吳侃 王秋菊

常染色體顯性遺傳性耳聾(autosomal dominant sensorineural hearing loss，ADNSHL)是一種遺傳異質(zhì)性明顯的疾病，目前已發(fā)現(xiàn)38個(gè)基因與之相關(guān)(http://hereditaryhearingloss.org)。1992年Leon等[1]在一個(gè)哥斯達(dá)黎加耳聾家系，利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)標(biāo)記的方法定位了第一個(gè)常染色體顯性遺傳性耳聾基因座位，即DFNA1。1997年Lynch等[2]確定DFNA1型耳聾致病基因?yàn)镈IAPH1。20年來(lái)，已有數(shù)個(gè)DIAPH1基因突變引起的遺傳性耳聾家系被報(bào)道，大多數(shù)患者表現(xiàn)為遲發(fā)性聽(tīng)力損失伴或不伴血液學(xué)異常。此外，還發(fā)現(xiàn)DIAPH1基因突變與常染色體隱性遺傳小頭綜合征相關(guān)。遺傳性耳聾具有明顯的表型多樣性和遺傳異質(zhì)性。以往由于上一代測(cè)序技術(shù)的局限，耳聾基因及突變的發(fā)現(xiàn)無(wú)異于大海撈針。近些年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使基因突變的發(fā)現(xiàn)速度大大加快，因此，有必要對(duì)一些常見(jiàn)或具有特征性的基因及突變進(jìn)行梳理和總結(jié)。DIAPH1被認(rèn)為是少數(shù)幾種與低頻聽(tīng)力損失相關(guān)的耳聾基因之一[2～5]。本文將從基因的結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)臨床表型對(duì)DIAPH1基因研究進(jìn)行梳理，以加深對(duì)DIAPH1基因型-表型的關(guān)聯(lián)性認(rèn)識(shí)和臨床遺傳咨詢指導(dǎo)。

1 DIAPH1基因的結(jié)構(gòu)

DIAPH1基因(OMIM:* 602121)全稱diaphanous related formin 1，其他名稱有：DIA1、DRF1、DFNA1、LFHL1、SCBMS、hDIA1。定位于5q31.3，基因組位置chr5:141,515,021-141,619,055，全長(zhǎng)104 035 bp，cDNA含28個(gè)外顯子。由于剪接位點(diǎn)的不同，人類DIAPH1基因有3種不同的轉(zhuǎn)錄變異體(transcript variants)(表1)，包括isoform 1、isoform 2、isoform 3。其中，isoform 1編碼的蛋白質(zhì)最長(zhǎng)，常作為DIAPH1基因編碼DNA的標(biāo)準(zhǔn)序列，其mRNA全長(zhǎng)5 804 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)域在mRNA的142 bp～3 960 bp區(qū)域，編碼含有1 272個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

表1 DIAPH1基因的不同轉(zhuǎn)錄本檢索號(hào)及長(zhǎng)度和其編碼的蛋白質(zhì)及氨基酸*

注：*來(lái)源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

DIAPH1基因編碼的蛋白質(zhì)diaphanous homolog 1屬于diaphanous相關(guān)成蛋白家族(diaphanous-related formins)，目前已發(fā)現(xiàn)了該家族的3個(gè)亞型(DIAPH1、DIAPH2、DIAPH3)，其中DIAPH2與X-連鎖的卵巢功能早衰相關(guān)[6]，DIAPH3與聽(tīng)神經(jīng)病相關(guān)[7]，也有文獻(xiàn)[8～10]報(bào)道其通過(guò)重構(gòu)細(xì)胞骨架來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。而DIAPH1是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白(圖1)，包含GBD結(jié)構(gòu)域(diaphanous GTPase-binding domain)，長(zhǎng)度184個(gè)氨基酸殘基(84～268)；FH3/DID結(jié)構(gòu)域(diaphanous FH3 domain/ diaphanous inhibitory domain)，長(zhǎng)度為192個(gè)氨基酸殘基(274～466)；FH1結(jié)構(gòu)域(formin homology region 1)，長(zhǎng)度為148個(gè)氨基酸殘基(616～764)；FH2結(jié)構(gòu)域(formin homology 2 domain)，長(zhǎng)度為437個(gè)氨基酸殘基(770～1 207)；DAD結(jié)構(gòu)域(diaphanous auto-regulatory domain)，長(zhǎng)度為28個(gè)氨基酸殘基(1 194～1 222)。目前認(rèn)為CC(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域(470～550)參與了FH2二聚體的形成[11]；FH3是否作為一個(gè)獨(dú)立的有作用的結(jié)構(gòu)域仍然有待研究[12]；DID結(jié)構(gòu)域(129～369)是FH3結(jié)構(gòu)域上一段靠近N-末端的氨基酸肽鏈，不容易被蛋白酶所降解[13]，DAD結(jié)構(gòu)域(1 194～1 222)并不是嚴(yán)格意義上的結(jié)構(gòu)域，而是一段FH2結(jié)構(gòu)域C末端側(cè)的20～30個(gè)氨基酸序列[14]。

