楊小璇，吳畏

存在兩種或兩種以上不同核型細胞系的胚胎被稱為嵌合胚胎。根據(jù)其起源，嵌合體有由單個受精卵發(fā)育而來（mosaicism）與非單個受精卵發(fā)育而來（chimerism）之分。人類輔助生殖技術中，對于有必要行遺傳學診斷的患者，一般選擇胞漿內單精子注射（ICSI）的體外受精方式，以最大限度減少母源顆粒細胞和父源精子對下游遺傳學檢測準確性的干擾。因此，這里只討論由單個受精卵發(fā)育而來的嵌合胚胎。非整倍體胚胎的形成，是由于減數(shù)分裂形成配子的過程發(fā)生錯誤；嵌合是有絲分裂過程中，部分細胞染色體分離異常，導致染色體增加或丟失，成為非二倍體細胞，其發(fā)生機制本質上都是有絲分裂錯誤的發(fā)生機制，并非嵌合型所獨有。這些有絲分裂錯誤發(fā)生的原因尚不清楚。隨著新的遺傳技術平臺的發(fā)展，對移植前胚胎倍性狀態(tài)的診斷不再局限于整倍體或非整倍體，而是通過量化異常細胞比例進行分類[1]。國際植入前遺傳學診斷協(xié)會（the Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS）將嵌合比例＜20%的胚胎視為整倍體，＞80%視為非整倍體，20%～80%視為嵌合體，以此指導胚胎檢測結果的判定。

1 嵌合胚胎的分類

按嵌合的分布，嵌合胚胎可分為兩種：第一種為廣泛嵌合，指胚胎的胎盤和胎體均出現(xiàn)嵌合，分裂錯誤發(fā)生較早，導致嵌合細胞系存在于整個胚胎；第二種為局限性嵌合，指染色體嵌合局限在內細胞團的部分或全部細胞，或者滋養(yǎng)外胚層的部分或全部細胞[2]。此種類型發(fā)生率更高，有出現(xiàn)在腦部、性腺、胎盤等部位的報道[3]。當有絲分裂錯誤發(fā)生在胚胎細胞已分化的階段，如出現(xiàn)在滋養(yǎng)層，分化后就只有胎盤嵌合，胎兒可為整倍體，從而形成局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）。CPM與胎兒生長受限、自發(fā)性流產、死胎及胎盤功能異常等有關。

按染色體組成，嵌合胚胎可分成3種：第1種為非整倍體嵌合，是不同非整倍體細胞的混合（即胚胎中沒有二倍體細胞），在卵裂期胚中約占15%[4]。有絲分裂錯誤發(fā)生在已經出現(xiàn)減數(shù)分裂錯誤的胚胎，或有絲分裂錯誤發(fā)生在第一次卵裂，從而產生了兩種不同類型的非整倍體子細胞而形成。第2種為二倍體-非整倍體嵌合，指胚胎中既有非整倍體細胞，又有二倍體細胞，在卵裂期胚胎中約占50%[4]。通常由于二倍體受精卵的子代細胞發(fā)生有絲分裂錯誤而產生。罕見情況中，非整倍體細胞自我補救產生的二倍體子代也可導致該種嵌合類型[5]。倍性嵌合也稱為混倍體胚胎，是不同倍數(shù)細胞的混合。早期植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS）研究使用熒光原位雜交（FISH）技術發(fā)現(xiàn)了卵裂期二倍體-四倍體嵌合的高發(fā)生率（15%）[6]。第3種為雜亂嵌合，表現(xiàn)為多條染色體異常的無規(guī)律形式，每個細胞具有看似隨機的染色體數(shù)目。不同研究的標準和估計不同，其發(fā)生率約為25%[6]。

2 嵌合胚胎的發(fā)生機制

2.1 分裂后期延遲 即細胞分裂發(fā)生在染色體正確排列并附著于有絲分裂紡錘體之前，使某一條染色單體未能進入子代細胞核[3]，形成一個單體和一個二倍體細胞。在移植前胚胎中，染色體丟失導致的有絲分裂錯誤比染色體增加更常見，出現(xiàn)在超過50%的病例中[7]。Ioannou等[8]在對丟棄的第5天胚胎的研究中，證明單體嵌合比三體發(fā)生率高7倍，提示細胞分裂后期延遲可能是嵌合的主要原因。

