劉進(jìn)蘭 楊雪 李雙雙 張玉明 柳峰松 唐婷 李紅權(quán)

（河北大學(xué)，保定 071000）

生物體受到外界脅迫時，會激活防御機(jī)制抵御外界侵害，例如誘導(dǎo)抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）的表達(dá)殺死入侵細(xì)菌是重要的免疫防御之一?？咕氖且活惖头肿恿康亩屉模蠖鄶?shù)是由陽離子和疏水性殘基組成的兩親性分子［1-3］。由于抗菌肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、絲狀真菌和原生生物以及包膜病毒在內(nèi)的微生物都具有快速且有效的殺傷效果，因此被稱為“自然抗生素”［4-5］。抗菌肽與抗生素對細(xì)菌作用的機(jī)制不同，抗生素多是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成來抑制細(xì)菌的生長，濫用抗生素會產(chǎn)生高度耐受抗生素的細(xì)菌以及超級細(xì)菌，導(dǎo)致藥效下降［6］。而大多數(shù)抗菌肽都是通過靜電作用和疏水作用吸附于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞膜結(jié)構(gòu)使內(nèi)溶物外漏，發(fā)揮殺菌活性，這種獨(dú)特的作用機(jī)制使細(xì)菌很難通過改變細(xì)胞膜成分對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性［7］，因此抗菌肽成為了抗生素理想的替代品。

家蠅（Musca domestica）是雙翅目蠅科昆蟲，在我國分布廣泛，與人類生活密切相關(guān)。它們攜帶成百上千種病菌，能夠傳播多種疾病，嚴(yán)重危害人類健康，被認(rèn)為是一種世界性的衛(wèi)生害蟲。家蠅通常生活在腐敗、骯臟的惡劣環(huán)境下，但種群卻十分強(qiáng)大，咎其原因是由于家蠅具有強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)，可以有效的抵御外源侵?jǐn)_［8-9］。昆蟲具有識別細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒等病原體的有效機(jī)制，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)［10-11］，其中抗菌肽是昆蟲體液免疫中關(guān)鍵的抗菌因子，在先天免疫中占據(jù)十分重要的地位。已鑒定的家蠅抗 菌 肽 有 attacin［12］、cecropin［13］、diptericin［14］、defensin［15］、MDAP-2D［16］及 Muscin［17］等。 本 實(shí)驗(yàn)室通過生物信息學(xué)篩選出一個潛在的抗菌肽基因，將其命名為domesticin［18］，該基因氨基酸序列具備抗菌肽分子量小、富含脯氨酸、疏水性氨基酸較多等特征，本文利用畢赤酵母（Pichia pastoris）真核表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行體外表達(dá)，并驗(yàn)證其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠅種蠅由中國科學(xué)院動物研究所何鳳琴老師于2007年惠贈，一直在本實(shí)驗(yàn)室繁殖至今。由本實(shí)驗(yàn)室保種和飼養(yǎng)，幼蟲飼料配方為90 g麩皮、5 g白糖、5 g奶粉及適量無菌水。飼養(yǎng)溫度25℃，相對濕度50%-70%。

