王青柏，李良秋，徐 鵬，曾綺文，王東東，王嘉銘，譚雨婷

(廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070)

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是人類和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要病原弧菌，廣泛存在于海水及河口環(huán)境中[1]。2000年，美國疾病控制中心首次從腹瀉患者糞便中分離出一種嗜鹽性的革蘭陰性細(xì)菌[2]。2007年Bross等[1]從膿毒癥患者血液中分離培養(yǎng)出同種細(xì)菌，引起了大家的普遍關(guān)注，該菌于1979年被命名為Vibriovulnificus。隨后，美國、日本等國家相繼報(bào)告創(chuàng)傷弧菌感染臨床病例，姜紅[3]于1991年報(bào)道了我國首例創(chuàng)傷弧菌引起的原發(fā)性敗血癥。2006年，創(chuàng)傷弧菌被列入最危險的細(xì)菌，與霍亂弧菌、副溶血性弧菌并列為威脅人類健康的三大弧菌[4]。近年來，隨著氣候變暖以及進(jìn)食海鮮的人群變多，我國創(chuàng)傷弧菌感染率呈現(xiàn)上升趨勢[5-8]。人感染創(chuàng)傷弧菌往往與食用受污染的海產(chǎn)品及創(chuàng)口暴露于海水有關(guān)，臨床癥狀主要表現(xiàn)為原發(fā)性敗血病和嚴(yán)重的創(chuàng)口感染，此外，還可引起腸胃炎、肺炎、腦膜炎等，其中引起的原發(fā)性敗血病在免疫功能低下的人群中死亡率高達(dá)50%～60%[9]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，創(chuàng)傷弧菌可使許多種經(jīng)濟(jì)動物患病，如羅非魚[10]、蝦南美白對蝦[11]、金鯧魚[12]、安圭拉鰻魚[11]、鱘魚[13]、石斑魚[14]等。最近，我國學(xué)者首次報(bào)道了從患病的淡水魚草魚中分離出創(chuàng)傷弧菌[15]。草魚是我國主要的養(yǎng)殖淡水物種之一，年產(chǎn)量超過580萬t，也是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖中最大的魚類產(chǎn)量[15]。

創(chuàng)傷弧菌的感染不僅對人類健康造成重大危害，也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且我國海產(chǎn)品品種豐富多樣，每年因食用海產(chǎn)品而引起食物中毒、急性胃腸炎或腹瀉等疾病屢有報(bào)道。因此研究創(chuàng)傷弧菌的生物學(xué)特性及檢測技術(shù)具有重要意義。

1 生物學(xué)特性

創(chuàng)傷弧菌是一種低度嗜鹽菌，存在于鹽度為0.08%～3.50%的水體中[16]，屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)。該菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短小，呈稍彎曲的逗點(diǎn)狀，有極端單鞭毛，有動力，單獨(dú)存在或尾端相連成“C”或“S”型，氧化酶陽性，無芽孢，適于生長在堿性環(huán)境中，對酸性環(huán)境敏感，在低于13 ℃的環(huán)境下不生長，在無鹽培養(yǎng)基上不生長[3]。創(chuàng)傷弧菌在固體培養(yǎng)基中呈多樣性，在選擇性培養(yǎng)基TCBS上呈綠色菌落，而在改良的mCPC瓊脂上呈帶黃色暈環(huán)的黃色菌落。它是一種重要的水產(chǎn)品污染病原，可造成養(yǎng)殖水產(chǎn)品的病害，同時也是一種致命的人類機(jī)會致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關(guān)[17]。根據(jù)生化血清學(xué)試驗(yàn)和受感染宿主的不同，目前將創(chuàng)傷弧菌分為3種生物型[18]：生物Ⅰ型主要感染人類，通常零星發(fā)生；生物Ⅱ型主要引起鰻魚的疾病，但是也有少數(shù)感染人的報(bào)道；生物Ⅲ型于1996年首次報(bào)道，可引起人類敗血癥和軟組織感染。創(chuàng)傷弧菌的致病性是多種致病因子共同作用的結(jié)果，主要致病因子包括溶血素、MARTX毒素、鐵載體、莢膜多糖、脂多糖以及金屬蛋白酶等。

