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      豬流行性腹瀉研究進(jìn)展

      2019-03-18 21:47:19蒲翠敏張明華周碧君程振濤王開功
      貴州畜牧獸醫(yī) 2019年2期
      關(guān)鍵詞:膠體金豬場母豬

      田 琴, 李 晨, 蒲翠敏, 周 怡, 張明華, 周碧君,2,3, 程振濤,2,3, 文 明,2,3, 王開功,2,3?

      (1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病研究室,貴州 貴陽 550025;3.貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

      豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性、高度接觸性腸道傳染病[1]。各個(gè)日齡的豬群均可感染,臨床癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水以及食欲下降等,給許多國家養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。PED在冬季和春季極易發(fā)生,夏季相對較少,豬的年齡越小發(fā)病率越高,其中對哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重[4]。PEDV引起的臨床癥狀與傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒(PoRV)有許多相似之處,應(yīng)注意這3者之間的區(qū)分[5]。自2012年以來,我國各地豬群暴發(fā)的腹瀉疫情中PEDV是主要病原[6]。PEDV感染后發(fā)病率可高達(dá)100%,死亡率為30%~80%,是導(dǎo)致仔豬在早期發(fā)生死亡的主要疾病之一[7,8]。

      1 發(fā)展史

      1.1 國外PED于20世紀(jì)70年代初期在英國、比利時(shí)發(fā)生并造成小范圍流行,1978年首次從腹瀉仔豬體內(nèi)分離到該病病原,并命名為PEDV[9]。其他一些國家也逐漸分離到了PEDV流行毒株,但并未形成大范圍的流行。1990—2000年日本、韓國、中國等亞洲東部國家暴發(fā)PED,對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1993年日本、荷蘭、匈牙利、英格蘭等歐洲國家也逐漸發(fā)生PED流行。2007年泰國暴發(fā)PED,新生仔豬的死亡率高達(dá)100%,流行毒株基因的遺傳進(jìn)化分析證明,泰國流行毒株與2006年中國多地區(qū)流行毒株同源性達(dá)到96.5%~99.7%,提示1種新型PEDV在亞洲地區(qū)出現(xiàn),并威脅著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。2010年后PED在全球各個(gè)國家均發(fā)生了大面積的流行[10,11]。

      1.2 國內(nèi)我國在1976年首次報(bào)道該病,此后國內(nèi)的各省份都陸續(xù)有PEDV感染報(bào)道[12]。1984年有研究學(xué)者通過熒光抗體實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等證實(shí)了該病在我國的存在,并從南方到北方出現(xiàn)了全面的暴發(fā)。特別是在2010年以來,廣東、廣西、四川等南部省區(qū)先后暴發(fā)PED,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。此病在目前沒有減輕的趨勢,且目前研發(fā)的疫苗免疫很難控制疫病流行。饒永恕等[14]在2011年對PEDV的M基因進(jìn)行分析,說明2013年河南省流行的PEDV是1個(gè)新的基因型,可能起源于泰國或者韓國。疫苗免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因可能是病毒基因型改變。2010年冬季的大暴發(fā)可能是病毒長期衍生和適應(yīng)性累加的結(jié)果[15]。樂正中[16]等 1985年采用免疫熒光直(間)接染色法、免疫熒光抑阻試驗(yàn)、ELISA法、SPACOA法證明貴州省的貴陽、遵義、安順等地區(qū)存在PEDV感染。蒲翠敏[17]等成功建立了 PEDV、TGEV、PoRV三重PCR檢測方法并發(fā)現(xiàn)有3種病毒混合感染的情況。