大腸桿菌感受態(tài)Trans-T-1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達(dá)載體pPIC9K由實(shí)驗(yàn)室保存，畢赤酵母KM71菌株由河北大學(xué)生命科學(xué)院李繼剛教授實(shí)驗(yàn)室惠贈。遺傳霉素G418購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，抗His標(biāo)簽兔多克隆抗體購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，山羊抗兔抗體購自生工生物工程有限公司。His蛋白純化試劑盒Ni Resin FF購自金斯瑞生物科技有限公司。抑菌實(shí)驗(yàn)所用菌種由中科院動物研究所朱順義研究員和河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫磊教授饋贈。革蘭氏陽性菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）；革蘭氏陰性菌：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、傷寒桿菌（Salmonella typhi）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維式氣單胞菌（Aeromonas veronii）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形菌（Proteus species）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痢疾菌屬（Shigella sp.）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、河生腸桿菌（Enterobacter amnigenus）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 以Total RNA提取試劑RNAiso Plus提取3齡家蠅幼蟲的總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用核酸定量儀測定其濃度和純度，取1 μg總RNA，以AOLP為引物：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACT16（G/A/C）-3'反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化 根據(jù)家蠅轉(zhuǎn)錄組序列信息，設(shè)計domesticin基因特異引物 domesticin-F：5'-GTATCGGCATCTCGTGACTC-3'，以家蠅幼蟲cDNA為模板，利用domesticin-F和AP：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'進(jìn)行 3'RACE擴(kuò)增。根據(jù)家蠅domesticin基因編碼成熟肽序列設(shè)計引物，在引物5'端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRI和NotI，并在酶切位點(diǎn)EcoRI后加入6×His標(biāo)簽。上游引物P1：5'-CGGAATTCCATCATCATCATCATCAT TCTCGTGACTCCAGACCTGTTC-3'（下劃線處EcoRI酶切位點(diǎn)），下游引物P2：5'-AAGGAAAAAAGCGG CCGCTTAAGCGTACATAGTTTTTCGTC-3'（下劃線處為NotI酶切位點(diǎn)）。以家蠅的cDNA為模板，以引物P1和P2進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，回收目的片段后用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切。將雙酶切后的目的片段連接至經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后的pPIC9K載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans-T-1中，篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證表達(dá)載體pPIC9K-domesticin讀碼框是否正確。之后將表達(dá)載體pPIC9K-domesticin用SacI線性化后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母KM71感受態(tài)中，平行設(shè)置pPIC9K載體為對照。電轉(zhuǎn)化后將轉(zhuǎn)化子涂布在MD平板上（所含物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為無氨基酸酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L），將平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單個菌落。

1.2.3 遺傳霉素篩選及PCR鑒定轉(zhuǎn)化子 利用無菌水重懸酵母重組子，將酵母重組子分別涂布于含有不同遺傳霉素濃度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD平板上（所含物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L），于30℃培養(yǎng)。待不同遺傳霉素條件下長出單克隆菌落后，在對應(yīng)的遺傳霉素條件下進(jìn)行劃線培養(yǎng)。挑取菌落為模板，以P1和P2，pPIC9K載體上的5'AOX1（5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和P2為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定各轉(zhuǎn)化子插入情況。

1.2.4 重組pPIC9K-Domesticin的誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白檢測及分離純化 將陽性重組子置于BMGY培養(yǎng)基中（所含物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L），在30℃200 r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD600=2-6時收集菌體并重懸于BMMY培養(yǎng)基中（所含物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L），于30℃下200 r/min培養(yǎng)，每間隔24 h添加無水甲醇，使其終濃度為0.5%。誘導(dǎo)96 h后收集發(fā)酵上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，并以抗His標(biāo)簽兔多克隆抗體為一抗，以山羊抗兔抗體為二抗對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot檢測。按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑說明書對帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白Domesticin進(jìn)行純化，并用牛血清蛋白BSA作為對照，Bradford法測定蛋白的濃度。

1.2.5 Domesticin的抑菌活性檢測 將抑菌實(shí)驗(yàn)菌株在37℃ 200 r/min LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按照1%接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600=0.2左右。用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋菌液100倍備用。將純化后的Domesticin蛋白用無菌水進(jìn)行稀釋，取90 μL細(xì)菌稀釋液和10 μL蛋白稀釋液加入96孔板中，23℃ 100 r/min 培養(yǎng)12 h。分別以10 μL無菌水和10 μL氨芐青霉素（30 μg/mL）作為陰性和陽性平行對照。在OD600下檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組菌液的濁度，來判斷其是否具有抑菌活性，并測定最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），MIC定義為與陰性對照組相比實(shí)驗(yàn)組達(dá)到85%以上細(xì)菌死亡的多肽濃度。不同濃度的樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體pPIC9K-domesticin的構(gòu)建

PCR克隆獲得家蠅domesticin基因全長cDNA序列364 bp，此序列包含198 bp完整的開放閱讀框，5'末端非翻譯區(qū)114 bp，3'末端非翻譯區(qū)52 bp。該基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有65個氨基酸，其中含有25個氨基酸的信號肽（圖1），其成熟肽理論分子量為4.58 kD。以家蠅cDNA為模板，P1和P2為引物對domesticin基因編碼成熟肽序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖2）顯示100-250 bp位置有特異性片段。對構(gòu)建的pPIC9K-domesticin表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切后出現(xiàn)兩條特異條帶，其中小片段與domesticin大小一致，另一條帶為pPIC9K線性質(zhì)粒（圖3）。

