石曉兵，董 紅，卿勝奎，鄭新寶，羅永明，賈志虎，劉武軍*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011；3.加盛太平洋科技文化（北京）有限公司，北京 100000）

引 言

超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)可以快速提高優(yōu)良品種的繁殖效率[1]，影響超數(shù)排卵和胚胎移植的因素包括有牛品種、個(gè)體差異、激素、飼養(yǎng)水平和季節(jié)等[2]。 在實(shí)際生產(chǎn)中要獲得好的胚胎移植效果，必須提高良種母牛的超排采卵可用率和受體?？捎寐省?一般推薦使用成年牛進(jìn)行超數(shù)排卵效果穩(wěn)定，較少利用青年牛，但在生產(chǎn)中由于使用成年牛會(huì)耽誤正常繁殖配種時(shí)間，而選擇育成青年牛超數(shù)排卵，可以充分利用肉牛配種前的空閑兩個(gè)月時(shí)間，充分挖掘良種肉牛的資源優(yōu)勢(shì)，提高繁育效率[2]。

日本和牛是日本多年培育的一種新品種肉牛，適合亞洲飼養(yǎng)管理環(huán)境，肉多汁細(xì)嫩，風(fēng)味獨(dú)特，肉用價(jià)值高[3]，我國(guó)引入時(shí)間不長(zhǎng)，主要在東北、內(nèi)蒙、海南分布，純種數(shù)量較少，東北地區(qū)的飲食習(xí)慣燒烤喜歡用優(yōu)質(zhì)牛肉，和牛肉分割產(chǎn)品供不應(yīng)求，為了快速擴(kuò)大純種和牛種群數(shù)量，許多養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了和牛胚胎移植技術(shù)研究與推廣，筆者將近兩年和牛胚胎移植試驗(yàn)結(jié)果分析總結(jié)，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 供受體牛的選擇

供體牛為黑龍江省齊齊哈爾市畜牧園區(qū)11～13 月齡青年和牛27 頭， 備選受體牛群為當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)荷斯坦和延邊雜種后代母牛280 頭，年齡為2～4 歲，均健康無(wú)病，生殖系統(tǒng)繁育功能正常。 空胎、全舍飼、自由飲水，膘情適中；和牛凍精由黑龍江凍精中心提供。 受體牛發(fā)情后6～7 d 移植胚胎。

1.2 器械、藥品試劑

沖卵器械：采卵管、港芯、0.25 塑料細(xì)管、胚胎移植槍、移植外套購(gòu)自法國(guó)卡蘇公司，集卵皿由日本富士平公司生產(chǎn)，胚胎冷凍儀為澳大利亞CL5500。

促卵泡素（FSH）,400 mg/瓶，20 mL，加拿大生產(chǎn)；氯前列腺醇（PG），0.2 mg/支，寧波三生激素廠生產(chǎn)；CIDR 栓為新西蘭生產(chǎn)，沖卵液和胚胎冷凍液,均為美國(guó)ICP 公司生產(chǎn)，維生素AD 為北京立時(shí)達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，亞硒酸鈉維生素E 注射液為上海恒泰藥業(yè)公司生產(chǎn)。

1.3 供體超數(shù)排卵和受體同期發(fā)情方案

采用的陰道栓+促卵泡激素+前列腺素的超排方案[4]。一個(gè)超排過(guò)程17 d。為達(dá)到鮮胚移植目的，采取陰道栓同期發(fā)情程序與PG 法處理備選受體， 從而達(dá)到受體與供體同步發(fā)情的目的。 超排方案采用FSH 4 d遞減注射法處理，即供體母牛在埋栓后第9～12 d 開始超排，F(xiàn)SH 分4 d 減量注法注射，第3 d 早晚各注射PG 2 支，F(xiàn)SH（加拿大生產(chǎn)）400 mg 溶解為20 mL，超排注射總劑量分為10 mL（200 mg）、11 mL（220 mg）和12 mL(240 mg)、13 mL（260 mg）四組。 供體母牛在超排第5 d 早晨試情，當(dāng)天下午和次日早晨對(duì)發(fā)情供體各人工輸精一次，每次使用和牛細(xì)管凍精2 支。

1.4 胚胎采集和移植

在供體牛發(fā)情后7 d，用非手術(shù)方法進(jìn)行胚胎采集。采集前用手直腸檢查黃體數(shù)，預(yù)估胚胎數(shù)，按國(guó)家奶牛非手術(shù)采卵操作規(guī)程進(jìn)行采卵操作后，將回收液送回實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下檢出回收液中的胚胎，并按國(guó)際胚胎協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，鑒定胚胎發(fā)育及等級(jí)，將可用胚胎清洗后裝入0.25 塑料胚胎細(xì)管進(jìn)行鮮胚移植，剩余的A 級(jí)可用胚胎冷凍保存[5]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 制作數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPASS12.0 進(jìn)行分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2019 年7 月份， 在齊齊哈爾市畜牧園區(qū)牛場(chǎng)選擇27 頭和牛供體分五批進(jìn)行超數(shù)排卵胚胎生產(chǎn)，共獲得和牛胚胎274 枚，其中可用胚胎173 枚，平均可用胚每頭6.4 枚，胚胎可用率63.1%，共胚胎移植124 頭。