1.1溶血素溶血素(vibrio vulnificus haemolysin，VVH)是創(chuàng)傷弧菌分泌至胞外的一種穿孔毒素(pore-forming toxin)，是創(chuàng)傷弧菌重要的毒力因子之一，參與了細(xì)菌入侵宿主的毒力機(jī)制，通過破壞腸道黏膜組織協(xié)助創(chuàng)傷弧菌從腸道侵入到血液[5]。VVH能特異性結(jié)合膽固醇，在細(xì)胞膜上組裝成低聚體[19]，進(jìn)而形成離子滲透孔(ion-permeable pores)破壞細(xì)胞膜的屏障功能，導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂、溶解[20]，上皮細(xì)胞凋亡[21]。溶血素基因vvhA編碼的多肽與霍亂弧菌埃爾托型和霍亂弧菌非01群的溶血素的第一區(qū)及第二區(qū)的氨基酸分別有65%和60%的相似度，通過Ⅱ型分泌途徑被分泌到胞外[22]。

1.2MARTX毒素MARTX(multifunctional-autoprocessing repeats-in-toxin)毒素，是創(chuàng)傷弧菌重要的毒力因子之一，分子量巨大，由4 000多個氨基酸殘基組成，屬于重復(fù)子毒素家族(RTX)，在其C段重復(fù)出現(xiàn)9個串聯(lián)的氨基酸的特殊分子結(jié)構(gòu)[23]。MARTX毒素是創(chuàng)傷弧菌抵抗宿主免疫防御的一個重要工具，穿過宿主細(xì)胞膜時，會把自己分割成小分子效應(yīng)因子進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。釋放的效應(yīng)因子通過作用于宿主細(xì)胞的信號通路，有效地抑制了由Rac1調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞免疫吞噬作用、細(xì)胞遷移和抗菌氧自由基的產(chǎn)生[24]。小鼠疾病模型研究表明，MARTX毒素和VVH這2種毒力因子缺少其中任何一種，創(chuàng)傷弧菌臨床分離株就不能使小鼠致病，MARTX毒素可能通過與VVH相互協(xié)作，共同促使腸道黏膜的炎癥快速發(fā)展，致使上皮細(xì)胞變性壞死[25]。

1.3鐵載體鐵攝取系統(tǒng)是創(chuàng)傷弧菌的關(guān)鍵致病因子[26]。鐵是幾乎所有生物體必需的微量營養(yǎng)素，從環(huán)境中獲取鐵對細(xì)菌至關(guān)重要。然而，由于血液中的鐵通常與鐵螯合蛋白如轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白以高親和力結(jié)合，人體中的可溶性鐵是非常有限的，不能維持細(xì)菌生長。創(chuàng)傷弧菌可通過表達(dá)兒茶酚鐵載體(vulnibactin)和異羥肟酸鐵載體來攝取鐵，其中酚鹽類鐵載體是其主要的方式[27]。研究表明，當(dāng)兒茶酚鐵載體相關(guān)基因(vuuA、venB、vvsA、vvsB)發(fā)生突變時，創(chuàng)傷弧菌菌株的毒力將會降低[28]。

1.4莢膜多糖莢膜是構(gòu)成細(xì)菌與外界環(huán)境之間的一道屏障，是許多病原菌重要的毒力因子之一。莢膜對細(xì)菌入侵過程中的黏附、逃避巨噬細(xì)胞吞噬作用以及促進(jìn)全身感染是十分必要的。莢膜也是創(chuàng)傷弧菌的一個重要致病因子[29]，創(chuàng)傷弧菌的菌落形態(tài)及毒性作用與其莢膜的表達(dá)密切相關(guān)，菌落透明的創(chuàng)傷弧菌不產(chǎn)生莢膜，對小鼠不具有致病性，而菌落不透明的創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生莢膜，對小鼠有致死性[30]。