      2 病原學(xué)與致病機(jī)理

      2.1 病原學(xué)PEDV屬于尼多病毒目,冠狀病毒科,甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的成員,是單股正鏈RNA病毒。雖然PEDV只有1種血清型,但是分子生物學(xué)分析結(jié)果表明,其基因組存在基因多樣性[18]。此病毒的參考毒株為CV777病毒,形態(tài)略呈球形,存在于糞便中的病毒粒子常呈現(xiàn)多形態(tài),平均直徑為130 nm(95~190 nm),有囊膜和纖突,具有侵染性。其基因組全長約28 kb,基因的全長為27 000~33 000個(gè)核苷酸,包括5’端有帽子結(jié)構(gòu)(cap),3’端有poly(A)尾。編碼 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 (S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)和 3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、復(fù)制酶1b和ORF3)[19]。其中,S與M蛋白是決定病毒侵襲與增殖的主要糖蛋白,也包含誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位。此外,S與M基因也被廣泛應(yīng)用于PEDV的分子流行病學(xué)調(diào)查[20]。PEDV對有機(jī)溶劑的抵抗力較弱,乙醚、氯仿、甲醛等均可以使其失去感染性;pH值<4的酸性消毒液與pH值>9的堿性消毒液處理也可使病毒滅活,但PEDV對溫度的抵抗力相對較強(qiáng),4~5℃環(huán)境中保存6 h仍具有感染性[21]。

      2.2 致病機(jī)理病毒經(jīng)口和鼻感染后,直接進(jìn)入小腸。通過免疫熒光和電子顯微鏡檢查,病毒的復(fù)制是在小腸和結(jié)腸絨毛上皮細(xì)胞漿中進(jìn)行,其他臟器內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病毒增殖。由于病毒增殖首先造成細(xì)胞器的損傷,繼而出現(xiàn)細(xì)胞功能障礙。腸絨毛萎縮造成吸收表面積減少,小腸黏膜堿性磷酸酶含量顯著減少進(jìn)而引起營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙,這是引起腹瀉的主要原因,屬于滲透性腹瀉。嚴(yán)重腹瀉引起脫水是導(dǎo)致病豬死亡的主要原因。

      3 流行病學(xué)

      3.1 流行病學(xué)特點(diǎn)PED的發(fā)生有明顯的季節(jié)性,通常于冬季12月至次年的2月發(fā)病,有時(shí)夏季也會(huì)發(fā)病。該病易感染各種日齡的豬,哺乳期、斷奶期和育肥期感染率達(dá)15%~90%,仔豬死亡率為50%,日齡越小被感染的概率越大。斷奶豬、育肥豬感染該病后癥狀比較輕,成年豬則主要表現(xiàn)為嘔吐和厭食等癥狀[22]。自20世紀(jì)80年代國內(nèi)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒至今,豬的感染率在我國呈現(xiàn)逐年升高的態(tài)勢,雖然疫苗在一定程度上起到了保護(hù)作用,但是在2010年之后該病在我國又有流行的趨勢[23]。

      3.2 易感動(dòng)物本病只發(fā)生于豬,各種年齡的豬都能感染發(fā)病。哺乳豬、架子豬或肥育豬的發(fā)病率很高,尤以哺乳豬受害最為嚴(yán)重。母豬發(fā)病率變動(dòng)很大,為15%~90%。

      3.3 傳染源PED屬于急性、接觸性腸道傳染病,主要傳染源為發(fā)病豬和帶毒豬,及其排出的帶毒糞便或污染物。被PEDV污染的運(yùn)輸車輛、水源、飼養(yǎng)員衣服鞋子等也可成為間接感染的傳染源。PEDV暴發(fā)疫區(qū)感染率可達(dá)100%,雖然有些豬群的死亡率較低,但存在持續(xù)帶毒的情況,會(huì)不斷排出帶有PEDV的糞便,對豬舍造成污染,被健康豬帶到其他豬舍也會(huì)造成傳播。其次,由于多種因素的影響,帶毒的豬肉產(chǎn)品進(jìn)入市場,特別是在豬大腸清洗過程中隨意將污水排放,對周圍的養(yǎng)殖場和水源造成污染,都是導(dǎo)致PEDV傳播的傳染源[23]。