2.1 供體月齡對(duì)胚胎生產(chǎn)效率的影響

理論上應(yīng)選擇12 月齡以上的和牛作為胚胎生產(chǎn)供體，但因供體數(shù)量有限，本次被迫選用了部分12月齡以下接近12 月齡供體。從表1 可以看出，12 月齡以下平均胚胎數(shù)尚可，但標(biāo)準(zhǔn)差較大（7.18），說(shuō)明該月齡段個(gè)體之間超排效果差異大，同時(shí)人員沖胚操作相對(duì)困難。 在供體數(shù)充足情況下，仍建議選用12 月齡以上供體超排，13 月齡樣本數(shù)太少數(shù)據(jù)不具有代表性未做對(duì)比分析。

表1 不同月齡可用胚數(shù)比較

2.2 供體身高體重對(duì)胚胎生產(chǎn)效率的影響

通過(guò)對(duì)供體牛稱重資料，根據(jù)體重?cái)?shù)據(jù)分組，比較體重因素與出胚效果的相關(guān)性，從表2、表3 可以看出體重300 kg 以下或身高120 cm 的個(gè)體在特定的劑量下也可以達(dá)到較好的胚胎生產(chǎn)效果，與其他組差異顯著（P ＞0.05）。所以供體牛選擇并不是必須選擇體重或身高數(shù)值大的，小個(gè)子、體重輕點(diǎn)并不一定出胚效果差。

表2 不同體重可用胚數(shù)比較

表3 不同身高可用胚數(shù)比較

2.3 公牛精液對(duì)胚胎生產(chǎn)的影響

本次胚胎生產(chǎn)供體牛超排配種共使用4 頭和牛公牛細(xì)管凍精，為不同批次生產(chǎn)，各公牛系譜上標(biāo)注繁殖力不同，且凍精各批次生產(chǎn)時(shí)間條件不同，解凍后精液質(zhì)量存在一定差異，可能會(huì)對(duì)胚胎生產(chǎn)帶來(lái)影響，為此，將4 頭公牛所配種的供體母牛出胚數(shù)進(jìn)行了對(duì)比（見(jiàn)表4）。 種公牛的細(xì)管精液的品質(zhì)與生產(chǎn)胚胎的可用率呈正相關(guān)，活力好的精液配種后胚胎可用率較高，本批次試驗(yàn)顯示差異顯著（P ＞0.05）。

表4 不同公牛精液配種后生產(chǎn)可用胚數(shù)對(duì)比

2.4 埋栓時(shí)間對(duì)胚胎生產(chǎn)的影響

從胚胎采集結(jié)果表明，在選擇供體青年和牛母牛時(shí)應(yīng)選擇卵巢上黃體有活性，有正常發(fā)情周期的供體青年和牛母牛為佳[6，7]，見(jiàn)表5，數(shù)據(jù)表明，在發(fā)情后5～11 d 埋置CIDR 栓均可以取得較好的效果，12 d以后效果不佳，差異顯著（P ＞0.05），應(yīng)避免在發(fā)情周期后期（12 d 后）放植CIDR 栓開始超排程序。

表5 發(fā)情后不同天數(shù)埋栓生產(chǎn)可用胚數(shù)對(duì)比

2.5 FSH 超排劑量對(duì)胚胎生產(chǎn)的影響

對(duì)超排的供體青年和牛按劑量分為四組，比較可用胚數(shù)，見(jiàn)表6，試驗(yàn)結(jié)果表明，劑量10 mL、11 mL 這兩組均獲得了較好的可用胚數(shù)，與12 mL、13 mL 組差異顯著，考慮FSH 購(gòu)入成本，對(duì)青年和牛使用10 mL 加拿大FSH 超排劑量是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的。

表6 不同F(xiàn)SH 劑量超排生產(chǎn)可用胚胎數(shù)對(duì)比

2.6 埋栓與PG 處理受體同期效果對(duì)比

受體牛群共280 頭， 本次移植試驗(yàn)分別使用埋置進(jìn)口CIDR 栓法和PG 一次注射法進(jìn)行同期發(fā)情處理，觀察到受體牛發(fā)情后，記錄牛號(hào)，在第7 d 檢查黃體，凡是黃體直徑大于0.5 cm 的作為合格受體移植，最終完成移植124 頭，同期方法發(fā)情效果比較見(jiàn)表7、圖1，結(jié)果表明，埋栓法發(fā)情率、受體牛利用率高，但進(jìn)口CIDR 栓較貴，因此不考慮成本的情況下采用放CIDR 栓方法處理受體發(fā)情率、可用率高。

