劉欣宇， 林 英， 郭永康， 黃玉茜*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 土地與環(huán)境學(xué)院， 遼寧 沈陽 110161;2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 遼寧 沈陽 110886;3.中國(guó)海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院， 山東 青島 266003)

花生網(wǎng)斑病(Peanut Web Blotch)是在花生種植中較為普遍的一種病害[1]，其病原為Phomaarachidicola,該病害主要在葉片正面上形成邊緣網(wǎng)紋狀不規(guī)則褐色病斑[2]，使葉片光合作用下降，造成嚴(yán)重落葉，果實(shí)不飽滿，進(jìn)而使花生減產(chǎn)，嚴(yán)重者可達(dá)30%。

白沙1016是我國(guó)推廣面積最大的珍珠豆型花生品種之一，具有早熟、豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等突出特性。生育期約為95～120 d，株高大約38 cm，分枝8個(gè)左右。500 g果數(shù)335個(gè)，500 g仁數(shù)835個(gè)，百果重150 g，百仁重60 g，出仁率75%。粗脂肪含量56.0%。開花較早，花期集中，莢果發(fā)育較快。果針入土淺，果柄堅(jiān)韌，成熟后收獲落果較少?？购?、抗倒性較強(qiáng)，抗葉斑病強(qiáng)。

當(dāng)前白沙1016在我國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)及其他地區(qū)的種植面積較大，是全國(guó)整體花生產(chǎn)量的重要組成部分。本文針對(duì)白沙1016感染網(wǎng)斑病菌后其體內(nèi)的生理生化反應(yīng)展開研究，測(cè)量其感染后體內(nèi)超氧陰離子、MDA含量和防御酶活性的變化，旨在探索白沙1016對(duì)花生網(wǎng)斑病的抗性及其抗病機(jī)制，為改良白沙1016品種、提高花生網(wǎng)斑病抗性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

供試花生網(wǎng)斑病病葉從遼寧省沈陽地區(qū)一花生網(wǎng)斑病發(fā)病植株上采集，采用單孢分離法用PDA培養(yǎng)基在紫外照射條件下對(duì)花生網(wǎng)斑病菌進(jìn)行培養(yǎng)，之后純化分離，保存于4 ℃條件下。

1.1.2 供試品種

供試花生品種為白沙1016，由遼寧省農(nóng)科院植保所提供。

1.2 方 法

1.2.1 植株培養(yǎng)

供試花生籽粒用70%酒精消毒后，放入26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，選取發(fā)芽一致的籽粒栽種在直徑10 cm的花盆中，進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)栽種10盆。

1.2.2 植株接菌

在開花下針期進(jìn)行接種病菌，將供試菌種用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁25 d，以無菌水沖刷調(diào)配出1×106CFUmL-1孢子懸浮液，加入0.1%吐溫20以增加孢子與葉片的黏著度，再加入適量蔗糖以保持孢子活性，4 ℃下保存?zhèn)溆?。?0%酒精對(duì)花生葉片消毒1 min，再以無菌水擦拭5次，將孢子懸浮液噴施于葉片之上。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以同樣方法對(duì)花生葉片進(jìn)行消毒、擦拭并在葉片上噴施蒸餾水，將接種與陰性對(duì)照植株套袋密封以保濕，放置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)病情況調(diào)查

隨機(jī)抽樣10株，統(tǒng)計(jì)每株葉片數(shù)和各級(jí)病葉數(shù)，計(jì)算病葉率和病情指數(shù)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)病情況調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考王玲杰[14]的方法。每株隨機(jī)抽取30片葉，按照葉片正面病斑面積大小，將發(fā)病程度分為6級(jí):1級(jí),病斑面積為0；2級(jí),病斑面積<10%；3級(jí),10%≤病斑面積<25%；4級(jí),25%≤病斑面積<50%；5級(jí),50%≤病斑面積<75%；6級(jí),病斑面積≥75%。病情指數(shù)的計(jì)算方法為

1.2.4 取 樣

于葉片刮傷接種后的0、24、48、72、96、120、144 h選取相同部位對(duì)各株花生取樣，用消毒后的醫(yī)用剪刀剪下被接種的葉片，樣品套袋后放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 生化指標(biāo)測(cè)定方法

MDA濃度=6.452×(A532-A600)-0.559×A450，

MDA含量=(MDA濃度×Vt)/(Vs×W)，

其中Vt為提取液總體積(mL)，Vs為測(cè)定用提取液體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種抗性鑒定

白沙1016的發(fā)病級(jí)別為4.15，病情指數(shù)為52.5，數(shù)值均比較大，屬于感病品種。且品種鑒定與田間發(fā)病表現(xiàn)一致，說明白沙1016的抗性遺傳較為穩(wěn)定。

2.2 網(wǎng)斑病菌對(duì)白沙1016活氧代謝的影響

圖1 網(wǎng)斑病菌侵染后白沙1016葉片含量變化

2.3 網(wǎng)斑病菌對(duì)白沙1016葉片MDA含量的影響

由圖2可知，白沙1016感染網(wǎng)斑病菌后，其體內(nèi)MDA含量發(fā)生明顯變化。0～48 h期間MDA含量上升，在48 h達(dá)到第一個(gè)峰值，隨后含量下降。至72 h時(shí)MDA含量再次上升，上升趨勢(shì)持續(xù)到120 h并出現(xiàn)第二個(gè)峰值，且高于第一個(gè)峰值，隨后MDA含量下降。

圖2 網(wǎng)斑病菌侵染后白沙1016葉片MDA含量的變化

2.4 網(wǎng)斑病菌對(duì)白沙1016防御酶活性的影響

由圖3可見，白沙1016感染網(wǎng)斑病菌后，其體內(nèi)4種主要防御酶的活性均產(chǎn)生明顯變化。0～48 h期間，CAT活性明顯升高，并在48 h達(dá)到峰值，隨后下降，至72 h時(shí)又再次上升，至120 h趨于平緩。感染網(wǎng)斑病菌后，PAL活性持續(xù)增加，但幅度相對(duì)其他防御酶較小，72 h后，PAL活性變化趨于平穩(wěn)，于96 h達(dá)到峰值。0～48 h期間，POD活性呈先升后降趨勢(shì)，在24 h達(dá)到第一個(gè)峰值。48 h后，POD活性上升至72 h時(shí)達(dá)到第二個(gè)峰值，且高于第一個(gè)峰值，隨后活性下降，120 h后活性保持平緩。0～72 h期間，SOD活性持續(xù)下降，并在72 h時(shí)達(dá)到最低值，隨后活性上升。

圖3 網(wǎng)斑病菌侵染后白沙1016葉片防御酶活性的變化

3 結(jié)果與討論