2 DIAPH1基因的功能研究

DIAPH1基因在肌動(dòng)蛋白微絲和微管細(xì)胞骨架組裝過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其蛋白是Rho小GTP結(jié)合蛋白的效應(yīng)蛋白[12～14]。靜止?fàn)顟B(tài)下C-末端的DAD結(jié)構(gòu)域與N末端的FH3/DID結(jié)構(gòu)域相互作用，DIAPH1蛋白處于自抑制狀態(tài)。而Rho小GTP結(jié)合蛋白通過(guò)占據(jù)DIAPH1蛋白N末端的GBD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合部位[13～15]，在某些共同作用因子(co-facters)的協(xié)助下分兩步解除了自抑制作用[16, 17]。FH1結(jié)構(gòu)域以多聚脯氨酸序列為特征，是profilin(肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合蛋白)的結(jié)合位[18～21]。解除自抑制作用后的FH2結(jié)構(gòu)域在結(jié)合了profilin蛋白的FH1結(jié)構(gòu)域幫助下，將肌動(dòng)蛋白的單體連接到肌動(dòng)蛋白微絲barbed末端[22]，促進(jìn)了聚集成核、延伸、加帽及微絲延長(zhǎng)等過(guò)程，最終對(duì)細(xì)胞的粘附、遷移，對(duì)損傷和感染做出應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[23～25]。

3 DIAPH1基因突變及其相關(guān)表型

1997年以來(lái)，共有來(lái)自哥斯達(dá)黎加、韓國(guó)、德國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、日本等6個(gè)國(guó)家的學(xué)者報(bào)道了該基因的6個(gè)雜合突變與常染色體顯性遺傳性遲發(fā)性聾相關(guān)。本文根據(jù)王秋菊等[26]翻譯整理的2015年ACMG指南和遺傳變異致病性評(píng)價(jià)的相關(guān)文獻(xiàn)[27]對(duì)這些變異致病性進(jìn)行重新評(píng)價(jià)(表2)，并總結(jié)DIAPH1蛋白結(jié)構(gòu)上的突變定位(圖1)，對(duì)臨床表型進(jìn)行總結(jié)梳理(表3、4)。

圖1 DIAPH1蛋白質(zhì)(NP_005210.3)結(jié)構(gòu)域及已知致病突變定位 ?原文使用isoform 2作為轉(zhuǎn)錄本;??表型為常染色體顯性遺傳性聽(tīng)力損失伴或不伴血液學(xué)異常;???表型為常染色體隱性遺傳性小頭綜合征

表2 已報(bào)道的常染色體顯性遺傳DIAPH1突變特征及ACMG指南致病性分析

注：*原文中DIAPH1突變致病性證據(jù)按ACMG指南的標(biāo)準(zhǔn)并不充分，劃為可能致?。?*原文轉(zhuǎn)錄本為isoform 2(NM_001079812.2)，余文獻(xiàn)轉(zhuǎn)錄本為isoform 1(NM_005219.4)；***在ACMG指南中，共分離證據(jù)的強(qiáng)度是PP到PS逐漸增加的，但并沒(méi)有給予相應(yīng)的編號(hào)，故此處以PS表示強(qiáng)的共分離證據(jù)。