表7 PG 與埋栓同期處理受體效果對(duì)比

2.7 胚胎移植移植受孕效果對(duì)比

共移植124 頭受體，其中鮮胚移植受胎率為53%，凍胚移植受胎率為47%，不同操作人員移植受胎率差異很大，因樣本移植頭數(shù)差異過(guò)大，不做比較。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別對(duì)同期方法、胚胎級(jí)別、胚齡、單雙胚移植效果進(jìn)行了對(duì)比，見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4。

2.7.1 同期類別受孕率比較

自然發(fā)情的受體移植受胎率為36.30%，PG 同期處理的受體移植受胎率51.61%，CIDR 栓同期處理的受體移植受胎率率為53.19%，PG 組和CIDR 組差異不大，但以同期總受體牛數(shù)為基數(shù)對(duì)比，在齊齊哈爾市7 月份CIDR 的胚胎移植效率高于PG 處理組（見(jiàn)圖1）。

圖1 同期類別比較

2.7.2 胚胎級(jí)別受孕率比較

按國(guó)際通用胚胎鑒定標(biāo)準(zhǔn)，一級(jí)胚為胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，色調(diào)和透明度適中，沒(méi)有附著的游離細(xì)胞和液泡或很少，變性細(xì)胞比例少于10%，二級(jí)胚胎輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，可見(jiàn)一些附著的游離細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞約占10%～30%[2]。 試驗(yàn)結(jié)果表明，一級(jí)胚胎移植受胎率（56.10%）顯著高于二級(jí)胚胎（46.30）（見(jiàn)圖2）。

圖2 胚胎級(jí)別比較

2.7.3 不同胚齡受孕率比較

通常情況下，第7 d 采集胚胎，大部分的胚胎處于第4 發(fā)育期（致密桑葚胚）、第5 發(fā)育期（早期囊胚）、第6 發(fā)育期（囊胚階段），也有少數(shù)處于第3 發(fā)育期（桑葚胚）、第7 發(fā)育期（擴(kuò)張囊胚），本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：第5～7 期（即早期囊胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚）胚胎移植受孕率高，見(jiàn)圖3，這可能與胚胎細(xì)胞數(shù)多有關(guān)。

圖3 胚齡-受胎率比較

2.7.4 單胚、雙胚移植受孕率比較

在試驗(yàn)中，有部分3 級(jí)胚胎（胚胎形態(tài)完整，但輪廓不清晰，結(jié)構(gòu)松散，游離細(xì)胞及變性細(xì)胞比例超過(guò)30%，但仍有一團(tuán)內(nèi)細(xì)胞存活）。 冷凍沒(méi)意義，丟棄可惜，如果單獨(dú)進(jìn)行鮮胚移植，還可能有1%～5%的幾率懷孕，根據(jù)受體牛數(shù)量，我們把這樣的3 級(jí)胚胎和二級(jí)搭配一起移植，因?yàn)槭且浦菜a(chǎn)后代大部分僅作牛肉生產(chǎn)，不繼續(xù)繁殖，所以不考慮雙胎異性孿生不育問(wèn)題，獲得了一定的移植受胎率，經(jīng)比較，發(fā)現(xiàn)多胚移植受孕率為55.93%，單胚移植受孕率為50.00%，差異明顯（見(jiàn)圖4），試驗(yàn)證明，在鮮胚移植時(shí)，二級(jí)單胚附加一個(gè)差的三級(jí)胚胎，可以顯著提高移植受孕率十個(gè)百分點(diǎn)。 這與李延春主編的羊胚胎移植實(shí)用技術(shù)提到的肉羊胚胎雙胚移植結(jié)論一致[13]。

圖4 單頭移植胚胎數(shù)比較

3 討 論

3.1 夏季青年和牛供受體同期發(fā)情的方法

一般在繁殖季節(jié)進(jìn)行家畜胚胎移植效果好于非繁殖季節(jié)，對(duì)牛而言，因?yàn)槭侨臧l(fā)情大家畜，理論上全年都可進(jìn)行胚胎移植操作，但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于夏季炎熱熱應(yīng)激，往往同期發(fā)情，胚胎移植效率不佳[8，9]，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，7 月份自然發(fā)情率不高，使用PG 處理法效果也不理想，使用CIDR 埋置法人工控制發(fā)情周期效果較好，這與其他研究人員的結(jié)果一致[8]。

