肝纖維化動物模型研究進展

梁麗清，蘇華珍，陳少鋒

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001）

肝纖維化是由病毒感染、酒精、藥物、毒物、寄生蟲、膽汁淤積和代謝性疾病等因素刺激引起肝臟“損傷-修復”的病理過程。肝纖維化進一步發(fā)展可引起肝小葉改變、假小葉與結節(jié)形成，最終可發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前的研究證實肝纖維化過程具有可逆性［1］，對肝纖維化進行早干預、早治療，對預防肝硬化及肝癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。肝纖維化模型的建立，對研究肝纖維化發(fā)生機制及病理過程有著極大的作用，也是研究肝纖維化治療藥物的基礎。目前，已有許多國內外的學者對肝纖維化動物模型進行研究，本文對目前常用的幾種肝纖維化動物模型進行綜述。

1 化學藥物誘導的肝纖維化動物模型

化學藥物或毒物可誘導肝纖維化的發(fā)生，大劑量或長期給予大鼠具有肝毒性的化學藥物或毒物，可致使機體發(fā)生慢性肝損害而造模。常用的造模藥物有四氯化碳（CCl4）、二甲基亞硝胺（DMNA）、硫代乙酰胺（TAA）等。

1.1 CCl4誘導的肝纖維化模型 CCl4構建的動物肝纖維化模型是國內外廣泛應用的經(jīng)典研究方法。四氯化碳作為一種常用的有機溶劑，對肝臟具有毒性作用，可引起肝細胞的壞死，CCl4可通過升高NO（一氧化氮）而增加炎癥介質釋放和增加氧化應激，增加TGF-β1的表達而誘導HSC（肝星狀細胞）的激活，促進HSC的增殖，增加肝臟血小板源性生長因子-BB（PDGF-BB）、腫瘤壞死因子（TNF-α）表達而使HSC活化，細胞外基質增加從而引起肝纖維化［2］。CCl4誘導的肝纖維化模型一般采用20%～60%［3-5］的四氯化碳花生油、橄欖油、茶油溶液，造模途徑有口服、吸入、腹腔注射及皮下注射等，給藥劑量和給藥途徑不同，成模的時間不同，一般為8周～4個月不等。魏曉光等［6］使用SD大鼠，以40%CCl4橄欖油混懸液按照1.0 ml/kg腹腔注射，每周3次，共8周，有效建立大鼠肝纖維化模型，建模成功率達88.3%。許建明等［7］給予昆明種小鼠皮下注射5 ml/kg 20%CCl4茶油溶液，每5天1次，連續(xù)3個月，可導致小鼠肝纖維化的形成，且有較明顯的肝纖維化的階段性變化。CCl4造模法價格低廉，操作簡便，病變過程穩(wěn)定，病理結果可靠，在形態(tài)學病理學方面與人肝纖維化具有相似性，適用于大鼠、小鼠等動物的肝纖維化模型建立，缺點是造模時間較長，CCl4溶液劑量若把握不當，可能引起較高的死亡率。

1.2 DMNA誘導的肝纖維化模型 二甲基亞硝銨具有顯著的肝毒性，它可在體內代謝為乙醛等高反應活性的代謝物，可以與蛋白質、巰基基團、游離氨基酸等反應，破壞這些大分子的結構，與細胞膜或線粒體膜表面膜蛋白結合形成復合物，從而造成肝細胞壞死、細胞外基質進行性增加而造成肝纖維化［8］。DMNA誘導的肝纖維化模型常用腹腔注射0.5%～1%DMNA溶液，一般模型建立約需4周。DMNA建立肝纖維化模型相對穩(wěn)定，不易自愈。Risteli等［9］研究發(fā)現(xiàn)由DMNA造成的肝纖維化可在停藥后維持約2個月，是研究肝纖維化治療藥物的一個較好的模型。馮琴等［10］使用Wistar大鼠，每周3次腹腔注射0.5%DMNA溶液2 ml/kg，持續(xù)3周，第4周連續(xù)3天的劑量分別為平時劑量、2/3平時劑量、1/2平時劑量。造模后，大鼠出現(xiàn)典型的肝纖維化病理改變。賀文廣等［11］給予Wistar大鼠腹腔注射 1%DMNA生理鹽水溶液，劑量為10 mg/kg，隔日1次，每周3次，共4周，結果成功建立肝纖維化模型，造模存活率為86.4%。DMNA為一級誘癌劑，在實驗過程中需做好安全防護。