表3 已報(bào)道的常染色體顯性遺傳DIAPH1突變的氨基酸改變及其表型特征

注：*MTP(macrothrombocytopenia，巨血小板減少癥)；**NA文中未提及

表4 已報(bào)道的常染色體隱性遺傳DIAPH1突變及其表型特征

注：*MTP(macrothrombocytopenia，巨血小板減少癥)；**NA文中未提及

3.1常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾 1997年Lynch等[2]報(bào)道了1個(gè)8代相傳常染色體顯性遺傳性耳聾的哥斯達(dá)黎加大家系(M家系)，利用家系連鎖分析、Sanger測(cè)序和定位克隆技術(shù)，將DFNA1型耳聾基因定位于5q31.3的DIAPH1基因；其發(fā)現(xiàn)該家系中耳聾患者DIAPH1基因倒數(shù)第2個(gè)外顯子存在一個(gè)G到T的替換，使剪切位點(diǎn)后移，并插入4 bp(TTAA)的堿基，造成下游序列框移突變和翻譯提前終止；突變基因翻譯出的蛋白質(zhì)含有21個(gè)異常氨基酸，尾部缺失32個(gè)氨基酸；家系中的患者多為10歲左右發(fā)病，起病時(shí)為低頻聽(tīng)力損失，逐漸發(fā)展，至30歲左右發(fā)展為雙側(cè)全頻極重度聽(tīng)力損失。隨后Lalwani等[28]對(duì)該家系患者表型進(jìn)行了進(jìn)一步的描述，并推測(cè)內(nèi)淋巴積水有可能是該家系患者出現(xiàn)低頻聽(tīng)力損失的機(jī)制之一。受制于測(cè)序方法的局限性，隨后15年并沒(méi)有再發(fā)現(xiàn)DIAPH1相關(guān)性DFNA1型耳聾，直到2012年Baek等[29]利用新一代測(cè)序技術(shù)，在韓國(guó)8個(gè)小家系中發(fā)現(xiàn)了5種已知耳聾基因的罕見(jiàn)突變位點(diǎn)，其中之一為DIAPH1基因的錯(cuò)義突變c.2032 C>T(p.Pro678Ser)；該突變位于16號(hào)外顯子，造成位于FH1結(jié)構(gòu)域的多聚-L-脯氨酸延伸結(jié)構(gòu)上的疏水的脯氨酸變?yōu)橛H水的絲氨酸，作者猜測(cè)其可能對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合產(chǎn)生影響，最終擾亂耳蝸毛細(xì)胞的極性；家系中患者表型符合DIAPH1相關(guān)性耳聾低頻聽(tīng)力損失的特點(diǎn)，多數(shù)5～10歲發(fā)病，無(wú)其他伴隨癥狀。但參照ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[26]，該家系中兩代4名成員共分離，計(jì)算得知N=1/2×1/2=1/4，BF=3.99～1/N，達(dá)不到有效的共分離證據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)[27]，因此，在文中只能找到1個(gè)PM2、1個(gè)PP3、1個(gè)PP4的證據(jù)，該突變只能被列為可能致病突變。同樣是錯(cuò)義突變，2017年Kang等[30]報(bào)道的DIAPH1新突變c.1589T > G(p.Ile530Ser)，因家系較大，可得出強(qiáng)的共分離證據(jù)PS(強(qiáng)的共分離證據(jù)在ACMG指南中沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的PS編號(hào))，文中共找到1個(gè)PS、1個(gè)PM2、1個(gè)PP3和1個(gè)PP4的證據(jù)，也僅能得出可能致病突變的結(jié)論。該錯(cuò)義突變位于15號(hào)外顯子，推測(cè)非極性的異亮氨酸被極性的絲氨酸所替代，氨基酸極性的變化使CC(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，是DIAPH1突變致病的新假說(shuō)，但仍需要進(jìn)一步的功能研究提供更強(qiáng)烈的致病性證據(jù)。