3.2 影響青年和牛采集胚胎效率的因素

雖然試驗(yàn)比較成功，各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明12 月齡青年和牛進(jìn)行超數(shù)排卵和胚胎移植獲得較好的效果，但是和牛是小型肉牛品種，部分青年和牛只因?yàn)樽訉m過(guò)細(xì)，肛門狹窄，直腸油脂過(guò)多，造成胚胎采集操作困難，甚至放棄采集胚胎[10]，因此需要在篩選供體牛直腸檢查時(shí)考慮淘汰子宮過(guò)細(xì)、肛門狹窄的供體母牛。 如果要成功完成青年牛胚胎移植工作，需要考慮以下因素[11,12]：

科學(xué)合理制定胚胎生產(chǎn)移植計(jì)劃，包括供受體牛選擇、FSH 劑量、超排程序、胚胎采集時(shí)間、器械采購(gòu)與消毒準(zhǔn)備等，保證穩(wěn)定的、足夠數(shù)量的、高質(zhì)量的供體受體來(lái)源，供受體有準(zhǔn)確的個(gè)體標(biāo)記系統(tǒng)；

養(yǎng)殖場(chǎng)具有健全的畜群健康計(jì)劃，包括檢疫，疫苗接種，寄生蟲治療等；在超數(shù)排卵胚胎移植程序進(jìn)行時(shí)，應(yīng)避開檢疫、接種疫苗、治療等操作，會(huì)影響胚胎采集及移植效率。養(yǎng)殖場(chǎng)能嚴(yán)格執(zhí)行供受體牛營(yíng)養(yǎng)方案，保證供受體不過(guò)肥或過(guò)瘦，營(yíng)養(yǎng)適度均衡。

技術(shù)人員認(rèn)真負(fù)責(zé)，技術(shù)熟練，助手能準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和記錄供受體牛的發(fā)情情況；

盡可能完善實(shí)驗(yàn)室必備設(shè)施，保證胚胎采集、操作、移植環(huán)境衛(wèi)生無(wú)菌，溫度變化不大。只有每個(gè)細(xì)節(jié)都嚴(yán)格把控，才能實(shí)現(xiàn)良好的青年和牛超數(shù)排卵和胚胎移植效果。

3.3 提高夏季和牛胚胎移植生產(chǎn)效率易忽略的因素

飼養(yǎng)與營(yíng)養(yǎng)：供體受體母牛需要按照供受體牛營(yíng)養(yǎng)方案確保能量、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)滿足身體生長(zhǎng)和繁殖機(jī)能發(fā)育，適度的粗蛋白水平，優(yōu)質(zhì)的青貯，適當(dāng)長(zhǎng)度的優(yōu)質(zhì)粗飼料TMR 將有助于提高母牛繁殖機(jī)能發(fā)育、增加胚胎生產(chǎn)移植的成功率和效率。 現(xiàn)有的供體青年和牛按照肉牛育肥前期營(yíng)養(yǎng)配方進(jìn)行飼喂，其飼喂目的和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)與繁殖母牛有很大差異，導(dǎo)致供體母牛繁殖機(jī)能發(fā)育遲緩，腸下脂肪積累過(guò)多，部分牛只因肛門緊無(wú)法操作從而無(wú)法使用，影響供體利用率和生產(chǎn)效果。

氣候環(huán)境影響： 夏季天氣炎熱多雨，應(yīng)特別注意和避免飼草料霉變，霉變飼草料、炎熱的夏季造成和牛一定的熱應(yīng)激，采食量下降，發(fā)情減少，發(fā)情癥狀不明顯等，對(duì)動(dòng)物繁殖機(jī)能和沖胚效果有影響。

4 結(jié) 論

在夏季進(jìn)行青年和牛進(jìn)行超數(shù)排卵和胚胎移植生產(chǎn)可以取得較好的效果；12 月齡的青年和牛進(jìn)行超數(shù)排卵可以獲得滿意的胚胎生產(chǎn)效果；體重300 kg 以下，身高120 cm 的個(gè)體在特定的劑量和供體選擇下也可以達(dá)到較好的胚胎生產(chǎn)效果；健康的公牛所產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)的精液是胚胎生產(chǎn)成功的重要因素；10 mL（200 mg）是青年和牛超排的適合劑量；在不考慮成本的條件下，埋置CIDR 栓同期發(fā)情效果好，鮮胚移植受胎率可以達(dá)到53%，凍胚移植受胎率達(dá)到47%。 成功完成青年和牛胚胎移植工作，需要考慮各方面因素，只有每個(gè)細(xì)節(jié)都嚴(yán)格把控，才能提高青年和牛超數(shù)排卵和胚胎移植效率。