張昊悅 王業(yè)皇 吳燕蘭

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院南京中醫(yī)院肛腸中心，江蘇省南京市 210000，電子郵箱：570724720@qq.com)

【提要】 克羅恩肛瘺發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一定論，已知的發(fā)病機制主要與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)重塑酶、炎癥因子、微生物群、遺傳易感性等相關(guān)。本文就克羅恩肛瘺的發(fā)病機制進行綜述。

2016年更新的《肛周膿腫、肛瘺和直腸陰道瘺治療指南》[1]指出，克羅恩肛瘺的診斷治療具有特殊性，其炎癥難以控制，肛門括約肌功能難以保留。約70%的克羅恩病患者伴有瘺管或狹窄相關(guān)的腸梗阻，且至少60%的克羅恩病患者在診斷后的20年內(nèi)需要進行一次手術(shù)治療[2]?？肆_恩病引起的瘺管主要是肛周瘺管[3]?？肆_恩病相關(guān)瘺管的發(fā)生可能與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)現(xiàn)象有關(guān)[4]。EMT的特征表現(xiàn)為特異性蛋白質(zhì)如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)上調(diào)、緊密連接蛋白4(Claudin-4)下調(diào)以及間充質(zhì)蛋白如波形蛋白上調(diào)[5]。本文就克羅恩肛瘺的發(fā)病機制進行綜述。

1 克羅恩肛瘺的組織學(xué)特征

克羅恩肛瘺瘺管的組織學(xué)特征通常呈非特異性表現(xiàn)，在顯微鏡下可見肉芽組織、鱗狀上皮排列，并且伴有細胞碎片、紅細胞及急性炎癥細胞。Bataille等[5]比較了普通肛瘺與克羅恩肛瘺在電鏡下的區(qū)別，結(jié)果顯示克羅恩肛瘺主要表現(xiàn)為CD45R0+T細胞的集中浸潤，并伴有一小部分CD68+巨噬細胞和密集的CD20+B細胞，而在普通肛瘺中可見CD68+巨噬細胞密集浸潤，只伴有少量的CD20+B細胞和CD45R0+T淋巴細胞。Maggi等[6]研究發(fā)現(xiàn)具有Th17、Th17/Th1和Th1表型的CD4+CD161+T細胞在克羅恩病肛周瘺管中累積。然而，多核異型巨細胞反應(yīng)可以在任何類型的瘺管中發(fā)生。此外，肉芽腫也可以反映其他病因，如分枝桿菌感染、真菌感染、肉瘤、附近組織瘤變等[7]。克羅恩病的肉芽腫通常具有相對較少的巨細胞，并且沒有壞死，但不能與非克羅恩病肉芽腫區(qū)分。大多數(shù)克羅恩病患者確診時，肛周樣本也不具有肉芽腫組織[8]。因此，克羅恩肛瘺瘺管的組織學(xué)特征通常呈非特異性表現(xiàn)。

2 EMT

EMT是分化的上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，是克羅恩肛瘺發(fā)生的特征之一[9]。EMT可使癌細胞具有侵襲性、轉(zhuǎn)移性、干細胞表型，還可能協(xié)助癌細胞逃避免疫監(jiān)視[10]，因此，EMT可能參與克羅恩肛瘺的發(fā)病，并導(dǎo)致腸炎相關(guān)性腸癌的發(fā)生。在EMT中，細胞可以表達上皮標志物(如細胞角蛋白8和細胞角蛋白20)，也可以表達間質(zhì)標志物(如波形蛋白和平滑肌肌動蛋白)[11-12]。EMT降低了粘附分子(如E-cadherin)的表達并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，包括鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子1和鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子2。已知的EMT誘導(dǎo)劑包括轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α。

大約2/3的克羅肛瘺瘺管是非上皮化的瘺管，并被成纖維細胞樣的過渡細胞所覆蓋，在瘺管或周圍組織中可以檢測到SNAIL1和SLUG的核定位，以及TGF-β和TNF，但E-cadherin水平降低[13]。TGF-β是EMT的關(guān)鍵介質(zhì)[6]，并且可以離體誘導(dǎo)EMT[14-18]。β6-整合素和SLUG對腫瘤細胞侵襲能力的影響和EMT的程度呈正相關(guān)[19-21]。

克羅恩肛瘺的瘺管中完全或者部分由肌成纖維細胞樣細胞/過度細胞排列，這些細胞可表達細胞角蛋白8和細胞角蛋白20，可能提示腸上皮細胞發(fā)生了EMT改變[13]。克羅恩肛瘺的下列特征可反映EMT的發(fā)生[9，13，22]：(1)過渡細胞中E-cadherin水平低于相鄰上皮細胞；(2)SLUG在過度細胞和下層間充質(zhì)細胞中表達；(3)SNAIL1在過渡細胞中過表達與核定位；(4)在過渡細胞與腸上皮細胞之間的區(qū)域中存在高水平的TGF-β和β6-整合素；(5)TNF-α及其受體在過渡細胞中呈高表達。此外，白細胞介素(interleukin，IL)-13，IL-13受體α，E26轉(zhuǎn)錄因子1和血清分泌型蛋白Dickkopf-1在克羅恩肛瘺瘺管的過渡細胞中高度表達，有利于EMT發(fā)生并且可能在肛瘺發(fā)病中起作用[9，23-24]。