      3.4 傳播途徑主要傳播途徑是消化道。如果1個(gè)帶毒豬場陸續(xù)有仔豬出生或斷奶,病毒會(huì)不斷感染失去母源抗體保護(hù)的斷奶仔豬,使本病呈地方流行性,可造成5~8周齡仔豬的斷奶期頑固性腹瀉。

      4 臨床癥狀

      自然感染潛伏期一般為5~8 h,人工感染潛伏期為8~24 h。主要臨床癥狀為水樣腹瀉,或者在腹瀉之間有嘔吐,嘔吐多發(fā)生于吃食或吃奶后。癥狀的輕重隨年齡的大小而有差異,年齡越小癥狀越重。1周齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3~4 h呈現(xiàn)嚴(yán)重脫水而死亡,死亡率可達(dá)50%~100%。病豬體溫正常或稍高,精神沉郁,食欲減退或廢絕。斷奶豬、母豬常表現(xiàn)精神委頓,厭食,持續(xù)性腹瀉大約1周,后逐漸恢復(fù)正常,少數(shù)豬恢復(fù)后生長發(fā)育不良。肥育豬在同圈飼養(yǎng)感染后都發(fā)生腹瀉,1周后康復(fù),死亡率1%~3%。成年豬癥狀較輕,有的僅表現(xiàn)嘔吐,重者水樣腹瀉3~4 h可自愈。

      5 病理變化

      5.1 眼觀病變特征性的病理變化主要見于小腸:小腸腸管擴(kuò)張,內(nèi)容物稀薄,呈黃色、泡沫狀,腸壁弛緩、缺乏彈性、變薄有透明感,腸黏膜絨毛嚴(yán)重萎縮。25%病例胃底黏膜潮紅充血,并有黏液覆蓋,50%病例見有小點(diǎn)狀或斑狀出血,胃內(nèi)容物呈鮮黃色并混有大量乳白色凝乳塊(或絮狀小片),較大豬(14日齡以上)約10%病例可見有潰瘍灶,靠近幽門區(qū)可見有較大壞死區(qū)。

      5.2 組織學(xué)病變顯微鏡下可見小腸絨毛縮短,上皮細(xì)胞核濃縮,胞漿嗜酸性變化。腹瀉嚴(yán)重時(shí),絨毛長度與隱窩比值由正常的7∶1降為3∶1。顯微病變從十二指腸至回腸未端,呈斑點(diǎn)狀分布,受損區(qū)絨毛長度從中等到嚴(yán)重變短,變短的絨毛呈融合狀,帶有發(fā)育不良的刷狀緣。

      6 診斷

      目前用于該病的診斷方法主要有病原檢測技術(shù)、病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光定量PCR技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)檢測法、多重 PCR技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)等[24,25]。要確診該病必須結(jié)合各種檢測手段進(jìn)行綜合判定。

      6.1 病毒分離與鑒定病毒分離與鑒定技術(shù)是檢測病毒的主要方法,也是最切實(shí)可行的方法[26]。收集病豬空腸和腸內(nèi)容物,用加有雙抗的PBS(磷酸鹽緩沖液)配成5倍懸液離心,將離心后的上清液用微孔濾膜過濾,按照一定的比例在單層Vero細(xì)胞上接種,放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4 d,觀察細(xì)胞病變[27]。感染PEDV的Vero細(xì)胞最明顯的病變特征是細(xì)胞融合,形成多核體,并最終凋亡脫落。另外,也可將PEDV接種鴨小腸上皮細(xì)胞系,在胰酶存在的情況下病毒能夠迅速繁殖。

      6.2 病毒中和試驗(yàn)病毒中和試驗(yàn)是通過中和抗體(NAbs)與病毒粒子的結(jié)合阻遏病毒復(fù)制周期中的1個(gè)或多個(gè)步驟,以降低病毒感染力為判定標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法[28],如今已普遍用于PEDV特異性抗體的檢測。