2 創(chuàng)傷弧菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展

目前，生化特征仍是弧菌鑒定分類的常用方法，但是這種方法操作繁瑣又耗時費(fèi)力，易受人員的主觀判定干擾，而且弧菌屬主要病原菌表型相似性較高，弧菌屬細(xì)菌的生化特征不穩(wěn)定，給弧菌的鑒定帶來了很大困難和不確定性，弧菌的鑒定結(jié)果也經(jīng)常不準(zhǔn)確。而一些商業(yè)化的微生物快速檢測系統(tǒng)如API VITECH等的檢測原理也是根據(jù)生化反應(yīng)，對致病性弧菌的檢測準(zhǔn)確度不高，不利于病原菌的確定和治療措施的及時應(yīng)對[31]。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物的檢測已從傳統(tǒng)的生化、免疫學(xué)方法逐漸發(fā)展為基因水平的檢測。常規(guī)PCR及其衍生技術(shù)在創(chuàng)傷弧菌的快速檢測中不斷得到運(yùn)用和發(fā)展。

2.1常規(guī)PCR技術(shù)Hill等[32]基于vvhA基因首次建立了創(chuàng)傷弧菌的PCR檢測方法，對5株創(chuàng)傷弧菌和22株其他細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所測創(chuàng)傷弧菌都得到一條519 bp的特異性條帶，而其他菌株沒有特異性擴(kuò)增，對于經(jīng)堿性蛋白胨水(alkaline peptone water,APW)24 h增菌的人工染菌牡蠣樣品，檢出限為100 CFU/g。Kumar等[33]建立的基于gyrB基因的海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌PCR檢測方法，所測創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)一條28 bp的特異性條帶，其他弧菌和非弧菌細(xì)菌無特異擴(kuò)增。對于不經(jīng)過增菌步驟的人工染菌牡蠣，該法的檢出限為300 CFU/g，而對于APW 18 h增菌的樣品，檢出限為30 CFU/g。PCR方法雖然實(shí)現(xiàn)了致病菌的快速檢測，但如何避免假陽性結(jié)果仍然是一個挑戰(zhàn)，需要非常嚴(yán)格的引物設(shè)計(jì)，包括引物特異性、引物長度、解鏈溫度、GC含量、較少的二級結(jié)構(gòu)和PCR退火溫度，以實(shí)現(xiàn)其高特異性。

2.2多重PCR技術(shù)隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，由基本的PCR原理衍生出的改進(jìn)方法不斷出現(xiàn)，其中多重PCR技術(shù)(Multiplex PCR)具有高效、快捷和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時擴(kuò)增出多個核酸片段，克服了單重PCR缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對同一基因組多個位點(diǎn)或不同基因組多個位點(diǎn)的同時檢測。張新中等[34]采用多重PCR的方法同時檢測創(chuàng)傷弧菌gyrB基因的3個位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的3對引物分別擴(kuò)增得到481、702和1 065 bp的DNA片段，能夠更為準(zhǔn)確地甄別病原體，該方法的靈敏度為102 CFU/mL。Lee等[35]采用多重PCR的方法同時檢測純培養(yǎng)物和染菌牡蠣中鼠傷寒沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌的，發(fā)現(xiàn)染菌牡蠣勻漿3 h增菌后的創(chuàng)傷弧菌檢出限為100 CFU/g。Bauer等[36]建立了基于toxR基因的多重PCR方法檢測創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌，如果已知待測菌株的原始菌落形態(tài)，該法的效果良好，否則溶藻弧菌會對結(jié)果產(chǎn)生影響。Tarr等[37]建立了檢測霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌的多重PCR方法，對190株代表菌株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增片段，由于多重PCR反應(yīng)體系中多對引物同時擴(kuò)增，如果試驗(yàn)條件控制不當(dāng)，容易出現(xiàn)擴(kuò)增失敗或非特異性擴(kuò)增。成功的多重PCR方法是基于引物的特異性以及多對引物對濃度、退火溫度、底物濃度達(dá)到平衡的狀態(tài)，因此引物的設(shè)計(jì)及對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化是建立該方法的關(guān)鍵所在。