2.2 高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選以及PCR鑒定

經(jīng)遺傳霉素G418不同濃度梯度篩選，濃度低于3 mg/mL的遺傳霉素YPD平板上長出了數(shù)目不等的轉(zhuǎn)化子，而4 mg/mL的遺傳霉素YPD平板上未見轉(zhuǎn)化子長出，在3 mg/mL遺傳霉素的YPD平板上長出11個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。引物P1和P2檢測片段預(yù)期大小為123 bp，載體引物5'AOX1和引物P2檢測片段預(yù)期大小為514 bp，同時以空質(zhì)粒pPIC9K作為陰性對照，結(jié)果顯示兩種配對引物擴(kuò)增的片段大小均與預(yù)期值相符，且11個轉(zhuǎn)化子均為陽性克?。▓D 4）。

圖1 家蠅domesticin基因cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列

M：DNA Marker；1：家蠅domesticin基因PCR產(chǎn)物

圖3 重組表達(dá)載體pPIC9K-domesticin雙酶切驗(yàn)證

2.3 重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的檢測

任取一株篩選到的酵母pPIC9K-domesticin高抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，質(zhì)粒pPIC9k轉(zhuǎn)化子為陰性對照，分別收集誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h的發(fā)酵上清，三氯乙酸濃縮后經(jīng)Tricine-SDS-PAGE及Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)在大約5.4 kD位置出現(xiàn)了與融合蛋白預(yù)期大小相符的條帶，而pPIC9k質(zhì)粒對照未出現(xiàn)條帶（圖5）。鎳柱純化后得到Domesticin的蛋白濃度為78.22 μg/mL。

1-11：P1，P2為引物鑒定的陽性克??；a-k：載體引物5' AOX1和P2為引物鑒定的陽性克??；空：質(zhì)粒pPIC9K陰性對照；M：DNA Marker

圖5 畢赤酵母表達(dá)Domesticin重組蛋白的Tricine-SDSPAGE分析（A）及Western Blot鑒定（B）

2.4 抑菌活性檢測

家蠅抗菌肽Domesticin對各種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）見表1，實(shí)驗(yàn)表明Domesticin對巨大芽孢桿菌在內(nèi)的22種受試細(xì)菌都具有抑菌作用，其中對革蘭氏陽性菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）抑制作用最強(qiáng)，其MIC值為0.55 μmol/L，對革蘭氏陰性菌棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）的抑制作用最弱，其MIC值為12.68 μmol/L。從結(jié)果可以看出家蠅抗菌肽Domesticin對革蘭氏陽性菌的抑制效果要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。

表1 家蠅抗菌肽Domesticin對于細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）

3 討論

抗菌肽可以直接從生物體中提取分離，但是由于生物體中天然抗菌肽含量較低，提取工藝復(fù)雜且難以得到較為單一的抗菌肽成分，從而在一定程度上限制了抗菌肽的研究［19-20］。雖然可以利用化學(xué)合成獲得抗菌肽，但化學(xué)合成的抗菌肽與天然抗菌肽結(jié)構(gòu)存在差異，往往需要對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾后才具有活性。如楊雪等［17］通過化學(xué)合成的線性抗菌肽1-Muscin無抑菌活性，而環(huán)化修飾后的c-Muscin對多種細(xì)菌都有抑制作用；Hao等［21］在BuforinⅡ衍生肽BF2-A的結(jié)構(gòu)特征基礎(chǔ)上設(shè)計合成了新肽BF2-X，BF2-X對細(xì)菌的抗菌活性強(qiáng)于BF2-A，且BF2-X殺菌速度比BF2-A快速；Xie等［22］通過化學(xué)合成了非洲爪蛙的抗菌肽CPF-C1，雖然CPF-C1對耐藥性細(xì)菌有較好的抑菌活性，但是CPF-C1穩(wěn)定性差，而對其結(jié)構(gòu)改造后的類似物CPF-8穩(wěn)定性好且抗菌活性持久。此外有研究者利用原核系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽，凌霄利用原核表達(dá)系統(tǒng)對太平洋牡蠣的抗菌肽cgMolluscidin進(jìn)行融合表達(dá)，但該系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后修飾功能，使得該抗菌肽沒有抑菌活性［23］。有時，由于抗菌肽強(qiáng)烈的抑菌活性，會在其表達(dá)過程中將宿主殺死，使得重組表達(dá)難以在原核微生物中進(jìn)行。畢赤酵母能夠表達(dá)各種重組異源蛋白，被認(rèn)為是一種理想的真核表達(dá)宿主［24］。與其他真核及原核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易于操作，多種轉(zhuǎn)錄后修飾（如多肽折疊，酰化，糖基化，甲基化等），遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定及蛋白可高水平表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)［25］。Xu 等［26］將鱟（Limulus polyphemus）中的基因tachyplesinII轉(zhuǎn)入畢赤酵母并成功表達(dá)具有抑菌活性的抗菌肽。Luiz等［27］利用酵母系統(tǒng)重組表達(dá)了蜜蜂的抗菌肽，該抗菌肽對大腸桿菌具有抑菌作用。