      6.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)當(dāng)前用于檢測PEDV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)主要包括間接法和競爭法2種。間接ELISA使用的抗原主要是全病毒或原核表達(dá)的重組病毒蛋白(S蛋白、N蛋白和M截短蛋白)[26]。競爭ELISA主要使用PEDV特異性單抗或多抗,其主要優(yōu)勢在于特異性,但不足之處是其主要依賴于競爭抗體的獨(dú)特型及其針對靶抗原的特異性[29]。

      6.4 熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR與傳統(tǒng)的PCR方法相比操作步驟更簡便,定量更準(zhǔn)確且污染較小,有很好的靈敏度和可重復(fù)性[30]。

      6.5 反轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測法RTPCR方法簡便、快速、靈敏、特異,是實(shí)驗(yàn)室中常用的分子生物學(xué)診斷方法之一。

      6.6 多重PCR技術(shù)多重PCR技術(shù)是一種特殊形式的PCR,分子生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域研究應(yīng)用到多重PCR,例如病原體鑒定、遺傳性疾病診斷等[31]。即在同一PCR反應(yīng)體系中加入2對以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng),其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。一般PCR僅應(yīng)用1對引物,通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生1個(gè)核酸片段,主要用于單一致病因子如(PEDV)等的鑒定。

      6.7 膠體金免疫技術(shù)免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金免疫技術(shù)由于靈敏性和特異性高的優(yōu)勢,無需特殊儀器,直接可以判斷結(jié)果。張利勃[32]等對金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的膠體金進(jìn)行標(biāo)記作為指示介質(zhì),用重組表達(dá)的PEDV M蛋白抗原和抗金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的基因抗體作為檢測線和指控線,開發(fā)出用于檢測PEDV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條,試驗(yàn)證明該試紙的靈敏度和ELISA幾乎相同,符合率達(dá)96%。該試紙還具有靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn),為基層檢測抗體提供了方便[33]。

      7 防治

      7.1 做好藥物預(yù)防,降低豬群感染本病應(yīng)用抗生素治療無效,可參考豬傳染性胃腸炎的防治辦法。在本病流行地區(qū)可在懷孕母豬分娩前2周,以病豬糞便或小腸內(nèi)容物進(jìn)行人工感染,以刺激其產(chǎn)生乳源抗體,以縮短本病在豬場中的流行。防治:(1)白細(xì)胞干擾素2 000~3 000 IU,每小時(shí)1~2次,皮下注射。(2)口服補(bǔ)液鹽溶液100~200 mL,1次口服。(3)蜂膠療法。以每10 kg體重2~3 g蜂膠的用量配制藥丸喂服,1次/d,連用3~5 d,效果較好[34]。(4)應(yīng)用抗生素(青霉素、四環(huán)素、慶大霉素)防止繼發(fā)細(xì)菌性感染。(5)中藥處方(25 kg以下豬酌減):茯苓 15 g,白頭翁 16 g,紫蘇 16 g,桂枝 12 g,甘草10 g,木香12 g,雙花 15 g,黃芩10 g,生姜12 g,半夏12 g,蒼術(shù)15 g,加水煎為濃縮藥液,灌服[35]。

      7.2 做好免疫接種山,提高豬群免疫力我國已研制出 PEDV甲醛氫氧化鋁滅活疫苗,保護(hù)率達(dá)85%,可用于預(yù)防本病。也可接種豬傳染性胃腸炎、PED二聯(lián)苗,或豬傳染性胃腸炎、PED、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗。妊娠母豬產(chǎn)前1個(gè)月接種疫苗,可通過母乳使仔豬獲得被動(dòng)免疫,也可用豬流行性腹瀉弱毒疫苗或滅活疫苗對仔豬進(jìn)行免疫。

      7.3 加強(qiáng)生物安全,防止病原入侵規(guī)?;i場生物安全包括以下2個(gè)方面:(1)防止病原進(jìn)入豬場,防控疫病在豬場內(nèi)流行或擴(kuò)散至其他豬場。(2)嚴(yán)格控制人員和物資進(jìn)出,制定細(xì)致的進(jìn)場人員和物資消毒程序,確保生物安全制度的跟蹤落實(shí)。

