戊糖片球菌P36胞外多糖體外抗氧化能力的研究*

，，，

(1.陜西廣播電視大學(xué) 旅游與酒店管理學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西廣播電視大學(xué) 會計學(xué)院，陜西 西安 710119； 3.陜西廣播電視大學(xué) 圖書館，陜西 西安 710119；4.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

正常狀態(tài)下，人體中自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但由于種種原因?qū)е聶C體自由基產(chǎn)量升高或者機體清除自由基的能力下降時，機體就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激，這種狀態(tài)會使機體受到一定的損傷，引發(fā)機體功能障礙[1-3]。機體抗氧化和抗衰老等能力的強弱主要取決于清除自由基的能力，所以人們對于抗氧化劑的需求非常迫切。但是人工合成的抗氧化劑因為其成本較高，且伴隨有較多的副作用，因此尋求無毒副作用的天然抗氧化劑成為當(dāng)務(wù)之急。

有研究表明，乳酸菌胞外多糖具有良好的益生活性[4]。本研究所用的戊糖片球菌P36是項目團隊從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌株，因有研究表明乳酸菌胞外多糖在體內(nèi)外都具有一定的抗氧化活性[5-6]，故本研究評價了戊糖片球菌P36胞外多糖體外抗氧化的能力。

一、材料與方法

(一)材料與儀器

二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)、ABTS 美國sigma公司；鄰苯三酚、30%的過氧化氫、硫酸亞鐵、1,10-鄰菲羅啉、氯化鐵 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。

恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司； SW-CJ-1CV超凈臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5415R 冷凍離心機 德國Eppendorf； UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津。

(二)實驗方法

1.乳酸菌菌種。試驗用戊糖片球菌P36分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品。將凍存于-80℃的乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化三代后用于后續(xù)試驗。

2. 戊糖片球菌P36胞外多糖制備。菌株P(guān)36接種于100 ml 培養(yǎng)基中，42℃下培養(yǎng)24 h，用超高速低溫冷凍離心機將發(fā)酵液于4℃，12000 r/min冷凍離心15 min，棄沉淀，重復(fù)離心兩次。發(fā)酵濾液加入75%乙醇在4℃下沉淀24 h，再次冷凍離心，重復(fù)離心兩次，取沉淀以蒸餾水復(fù)溶，透析過夜，定容，即得粗多糖溶液。粗多糖經(jīng)DEAE-Cellulose-52柱純化后得純多糖，以純多糖配制1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL不同濃度的多糖溶液。

3.戊糖片球菌P36胞外多糖對DPPH自由基的清除作用。依據(jù)Zhang等[7]的方法，反應(yīng)體系中加入1 mL不同濃度的多糖溶液，再加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH的無水乙醇，震蕩充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，再于6000 rpm離心10 min，取其上清，517 nm波長處測定樣品吸光度(OD值)。用等體積的生理鹽水代替樣品溶液作為對照組，并以等體積的生理鹽水和無水乙醇的混合液作為空白調(diào)零。按照以下公式計算DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率(%)=[1-A樣品/A空白]×100

4. 戊糖片球菌P36胞外多糖對超氧陰離子的清除作用。參照文獻[5]的方法，取50 mmol/L pH 8.2的緩沖液3 mL，加入25 mmol/L 鄰苯三酚10μL，迅速混勻，置于石英比色杯中，在325 nm處每隔30 s測定一次吸光值，反應(yīng)4.5 min結(jié)束，以吸光值對時間作圖，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率A0。在3 mL 緩沖液中加入不同濃度的胞外多糖，同法測定樣品的自氧化速率As，按照以下公式計算超氧陰離子自由基清除率：

超氧陰離子自由基清除率(%)=(A0-As)/ A0×100

5. 戊糖片球菌P36胞外多糖對羥自由基的清除作用。參照文獻[7]的方法，1 mL 2.5 mmol/L的1,10-鄰菲羅啉，1 mL pH 7.4的 PBS和1 mL蒸餾水充分混勻后，再加入1 mL 2.5 mmol/L的FeSO4，充分混勻后，加入1 mL 20 mmol/L的H2O2，37℃中水浴1.5 h，在536 nm處測定其OD值為A空白。把1mL水替換為1 mL 不同濃度的胞外多糖記為A樣品，將1 mL的H2O2替換為1 mL的水記為A對照。按照如下公式計算乳酸菌清除羥自由基的能力：