3.2常染色體顯性遺傳性耳聾伴血液學(xué)異常 2016年Stritt等[31]首次發(fā)現(xiàn)DIAPH1致病突變c.3637C>T(p.Arg1213Ter)不僅引起感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，還與巨血小板減少癥(macrothrombocytopenia，MTP)相關(guān);MTP表現(xiàn)為血小板體積增大和數(shù)目減少，作者將這種綜合征樣表型命名為DIAPH1-RD(DIAPH1相關(guān)性疾病)；在電鏡下觀察可見(jiàn)患者血小板形態(tài)出現(xiàn)異常：細(xì)長(zhǎng)而含顆粒少，球形而顆粒多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和膜復(fù)合物；部分患者可伴有中性粒細(xì)胞減少癥(neutropenia)和出血傾向(abnormal bleeding symptom)；作者推測(cè)該突變導(dǎo)致1 213位精氨酸被終止密碼子替代，造成翻譯提前終止，截短的DIAPH1變異蛋白缺少DAD base RRKR模體(1 213～1 216)，導(dǎo)致DAD-DID蛋白復(fù)合體無(wú)法形成，使DIAPH1喪失自我抑制調(diào)節(jié)能力；而前血小板的形成過(guò)程與上述DIAPH1對(duì)肌動(dòng)蛋白和微管細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)負(fù)調(diào)節(jié)作用相關(guān)[32]；但文中并沒(méi)有詳細(xì)描述患者聽(tīng)力損失的表型特征。Neuhaus等[33]研究發(fā)現(xiàn)位于DIAPH1基因27號(hào)外顯子的框移突變 p.Ala1210SerfsTer31(c.3624_3625delAG)和無(wú)義突變c.3637C>T (p.Arg1213Ter)同樣引起了類似的DIAPH1-RD，并且詳細(xì)分析了患者的聽(tīng)力損失特征，發(fā)現(xiàn)與以往DIAPH1突變引起低頻聽(tīng)力損失不同，該突變患者表現(xiàn)為先天性中高頻聽(tīng)力損失并且快速進(jìn)展，部分患者伴中性粒細(xì)胞減少癥和出血傾向。有研究[33]使用免疫熒光技術(shù)研究了DIAPH1在小鼠耳蝸細(xì)胞及神經(jīng)結(jié)構(gòu)的分布，發(fā)現(xiàn)在耳蝸中的內(nèi)柱細(xì)胞(IPC)、外毛細(xì)胞(OHC)基底部(可能為Deiter細(xì)胞)、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、蝸神經(jīng)中心區(qū)域以及雪旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的交界區(qū)域都有DIAPH1的分布；推測(cè)上述突變可能影響肌動(dòng)蛋白和微管的重構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)耳細(xì)胞和巨核細(xì)胞中細(xì)胞骨架和剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，是耳聾伴隨巨核細(xì)胞血小板減少癥的機(jī)制之一，因此，建議將血常規(guī)檢查作為常染色體顯性遺傳性耳聾患者的的常規(guī)檢查項(xiàng)目，以幫助鎖定具有綜合征樣表型特征的DIAPH1基因突變。同樣的無(wú)義突變和類似綜合征樣表型也見(jiàn)于Ganaha等[34]的報(bào)道，該研究提出位于DAD結(jié)構(gòu)域的突變位點(diǎn)c.3637C>T(p.Arg1213Ter)是該基因的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)；不同的是該文中家系患者的血小板數(shù)量比Strilt等[31]的報(bào)道更少，且隨著年齡增長(zhǎng)而減少，因此推測(cè)血小板減少也是漸進(jìn)性的；文中指出MYH9相關(guān)性綜合征如：May-Hegglin anomaly(OMIM 155100)、Fechtner syndrome(OMIM 153640)、Epstain syndrome(OMIM 153650)、Sebastian syndrome(OMIM 606249)也表現(xiàn)為聽(tīng)力損失及MTP，因此，建議有DIAPH1-RD的患者需要同時(shí)檢測(cè)DIAPH1和MYH9基因。但常染色體顯性遺傳性耳聾伴血小板減少癥分子機(jī)制目前尚未明確。

另外，Ueyama等[35]使用不同的轉(zhuǎn)錄本isoform 2(NM_001079812.2)在2個(gè)日本家系中檢出DIAPH1基因c.3610C>T突變(p.Arg1204 Ter)，在蛋白質(zhì)水平突變同樣位于DAD結(jié)構(gòu)域，患者表現(xiàn)為兒童期發(fā)病，聽(tīng)力損傷為輕中度，以高頻為主，迅速發(fā)展為雙側(cè)全頻重度感音性聾；該研究利用DIA1(R1204 Ter)-TG mice(轉(zhuǎn)基因小鼠)構(gòu)建的動(dòng)物模型對(duì)該突變?cè)斐傻呐R床表型、耳蝸細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變做了較深入的研究，印證了該無(wú)義突變引起翻譯過(guò)程提前終止，DADbase RRKR(1204-1207)模體的缺失是該突變的作用機(jī)制；但該研究并沒(méi)有做血液學(xué)的相關(guān)檢測(cè)。