      7.4 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,做好環(huán)境衛(wèi)生(1)首先要保證母豬的飼料質(zhì)量、采食量,提高母豬抵抗力。(2)對仔豬和母豬舍都要勤打掃,做好豬場的環(huán)境衛(wèi)生,做到定期消毒[35]。(3)做好新生仔豬的保溫工作,盡快讓仔豬吃上初乳,提高仔豬的抗病能力。仔豬出生后1~3 d內(nèi)及時(shí)補(bǔ)充鐵制劑,防止缺鐵性貧血的發(fā)生。(4)分階段飼養(yǎng)的豬舍要徹底做好全進(jìn)全出,保證同一豬舍豬群的整體性,便于管理。

      7.5 圍產(chǎn)期母豬保健,降低仔豬發(fā)病率哺乳仔豬發(fā)生病毒性腹瀉多與母豬帶毒有關(guān),應(yīng)做好以下工作:(1)對產(chǎn)前1周母豬進(jìn)行保健,可以清除體內(nèi)毒素,降低體內(nèi)帶毒量。(2)對產(chǎn)后1周母豬進(jìn)行保健,不僅可以減少母豬產(chǎn)后炎癥,還能使仔豬通過母乳獲得一定藥物,有利于控制仔豬的腹瀉。(3)豬場發(fā)生腹瀉期間,通過在圍產(chǎn)期母豬料中加入銀翹散+替米考星,對預(yù)防和治療仔豬的腹瀉具有一定效果。(4)平時(shí)的圍產(chǎn)期保健方案可選用康舒秘+強(qiáng)力霉素、支原凈+阿莫西林等輪換進(jìn)行,均可有效減少母豬產(chǎn)后炎癥以及仔豬腹瀉的發(fā)生。

      近年來貴州省部分地區(qū)PED暴發(fā)嚴(yán)重,感染率居高不下,部分豬場初生仔豬大量死亡,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[5,36]。原因?yàn)檫\(yùn)輸車輛或人員帶入病毒,導(dǎo)致疫情擴(kuò)散至全群。建議豬場運(yùn)出或運(yùn)入豬或物料時(shí)加強(qiáng)消毒,并強(qiáng)化飼養(yǎng)人員的消毒意識(shí),進(jìn)出飼養(yǎng)區(qū)時(shí)更換運(yùn)輸工具,及時(shí)更換衣物并徹底消毒;飼養(yǎng)區(qū)內(nèi)定期采取切實(shí)可靠的消毒措施,不同豬舍的飼養(yǎng)器具要分開,飼養(yǎng)人員不互相串舍。發(fā)生疫情后及時(shí)對病豬進(jìn)行隔離,并送實(shí)驗(yàn)室檢測,以便及早針對病因進(jìn)行治療,將損失降到最低。同時(shí),做好妊娠母豬的飼養(yǎng)管理、初生仔豬的合理免疫接種和哺乳舍環(huán)境衛(wèi)生工作對于防控PEDV感染具有重要意義。

      8 討論

      PED是一種腸道傳染病,PEDV的體外繁殖一直制約著該病的深入研究[37]。該病傳播迅速,在我國豬場中廣泛存在,一旦發(fā)病較難控制,若通過投放大量的藥物進(jìn)行預(yù)防或治療,由于藥物殘留問題會(huì)給食品安全帶來隱患[38]。目前貴州對PEDV的研究還側(cè)重于病原調(diào)查、抗體水平監(jiān)測、分子生物學(xué)等方面[5,39],在蛋白質(zhì)水平、疫苗方面的研究內(nèi)容較匱乏,因此既要研究快速、特異、靈敏的PEDV檢測技術(shù),及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒并進(jìn)行早期控制,防止疫情的擴(kuò)散傳播,減少損失,又要盡快開發(fā)出免疫效果好、特異性高的疫苗進(jìn)行科學(xué)防控。

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