2.3DPO-PCR技術(shù)PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板DNA之間互補(bǔ)的程度，因此，引物的設(shè)計(jì)對于PCR特異性反應(yīng)顯得尤為重要[38]。2007年韓國Seegene公司首次提出一種新型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)方法即雙啟動寡核苷酸引物(dual primingoligonucleotide，DPO)，提高了PCR反應(yīng)特異性[39]。最近，Xu等[40]基于DPO技術(shù)建立了DPO-多重PCR方法檢測海產(chǎn)品中霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌等4種主要致病菌，設(shè)計(jì)的特異性引物分別靶向霍亂弧菌mdh、創(chuàng)傷弧菌vvhA、溶藻弧菌colH和副溶血性弧菌toxR基因；為了測試其特異性，該研究使用了396種細(xì)菌菌株，包括209種目標(biāo)菌株和187種其他細(xì)菌菌株，結(jié)果顯示特異性PCR產(chǎn)物僅在靶細(xì)菌菌株中觀察到。與常規(guī)PCR檢測相比，該DPO-多重PCR方法允許在更寬的退火溫度(48～68 ℃)下有效擴(kuò)增靶基因，對于每種弧菌的純培養(yǎng)物或人工污染的食物基質(zhì)樣品，其分析檢測限均小于1.510 CFU?？梢姡嘀豍CR中引入DPO引物技術(shù)，大大提高了多重PCR檢測結(jié)果的靈敏度及特異性。

2.4RT-qPCR技術(shù)實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)自1996年由美國AppliedBiosystems公司推出后，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，該技術(shù)是利用反應(yīng)體系中熒光信號的積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR的進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析[41]。RT-qPCR結(jié)合了常規(guī)PCR的核酸擴(kuò)增高效性，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量等多種優(yōu)點(diǎn)，且操作完全封閉，儀器直接讀數(shù)，結(jié)果判斷更加客觀真實(shí)。通過查詢中國標(biāo)準(zhǔn)在線服務(wù)網(wǎng)(http：//www.spc.org.cn)發(fā)現(xiàn)，截至目前，我國頒布的基于PCR技術(shù)的國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有305個，其中涉及實(shí)時熒光PCR的有180個，約占60%，說明實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性、可靠性及高效性得到各個行業(yè)的認(rèn)可，也為實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。王紫薇等[42]在北京市市場隨機(jī)采集的105份海產(chǎn)品進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)，并比較了RT-PCR法和VITEK鑒定方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，105份海產(chǎn)品中，有40份樣品檢出創(chuàng)傷弧菌，檢出率為38.10%；其中，蝦類產(chǎn)品檢出率高達(dá)52.38%，其次為貝類產(chǎn)品( 37.88%)和魚類產(chǎn)品(22.22%)；經(jīng)rpoB基因測序驗(yàn)證，RT-PCR和VITEK方法的準(zhǔn)確率分別為100.00%和67.50%。但是RT-qPCR的熒光信號容易受樣品基質(zhì)、培養(yǎng)基、核酸提取試劑等抑制，導(dǎo)致其檢測敏感性顯著降低，影響了該精確定量技術(shù)的適用性，而且探針成本較高、檢測儀器昂貴、操作要求高等諸多因素給RT-qPCR在基層的推廣應(yīng)用帶來一定困難。另外一個局限性是該技術(shù)只能對反應(yīng)體系中模板DNA進(jìn)行定量，無法鑒別污染樣品的細(xì)菌是死菌還是活菌。