畢赤酵母菌株主要有KM71、GS115、SMD1168及X33等。蔡晶晶等［28］利用畢赤酵母GS115表達(dá)了來自黑鯛的抗菌肽hepcidin，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌和溶壁微球菌具有抑菌活性。Chen等［29］利用畢赤酵母SMD1168表達(dá)了來自蜜蜂的抗菌肽IC-20，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌具有抑制效果。Li等［30］利用畢赤酵母X33表達(dá)了來源于雞的抗菌肽Fowlicidin-2，該抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及粘質(zhì)持沙雷氏菌具有明顯的抑菌效果。在GS115、SMD1168及X33這些酵母菌株中，目的基因在轉(zhuǎn)化及整合的過程中會產(chǎn)生Mut+及Muts兩種不同表型，需要用甲醇最小培養(yǎng)基（MM）來篩選其屬于何種表型，這使得操作變得復(fù)雜。

本研究利用畢赤酵母菌KM71作為表達(dá)宿主，其優(yōu)勢在于不需要用MM培養(yǎng)基來篩選Mut表型，因?yàn)槠渌修D(zhuǎn)化子都是Muts表型。這就為篩選轉(zhuǎn)化子節(jié)省了精力及成本。常用的畢赤酵母表達(dá)載體主要有pPICZα-A和pPIC9K兩種，前者屬于胞內(nèi)表達(dá)載體，后者屬于分泌到胞外的載體。此外，載體不同篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子時所用的抗生素不同。pPICZα-A用博來霉素來篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，而pPIC9K則用遺傳霉素來進(jìn)行篩選。抗生素濃度越高則插入到酵母基因組中的目的片段的拷貝數(shù)越多，一般認(rèn)為0.25 mg/mL遺傳霉素篩選含1-2個拷貝數(shù)，4 mg/mL含7-12個拷貝數(shù)，通過篩選出高抗生素濃度的轉(zhuǎn)化子來提高蛋白表達(dá)量。本研究篩選出了遺傳霉素濃度最高為3 mg/mL的轉(zhuǎn)化子，對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)量高于遺傳霉素濃度為0.25 mg/mL的轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量。

本實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成的Domesticin多肽對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）、變形菌（Proteus species）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、河生腸桿菌（Enterobacter amnigenus）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）的最低抑菌濃度均大于100 μmol/L［18］，可認(rèn)為對這些菌基本無抑菌作用。而本研究利用畢赤酵母表達(dá)的Domesticin對上述細(xì)菌都具有很強(qiáng)的抑制效果，這表明與合成Domesticin多肽相比，畢赤酵母表達(dá)的Domesticin抑菌譜更廣。這可能是由于畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)出的抗菌肽更加接近其天然構(gòu)型，并呈現(xiàn)了其原有活性。此外，該抗菌肽對人類致病菌傷寒桿菌（Salmonella typhi）、痢疾菌屬（Shigellasp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和人畜共患致病菌雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）均有抑制作用，這說明該抗菌肽具有成為新型抗生素的潛力，為解決細(xì)菌耐藥性問題提供新的思路和方向。同時，Domesticin對水產(chǎn)動物重要致病菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）及維式氣單胞菌（Aeromonas veronii）也有抑制作用，這可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病菌感染提供新的治療方案。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了家蠅新型抗菌肽Domesticin成熟肽在畢赤酵母KM71的表達(dá)載體，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行蛋白檢測，Tricine-SDS-PAGE及Western Blot分析結(jié)果表明，Domesticin在畢赤酵母中成功表達(dá)，抑菌實(shí)驗(yàn)顯示Domesticin對受試革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，是一種新型廣譜抗菌肽。