàn)了Ag+的成像。通過核磁滴定和DFT計算， 推測其絡合機理為： Ag+與蒽醌環(huán)上的羰基及三唑環(huán)上的氮相結合，使得兩個三氮唑環(huán)翻轉，且蒽醌平面輕度彎曲，導致探針K1的光譜變化及對Ag的識別作用。本研究對檢測實際環(huán)境生物樣品中的Ag+具有潛在的應用價值。

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