1.3 TAA誘導的肝纖維化模型 硫代乙酰胺作為一種肝毒劑，可引起肝纖維化，甚至肝硬化。TAA能夠作用于肝細胞DNA、RNA和蛋白質相關的合成酶，產(chǎn)生毒性作用，并能夠影響肝臟代謝，引起代謝紊亂，甚至肝壞死［12］。TAA制備肝纖維化模型，成模率高，造模期間并發(fā)癥少，死亡率低，且形成的肝纖維化較難自愈。一般采用灌胃、皮下注射和腹腔注射，2～3次/周，造模周期一般大于4周。薛改等［13］使用質量濃度為3%的TAA對SD大鼠進行灌胃，劑量為160 mg/kg，隔天1次，灌胃6周后，處死大鼠取血清和肝臟，分別進行肝功能及病理檢測，留取部分成模大鼠，停止灌服TAA 11周后，取肝組織進行HE染色，觀察肝纖維化自愈情況，發(fā)現(xiàn)TAA灌胃6周后，肝纖維化形成率為100%，停用TAA 11周后，與11周前相比，HE染色顯示肝纖維化程度未見顯著變化。景晶等［14］以3%TAA生理鹽水溶液，150 mg/kg每周2次腹腔注射SD大鼠，連續(xù)12周，病理可見多數(shù)肝小葉結構被破壞或消失，由匯管區(qū)和中央靜脈伸出粗大膠原條索把肝小葉分割，包繞肝小葉，肝細胞索排列混亂，纖維隔內有大量成纖維細胞浸潤。何麗明等［15］以200 mg/kg硫代乙酰胺溶液腹腔注射ICR小鼠，隔天1次，連續(xù)7周，模型組小鼠可見肝小葉結構破壞嚴重，肝索排列紊亂，形成假小葉，有炎性細胞浸潤和膽管細胞增生。除上述方法外，還有二乙基亞硝胺［16］及半乳糖胺［17］誘導的肝纖維化造模法。

2 酒精誘導的肝纖維化模型

在體內，90%～95%的乙醇會被肝臟代謝，乙醇可使肝臟的氧消耗增加，并減少小葉中心肝細胞氧供，引起小葉中心肝細胞的炎癥和壞死，促發(fā)肝纖維化；另外，乙醇在肝臟代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物乙醛對肝臟產(chǎn)生直接損害，乙醛可直接刺激膠原蛋白的合成，促進肝纖維化的發(fā)生，在肝臟還可使輔酶Ⅰ（NAD）轉變?yōu)檫€原性輔酶Ⅰ（NADH）從而影響三羧酸循環(huán)，使脂肪氧化減弱，脂肪酸形成增多，形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。酒精誘導的肝纖維化模型方法簡單，價格低廉，但若灌胃操作不當易引起動物死亡，需要掌握灌胃量及操作技術。石曉等［18］采用Wistar大鼠每日灌胃乙醇進行造模，酒精濃度采取逐級遞增的方法:第 1～4周 4.5 g/kg，第 5～8周6.5 g/kg，第9～12周9.0 g/kg，第13～24周9.6 g/kg，造模持續(xù)24周后出現(xiàn)肝纖維化。黃靜等［19］給大鼠灌服白酒-玉米油-吡唑混合液，每日1次（其中56度白酒5 g/kg，玉米油2 ml/kg，吡唑27.2 mg/kg），并給予高脂飼料（87.5%基礎飼料，10%豬油，2%膽固醇）飼養(yǎng)，連續(xù)16周后，大鼠肝臟組織膠原纖維增生明顯，匯管區(qū)、中央靜脈及肝實質內有大量的膠原沉積，并進入肝小葉形成不完全間隔。