胚胎基因組在四至八個細胞階段前基本處于非激活狀態(tài)，來自母親的蛋白質和mRNA儲備調控前幾次有絲分裂[9]。最近有研究使用單細胞表達譜來鑒定非整倍體/整倍體和發(fā)育阻滯/正常的胚胎中差異表達的母體效應基因，發(fā)現(xiàn)發(fā)育阻滯的受精卵中，有絲分裂檢查調控位點的相關基因下調，包括CDK1、CDK2、CHEK2、BUB1、BUB3、乳腺癌易感基因1（BRCA1）和ATR[10]。隨著母親年齡增加，輻射、毒性物質、氧自由基累積，卵子質量下降，線粒體受損或端粒縮短都可致有絲分裂錯誤。高齡導致非整倍體發(fā)生率升高，但目前的數(shù)據(jù)和觀念認為嵌合發(fā)生率與年齡無關。

卵裂期的胚胎有絲分裂檢查位點的作用薄弱，可能導致細胞周期在染色體完全復制并正確排列于有絲分裂紡錘體之前或清除損傷DNA之前就進入M期[11]。延時成像研究表明，在沒有嚴格檢查調控的細胞周期中，有絲分裂保真度由于關鍵細胞周期節(jié)點的輕微偏差而下降，出現(xiàn)頻繁的后期延遲[12]。監(jiān)控M期染色體的分離依靠紡錘體裝配檢查位點（spindle assembly checkpoint，SAC），SAC降調可導致一條姐妹染色單體與紡錘體連接失敗，或者兩條姐妹染色單體連接到同極紡錘體上，以及一個著絲粒與兩極紡錘體同時連接。錯誤的連接使染色體向兩極的移動延遲，增加后期延遲的發(fā)生率[13]。寬松的細胞周期檢查位點也可導致細胞分裂跳過M期，DNA復制而細胞不分裂，形成四倍體嵌合。

2.2 有絲分裂不分離 即姐妹染色單體在有絲分裂過程中未分離，使兩條染色單體進入同一個子代，形成一個三體和一個單體細胞的相互獲得/丟失的模式。其發(fā)生率與胚胎發(fā)育階段和所涉及的染色體有關，是卵裂期性染色體不分離的主要機制，而與減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期常染色體非整倍體的形成關系甚微[3]。姐妹染色單體不分離或過早分離都與聚合蛋白的功能障礙有關。在小鼠模型中，敲除聚合蛋白基因會導致早期胚胎發(fā)育阻滯[14]。而預期會出現(xiàn)發(fā)育阻滯的受精卵表現(xiàn)出一些聚合蛋白基因包括SMC3和分離酶抑制蛋白的表達差異[10]，因此聚合蛋白對有絲分裂保真度的重要性值得進一步研究。

2.3 內復制 是指染色體復制而沒有隨后的胞質分裂，或者有絲分裂開始不久后隨即關閉，形成一個三體和一個二倍體細胞[3]。

2.4 染色體丟失 在細胞周期的任何時期發(fā)生的染色體丟失都可導致嵌合。

2.5 提前分離 指細胞間期DNA復制完成前即啟動細胞分裂過程。

2.6 斷裂-融合-橋循環(huán) 即染色體片段融合形成雙著絲粒染色體。細胞分裂時，每個著絲粒被拉向相反方向，染色體在新的位置斷裂，斷裂染色體片段復制后再融合，開始新的循環(huán)。這種錯誤會導致復雜的染色體重排而出現(xiàn)嵌合[15]。其發(fā)生是由于后期延遲的染色體并不直接退化，而是從主細胞核中分離出來，被包裹進類似細胞核的微核中，易發(fā)生嚴重的DNA損傷[16]，形成雙著絲粒染色體，也易發(fā)生染色體碎裂，以隨機順序和方向重新組合，導致大量的染色體片段缺失和重排。當多個染色體被分割進入一個微核時，還可能導致易位[17]。微核可在隨后的有絲分裂中被重新吸收入細胞主核或與鄰近卵裂球融合，導致復雜的嵌合模式[12]。