清除羥自由基能力(%)= [A樣品-A空白)]/[ A對照-A空白] ×100

6. 戊糖片球菌P36胞外多糖對ABTS+的清除作用。參照文獻[8]的方法。將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀(終濃度)混合，在室溫避光條件下靜置過夜，將生成的ABTS+溶液用水稀釋，使其在30℃，734 nm 波長下的吸光度為0.6至0.8之間，即得到ABTS+工作液。取不同濃度胞外多糖溶液1 mL，加入試管中，再分別加入1.5 mL的ABTS+溶液，空白管用蒸餾水代替樣品溶液，對照管用蒸餾水代替ABTS+工作液，室溫避光放置 6 min，于波長734 nm下測定其吸光度。計算公式為：

ABTS+的清除率(%)=[ A空白-(A樣品-A對照)]/A空白×100

(三)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0進行one-way ANOVA, Tukey’s多重檢驗(P < 0.05),數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

二、結(jié)果與討論

(一)戊糖片球菌P36胞外多糖對DPPH自由基的清除率

圖1 胞外多糖對DPPH自由基清除率 注：不同字母代表差異顯著, P<0.05.

本研究對戊糖片球菌P36不同濃度的胞外多糖清除DPPH的能力進行測定，由圖1可知，戊糖片球菌P36胞外多糖具有一定的抗氧化性，其對DPPH自由基清除能力均高于10%，并且隨多糖濃度的升高而增加。多糖濃度為5 mg/mL對DPPH自由的清除率顯著高于濃度為3 mg/mL時的清除率(P<0.05)。

(二)戊糖片球菌P36胞外多糖對超氧陰離子的清除率

圖2 菌株P(guān)36胞外多糖對超氧陰離子清除率 注：不同字母代表差異顯著, P<0.05.

目前，國內(nèi)主要通過鄰苯三酚自氧化法來測定抗氧化物對超氧陰離子的清除率。本研究測定了戊糖片球菌P36胞外多糖對超氧陰離子的清除率。如圖2所示，戊糖片球菌P36胞外多糖對超氧陰離子的清除能力隨胞外多糖濃度的升高而增加。當(dāng)胞外多糖濃度為5 mg/mL時，其清除率可達到13.04%。

(三)多糖對羥自由基的清除作用研究

圖3 菌株P(guān)36胞外多糖對羥自由基的清除率 注：不同字母代表差異顯著, P<0.05.

鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，F(xiàn)e2+與H2O2反應(yīng)后產(chǎn)生羥自由基，其具有很強的氧化能力。鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化后生成鄰二氮菲-Fe3+，導(dǎo)致其在536 nm波長處的最大吸收值減少。加入抗氧化劑之后，羥自由基的濃度減少，所以體系中的吸光值隨之升高。因此羥自由基的變化量可以根據(jù)加入樣品前后吸光值的大小變化來評價，以此來判定胞外多糖清除羥自由基的能力。本文研究表明，戊糖片球菌P36胞外多糖對羥基自由基的清除能力隨多糖濃度的升高而增加，多糖濃度為5 mg/mL對DPPH自由的清除率顯著高于濃度為4 mg/mL時的清除率(P<0.05)。

(四)多糖對ABTS+的清除作用研究

圖4 菌株P(guān)36胞外多糖對ABTS+自由基的清除率 注：不同字母代表差異顯著, P<0.05.

ABTS+清除實驗是測定化合物抗氧化能力的重要方法[9]。ABTS+自由基的產(chǎn)生是通過 ABTS原液與過硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12-16 h 完成，在供氫抗氧化劑存在的情況下，ABTS+自由基將會減少。如圖4所示，戊糖片球菌P36胞外多糖對ABTS+自由基的清除能力隨多糖濃度的升高而顯著增加。多糖濃度為5 mg/mL時對ABTS+自由基的清除率比濃度為4 mg/mL時顯著提高了11%(P<0.05)。

三、結(jié)論

本研究對戊糖片球菌P36的胞外多糖進行了體外抗氧化能力的測定。隨著胞外多糖濃度的升高，其體外抗氧化的能力隨之升高，當(dāng)胞外多糖濃度為5 mg/mL時，其對DPPH的清除率達到了30%以上。結(jié)果表明，戊糖片球菌P36的胞外多糖在體外具有一定的抗氧化作用。因此，可進一步在動物體內(nèi)評價戊糖片球菌P36胞外多糖的抗氧化能力，為以后的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。