3 免疫性肝纖維化模型

免疫性肝纖維化的原理主要是利用異體抗原進入體內引起機體免疫應答，產(chǎn)生抗體，繼而形成大量免疫復合物，在中央靜脈、匯管、肝竇、血管壁沉著，引起炎癥反應，刺激膠原形成，進而引起肝纖維化。常用豬血清［20］、牛血清［21］、血吸蟲?。?2］等進行模型建立。該造模方法適合于免疫方面肝纖維化的機制研究及藥物篩選研究，但造模周期長，死亡率高，并有自愈傾向。劉瑛等［23］給SD大鼠使用豬血清進行腹腔注射，每周2次，劑量為0.5 ml/只，共15周，可見模型組纖維組織明顯增生，纖維間隔增多增寬，并向肝小葉內伸展，交錯呈網(wǎng)狀結構，將肝小葉分割，形成完全或不完全假小葉，肝細胞明顯變性腫脹，部分有點狀壞死，匯管區(qū)擴大，伴大量炎性細胞浸潤。刀豆蛋白也可誘導免疫性肝纖維化，使用刀豆蛋白（10 mg/kg）給小鼠尾靜脈注射，2次/周，8周后肝小葉結構破壞，可見明顯纖維間隔形成［24］。

4 復合因素導致的肝纖維化模型

由于單因素建立肝纖維化模型存在一定的弊端，如造模周期長，某些肝毒性物質毒性大易造成動物死亡等，復合因素造模可提高造模成功率，并且可以縮短造模周期，目前復合因素造模法也是一種比較常用的方法。如高脂、酒精刺激和豬血清腹腔注射造模［25］，喂食酒精、玉米油、吡唑結合微量CCl4腹腔注射［26］，背部皮下注射CCl4并以5%乙醇為飲用水［27］等方法。

5 膽汁淤積性肝纖維化模型

膽汁淤積性模型是人為造成的膽管阻塞，膽汁淤積，肝細胞漿內膽色素沉積，從而引起肝細胞缺血、變性和壞死，纖維組織增生進而引起肝纖維化。該方法建立的模型周期短，炎癥反應輕微，實驗中無對人和動物有毒的物質，是比較理想的研究肝纖維化機制、篩選抗肝纖維化治療藥物的模型。但該模型對操作技術要求較高，若結扎的膽管再通，可能造成膽汁過度淤積引起動物死亡。目前主要有膽總管結扎法［28］、逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽加膽管結扎［29］等。劉迎春等［30］采用SD雄性大鼠，腹腔麻醉后分離膽管，以絲線兩處剪斷1 cm結扎膽管，第4周可見大量膠原組織沉積，纖維增生明顯，膠原纖維從匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內延伸，第6～8周肝組織結構破壞更嚴重，肝細胞大片狀變性、壞死及空泡變，見大量炎細胞浸潤，大量膠原纖維從匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內延伸，可見假小葉形成，病理學分級為S3～S4。

6 肝缺血再灌注誘導的肝纖維化模型

肝缺血再灌注誘導的肝纖維化模型是利用肝缺血再灌注操作形成的一種新型肝纖維化模型，該方法建立的模型符合臨床實際，在嚴重肝外傷、肝移植、休克復蘇時均不可避免出現(xiàn)肝缺血再灌注損傷、多種細胞因子釋放、炎癥細胞浸潤等過程促進肝纖維化的發(fā)生，建立肝缺血再灌注損傷肝纖維化模型，可為這方面的研究提供一種新的方向。劉俊平等［31］用無創(chuàng)動脈夾夾閉大鼠肝左葉和中葉的肝動脈、門靜脈，造成70%的肝臟缺血，夾閉90 min后，開夾，繼續(xù)飼養(yǎng)4周后大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞腫脹、胞質透亮、氣球樣變性、壞死，部分有炎性細胞浸潤，匯管區(qū)結締組織有不同程度增生。

7 討 論

除上述肝纖維化模型外，近些年還常用的有脂肪性肝纖維化模型［32］、乙肝病毒轉基因模型［33］、放射性肝纖維化模型［34］等。這些動物模型各有特點，發(fā)病機制亦不盡相同，在某些方面與人類肝纖維化機制具有相似之處，在研究過程中可根據(jù)需要進行選擇，但目前尚未有與人類肝纖維化疾病反應完全相同的動物模型，這也是學者們研究的難點，需要繼續(xù)進行更加深入的研究。