2.5MPN-PCR技術(shù)最大可能數(shù)(most probable number MPN)法是依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出目標(biāo)菌統(tǒng)計(jì)學(xué)上的估計(jì)值，是常用的微生物半定量檢測方法[43]。MPN法的試驗(yàn)過程涉及細(xì)菌的復(fù)蘇和選擇性富集，可以在大量雜菌存在條件下檢出活的目標(biāo)菌。國家食品安全風(fēng)險評估中心2015年發(fā)布的《國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》中8種食源性致病菌的定量檢測方法，除了銅綠假單胞菌外均推薦了MPN法[44]。將PCR技術(shù)和MPN法的結(jié)合應(yīng)用也越來越多，這提高了檢測速度，也提高了檢測敏感性。Bonny等[45]結(jié)合MPN法和多重PCR技術(shù)建立了MPN-多重PCR方法，定量檢測樣品中副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌；該研究共分析了120份魚樣，副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的患病率分別為48.33%、27.00%和32.50%；當(dāng)應(yīng)用單純化MPN-PCR時，在P<0.05時獲得類似的結(jié)果，驗(yàn)證了多重MPN-PCR的準(zhǔn)確性；所測試的樣品中副溶血性弧菌、霍亂弧菌以及創(chuàng)傷弧菌的污染量分別為0～2.43×106、0～2.16×106和0～4.93×105MPN/g。

2.6LAMP技術(shù)常規(guī)PCR檢測、多重PCR及熒光定量PCR檢測雖然特異性和敏感性強(qiáng)，但是需要專業(yè)人員操作，所需設(shè)備儀器比較昂貴，一定程度上阻礙了這種方法的廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是由日本學(xué)者Notomi于2000年首次報(bào)道的一種適用于基層診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[46]，此技術(shù)在恒溫條件下即可完成核酸的擴(kuò)增，具有耗時少、成本低、技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，近年來已被廣泛用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲等各種病原體的相關(guān)研究。Ren等[47]首次建立了基于溶細(xì)胞素基因的創(chuàng)傷弧菌LAMP檢測方法，利用該方法對31株菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，LAMP反應(yīng)對創(chuàng)傷弧菌具有高度特異性，且比常規(guī)PCR靈敏10倍。別闖南等[48]分別以創(chuàng)傷弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A，HA)和多重毒素(repeats in toxin，RTX)毒力基因的保守序列作為靶序列設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物，建立了快速檢測致病性創(chuàng)傷弧菌2種毒素的LAMP方法，該LAMP檢測創(chuàng)傷弧菌的2種基因的靈敏度都達(dá)10 CFU/mL。在人工模擬樣品檢測中，LAMP結(jié)果顯示，采用水煮法提取DNA，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果耗時1.5 h，魚肉中創(chuàng)傷弧菌的檢出限為1×102CFU/g(RTX)和1×104CFU/g(HA)；采用同樣方法提取DNA進(jìn)行普通PCR，其檢出限為1×103CFU/g(RTX)和1×104CFU/g(HA)，耗時4 h。

3 結(jié)語

創(chuàng)傷弧菌是一種重要的海洋動物病原菌，可造成養(yǎng)殖水產(chǎn)品的病害。同時也是一種致命的人類機(jī)會致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關(guān)[49]。創(chuàng)傷弧菌由于對易感人群的高致死率，也被稱為“食肉細(xì)菌”，引起的原發(fā)性敗血癥的死亡率超過50%[50]。除了原發(fā)性敗血癥之外，通過接觸存在有創(chuàng)傷弧菌的海水或海產(chǎn)品引起的傷口感染，死亡率約為25%[51]。因此，對創(chuàng)傷弧菌生物學(xué)特性的深入了解以及病原菌快速檢測顯得尤為重要。由于創(chuàng)傷弧菌在低于13 ℃的溫度下不能生長，因此可以利用這點(diǎn)，在食用海鮮產(chǎn)品前將海鮮產(chǎn)品冷卻至低于此溫度保藏幾個小時，以最大限度地降低感染風(fēng)險，當(dāng)然這會影響海鮮產(chǎn)品的新鮮度和口感。由于創(chuàng)傷弧菌感染通常是致命的，并且預(yù)后與診治的速度、準(zhǔn)確度直接相關(guān)。因此，建立一種快捷、簡便、實(shí)用性強(qiáng)的檢測方法對于創(chuàng)傷弧菌感染的早期診斷和及時治療是至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR及其衍生技術(shù)也在不斷地改進(jìn)，更多新的、優(yōu)秀的創(chuàng)傷弧菌快速檢測技術(shù)將不斷涌現(xiàn)，使包括創(chuàng)傷弧菌在內(nèi)的病原微生物的檢測更加準(zhǔn)確、特異與靈敏。