3.3常染色體隱性遺傳性小頭綜合征 除了常染色體顯性遺傳導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失伴或不伴血液學(xué)異常，曾有中東地區(qū)的學(xué)者[36, 37]報(bào)道過(guò)3個(gè)近親結(jié)婚的家庭成員出現(xiàn)DIAPH1純合突變相關(guān)的小頭綜合征，可出現(xiàn)小頭畸形、智力障礙、癲癇、身材矮小、皮質(zhì)盲、呼吸道疾病等綜合征樣表型，但患者及其雜合突變攜帶者的父母均未出現(xiàn)聽(tīng)力損失。突變?cè)斐闪薉IAPHI蛋白FH2、DAD等重要結(jié)構(gòu)域的缺失，DIAPH1的表達(dá)與紡錘體中心體有關(guān)，從而影響了神經(jīng)元細(xì)胞的有絲分裂和遷移，最終限制了大腦的發(fā)育[36]。Ercan-Sencicek等[36]專門(mén)研究了DIAPH1在內(nèi)耳和神經(jīng)系統(tǒng)的分布，發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)和聽(tīng)覺(jué)中樞、聽(tīng)神經(jīng)的髓鞘組成部分雪旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中存在大量的DIAPH1分布，推測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的缺陷可能是DIAPH1純合突變引起常染色體隱性遺傳性小頭綜合征的機(jī)制之一。至于DIAPH1純合突變的患者不出現(xiàn)聽(tīng)力損失而存在小頭綜合征的機(jī)制仍然有待研究(突變位點(diǎn)定位見(jiàn)圖1，臨床表現(xiàn)見(jiàn)表4)。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，DIAPH1基因突變可引起常染色體顯性遺傳的遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾伴或不伴血液學(xué)異常及常染色體隱性遺傳性小頭綜合征。作為DFNA1型耳聾的致病基因，以往認(rèn)為DIAPH1基因突變主要與低頻遺傳性耳聾相關(guān)，兒童期發(fā)病，30歲左右發(fā)展至重度到極重度全頻聽(tīng)力損失；近年來(lái)一些文獻(xiàn)報(bào)道該突變也可引起中高頻聽(tīng)力損失，體現(xiàn)了常染色體顯性遺傳性耳聾的表型多樣性。但多數(shù)文獻(xiàn)中家系患者例數(shù)較少，受環(huán)境等因素影響較大，無(wú)法確定聽(tīng)力損失特征的可靠性。既往報(bào)道伴血液學(xué)異常的DIAPH1相關(guān)性耳聾患者多數(shù)沒(méi)有出血等臨床癥狀，血小板數(shù)目及大小與DIAPH1基因突變是否有關(guān)尚需進(jìn)一步研究，且MYH9基因相關(guān)性綜合征型耳聾也可有類似的血液學(xué)異常，因此，檢測(cè)血液指標(biāo)對(duì)于DIAPH1相關(guān)性耳聾的診斷及治療尚沒(méi)有明確的臨床意義。

迄今為止已發(fā)現(xiàn)的該基因突變除了2種錯(cuò)義突變位于16號(hào)外顯子，其余突變均位于第27號(hào)外顯子，造成框移突變或無(wú)義突變，相應(yīng)突變導(dǎo)致DIAPH1蛋白自抑制相關(guān)的DAD結(jié)構(gòu)域(1 194～1 222)重要部分，如：DAD base RRKR motif (1 213～1 216)缺失或使剪切位點(diǎn)后移，造成翻譯提前終止和異常蛋白質(zhì)生成。特別是無(wú)義突變c.3637C>T(p.Arg1213Ter)在多個(gè)家系中被發(fā)現(xiàn)，可能是DFNA1型耳聾的熱點(diǎn)突變。根據(jù)ACMG指南，c.1589T>G(p.Ile530Ser)和c.2032 C>T(p.Pro678Ser)兩種錯(cuò)義突變的致病性尚需進(jìn)一步功能研究來(lái)明確。

近年來(lái)，遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、二代測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)的發(fā)展極大地推動(dòng)了遺傳性耳聾致病突變的發(fā)現(xiàn)和功能研究。目前只發(fā)現(xiàn)一個(gè)DIAPH1突變大家系的表型呈現(xiàn)為特征性的低頻聽(tīng)力損失，該基因與特征性表型的相關(guān)性尚待大家系的發(fā)現(xiàn)和深入的基因型-表型分析。該基因與血液學(xué)異常和小頭綜合征的關(guān)系仍缺乏深入的基礎(chǔ)研究。圍繞DIAPH1基因與相關(guān)突變的深入研究將幫助人類加深對(duì)遺傳性耳聾的認(rèn)識(shí)，有利于揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理、臨床表型、發(fā)展及預(yù)后，為遺傳性耳聾的臨床診斷，特別是低頻聽(tīng)力損失為主的常染色體顯性遺傳性耳聾的診斷提供參考，為遺傳咨詢工作和耳聾基因的診斷提供理論依據(jù)。