另外，來自精子的中心體若出現(xiàn)異常會導致卵裂期胚胎的有絲分裂錯誤，產生嚴重的雜亂嵌合。調控中心體復制的有絲分裂激酶Polo-蛋白激酶4（Polo-like kinase4，PLK4）即使是輕微的過表達，也會導致中心粒過多，形成多余的中心體[18]，使細胞出現(xiàn)多極，產生多個子細胞，染色體隨機分配到子細胞中，導致雜亂嵌合。雙精受精也是造成中心體過多的一個路徑[19]。也有正常二倍體卵裂球出現(xiàn)多極有絲分裂的報道[20]。在受精過程中，精子的中心粒促使微管聚合形成精子星狀體，其引導精卵原核相融，并從卵子提供的細胞質中募集中心體的成分。不育男性星狀體的形成比正常男性延遲。

3 嵌合胚胎的檢出率及影響因素

胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic test，PGT）是對有遺傳缺陷高風險的夫婦，通過體外受精，應用分子、細胞遺傳學技術，在體外選擇正常胚胎植入，亦稱孕前診斷。最初的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術能檢測的染色體數(shù)目有限。近年來發(fā)展迅速的全染色體篩查技術（comprehensive chromosome screening，CCS），包括定量聚合酶鏈反應（qPCR）、單核苷酸多態(tài)性分析微陣列（single nucleotide polymorphismarray，SNP arrays）、微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCHG）及最新的新型高通量測序技術（next generation sequencing，NGS），已經可以準確檢測23對染色體的拷貝數(shù)。

各種檢測方法估計卵裂期胚胎的嵌合率在15%～75%[21]。第5天/第6天囊胚期的滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）活檢可以獲得更多細胞，檢測結果更加穩(wěn)定可信。囊胚嵌合率在3%～24%[22]，但是嵌合的類型、程度，活檢的位置、細胞數(shù)目都應當納入對TE活檢準確性的評估中。全基因組檢測技術不能發(fā)現(xiàn)互補的染色體異常；不同的嵌合形式使單次TE活檢在理論上很容易出現(xiàn)誤診[2]，其能否代表整個胚胎的倍性狀態(tài)，仍存在爭議。Johnson等[23]和Capalbo等[24]的研究提示TE和ICM的一致性高達95%～100%。Maxwell等[25]對TE+NGS檢測為嵌合體的胚胎進行2～5次重復的TE檢測，再次TE檢測認為48.2%仍為嵌合體，51.7%為整倍體。可見TE活檢對ICM的代表性存在一定的誤差。PGDIS推薦活檢5個細胞。Gleicher等[26]經過數(shù)學模型計算，認為每次活檢至少27個細胞，才能代表約含300個細胞的TE。

在嵌合胚胎的檢測中，除了生物學因素導致的困難，還有檢測方法數(shù)據(jù)分析帶來的挑戰(zhàn)[27]。不同的全基因組擴增和檢測平臺、分析軟件及設置、嵌合評估原則和標準都會影響檢測結果[21]。所使用的PGT嵌合檢測敏感度（即整倍體和非整倍體細胞混合物中可檢出嵌合的最小非整倍體細胞比例）也會影響嵌合檢出率。2016年PGDIS指南提出，有效的NGS平臺現(xiàn)需要能夠發(fā)現(xiàn)嵌合率為20%左右的胚胎。

此外，一項大樣本的回顧性隊列研究表明，PGT平均整倍體率約39.5%～82.5%，平均68.4%，各個生殖中心間有差異。不同中心的不同卵巢刺激方案、激素水平及實驗室因素是否影響嵌合率，不同的研究結果相反，有待進一步研究。Munne等[28]認為，胚胎培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液可導致嵌合現(xiàn)象的差異。與大氣氧含量相比，5%的氧氣培養(yǎng)環(huán)境可以提高胚胎質量，降低性染色體嵌合。

4 臨床結局

嵌合胚胎的發(fā)育潛力、種植率下降，遺傳疾病、不良妊娠結局的風險增加。有嚴重精神障礙和自身免疫性疾病的個體染色體嵌合發(fā)生率較高的報道[2]。在最初胚胎檢測結果定性為整倍體和非整倍體時，認為只有整倍體胚胎可以孕育健康后代，但Greco等[29]2015年的研究表明一部分嵌合體胚胎可以發(fā)育為健康活產兒，Munné等[30]2017年的研究表明，41%嵌合胚胎移植后可以獲得繼續(xù)妊娠。因此嵌合體胚胎很可能有自我糾錯的潛能，應重新考慮嵌合胚胎的選擇性移植。正常4～8細胞階段由于逐漸下降的核質比而觸發(fā)胚胎基因組激活（embryonic genome activation，EGA），細胞分裂保真度增加。染色體不分離的發(fā)生率從第一次有絲分裂時的＞25%降至8細胞階段后的＜5%。與卵裂期相比，囊胚的嵌合比例下降，染色體異常所致的嚴重程度下降。有3種假說解釋這種現(xiàn)象：第1種，嵌合胚胎在形成囊胚前已凋亡。第2種，非整倍體細胞主動清除，或較整倍體細胞增殖速度更慢。最近一項使用小鼠模型的研究支持這一假說，證明當二倍體細胞的比例足夠大（≥50%）時，嵌合胚胎可以完成自我糾正[31]。特定細胞系的克隆消耗可以解釋CPM的發(fā)生。第3種，單/三倍體補救，即非整倍體細胞再次有絲分裂錯誤而成為二倍體，這種補救機制相對少見，且可導致與廣泛臨床疾病相關的UPD，其發(fā)生率有待研究。

目前還不能明確胚胎嵌合比例對發(fā)育潛力的影響，但是比例較低的胚胎著床機會大。非整倍體細胞占40%～80%的嵌合胚胎，持續(xù)妊娠率（ongoing implantation rate，OIR）約為22%，＜40%的嵌合胚胎OIR則高達56%，復雜嵌合類型胚胎的OIR（10%）明顯較低，單倍體、三倍體及節(jié)段性嵌合體OIR的差別沒有統(tǒng)計學意義[30]。采用分級系統(tǒng)預測嵌合胚胎插入類型，可能改善PGS后IVF結局[21]。

任何情況下都優(yōu)先移植整倍體胚胎，對于IVF的患者尤其是高齡婦女，若所獲胚胎只有嵌合體，且患者不能或不愿經歷再次取卵，可根據(jù)胚胎嵌合程度、染色體異常類型，結合患者的既往史和自我期望，選擇移植遺傳風險較低的胚胎。由于常染色體單體通常不能存活，而特定的三體可致活產兒身體或認知缺陷[32]，PGDIS2016年指南建議優(yōu)先移植單體嵌合而非三體嵌合，若移植三體嵌合，1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、17、19、20、22 、X和Y染色體三體嵌合胚胎優(yōu)先移植，2、7、13、14、15、16、18和21染色體三體嵌合胚胎不優(yōu)先移植。希望所選擇的胚胎有“全或無”效應，即胚胎種植、妊娠后可以活產完全健康的孩子，或種植失敗、早期流產，從而避免不良妊娠結局。然而PGDIS指南也指出，由于缺乏足夠的臨床證據(jù)，嵌合胚胎仍有待各方面的進一步研究。但目前對于移植前與患者充分的遺傳咨詢已達成共識，需告知嵌合胚胎結局的不確定性和流產、胎兒異常、妊娠終止等各種可能的風險，并建議其進行早期的產前篩查和后期的羊水穿刺檢查。

5 結語

由于嵌合胚胎形成機制的復雜性及發(fā)育過程的未知性，目前還不能建立基因型和表型的聯(lián)系，在胚胎發(fā)育過程中，為何部分細胞發(fā)生有絲分裂錯誤，尚不清楚。每個嵌合個體的異常細胞比例、染色體異常的類型和組織部位均不同，個體差異大，因此發(fā)育結局極不確定[33]。目前關于移植嵌合胚胎后臨床結局的數(shù)據(jù)還非常缺乏。NGS應用的增加、數(shù)據(jù)的搜集及妊娠隨訪有望提供關于嵌合胚胎發(fā)育結局更為詳細的觀點。