3 基質(zhì)重塑酶

在人體活性組織中，細胞間基質(zhì)會不斷被多種酶重塑，這些酶可降解細胞外基質(zhì)的組分，其中最重要的酶為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)。MMP活性的增加可導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的組織損傷，并且與許多病理改變相關(guān)[25-27]。MMP對于克羅恩病的進展具有重要意義，在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，MMP-9的靶向缺失具有保護作用[28-29]，而在腸上皮細胞MMP-9過表達的小鼠中，腸炎更嚴重[30]。另外，在腸道炎癥的體外胚胎干細胞模型中添加MMP-3可引起廣泛地組織損傷，而抑制MMP-3活性可以有效阻斷組織損傷[31]。

研究顯示，在克羅恩肛瘺瘺管中MMP-3呈高表達，在單核細胞和成纖維細胞中均可以檢測到MMP-3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達[32]。此外，無活性和有活性的MMP-9均會在瘺管周圍表達，其mRNA和蛋白水平在粒細胞和成纖維細胞中表達升高[32-33]。在克羅恩肛瘺瘺管結(jié)腸固有層成纖維細胞中可以檢測到MMP-13活化的異構(gòu)體，但其在不具有肛瘺表型的成纖維細胞中幾乎不存在，且在克羅恩肛瘺周圍的單核細胞中可檢測到MMP-13蛋白的表達[9，33]。然而，MMP-1和MMP-7僅在克羅恩肛瘺周圍呈弱表達，MMP-2蛋白在瘺管和正常腸黏膜組織中呈同等表達[33]，但活化的MMP-2只存在于克羅恩肛瘺管中。克羅恩肛瘺周圍金屬蛋白酶組織抑制劑1、2、3的蛋白質(zhì)表達水平低[32]，MMP活性增強和蛋白質(zhì)表達上調(diào)有利于腸上皮細胞向侵入性肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致瘺管形成[34]。因此，基質(zhì)重塑酶在克羅恩肛瘺發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用。

4 腸道微生物群

腸道菌群也與克羅恩肛瘺的發(fā)生相關(guān)。核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)-2是胞壁酰二肽的受體，NOD-2突變與克羅恩瘺管的發(fā)生相關(guān)。此外，胞壁酰二肽可刺激腸上皮細胞和瘺管固有層成纖維細胞中的TNF-α、TGF-β、SNAIL1、IL-13和Ets1的表達[23]。

研究顯示，克羅恩肛瘺中僅能找到小部分的細菌，其致病菌尚不能被確定，因此認為持續(xù)的感染并不是克羅恩肛瘺進展的主要原因[36]。早期研究發(fā)現(xiàn)[37]，克羅恩肛瘺患者膿液中的菌群主要是革蘭氏陽性菌(葡萄球菌和鏈球菌)，而腺源性肛瘺的菌群則主要來自于胃腸道起源的細菌。van Onkelen等[35]使用16S rRNA測序檢測克羅恩肛瘺瘺管的菌群，未檢測到細菌，但檢測到90%的標本含有肽聚糖。另外，Norman等[36]研究表明，克羅恩病中噬菌體的特異性擴增與細菌多樣性降低有關(guān)，認為腸道病毒的變化可能導(dǎo)致腸道炎癥和細菌生態(tài)失調(diào)。因此，病毒與細菌的相關(guān)性或可成為炎癥性腸病研究的新方向。

5 炎癥因子

5.1 IL-6 IL-6是一種可以刺激肝細胞產(chǎn)生C反應(yīng)蛋白的細胞因子。Ruffolo等[37]研究發(fā)現(xiàn)，克羅恩肛瘺患者血清IL-6水平升高，而肛門狹窄型患者血清中IL-6水平降低，血清IL-6水平與血沉、C反應(yīng)蛋白水平、白蛋白血癥、活動性瘺管相關(guān)。

5.2 IL-10 IL-10可以限制過度的免疫反應(yīng)[38]，可以抑制輔助性T細胞1釋放細胞因子[39]，還可以抑制促炎細胞因子的釋放，特別是TNF-α和IL-12。有研究顯示[40]，IL-10、IL-10 RA或IL-10RB基因突變的炎性腸病嬰兒病情發(fā)展迅速，肛周炎癥也隨著腹瀉明顯迅速惡化，提示IL-10途徑在結(jié)腸黏膜中具有重要作用，功能性IL-10軸在維持結(jié)腸內(nèi)的免疫穩(wěn)態(tài)中不可缺少， IL-10或其受體亞基的缺陷可引起結(jié)腸和肛周區(qū)域的廣泛炎癥。

5.3 其他 研究表明，克羅恩病的病變活動性與其病變部位組織中IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等細胞因子增高有關(guān)。Reimund等[41]分別對克羅恩病炎癥和外觀正常的腸黏膜進行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的IL-1β自發(fā)性分泌均增加，其上清液濃度與內(nèi)鏡和組織學(xué)炎癥分級呈正相關(guān)，抑制IL-1β的活性可減輕結(jié)腸炎動物模型的炎性反應(yīng)。IL-12由P40和P35兩個亞單位組成，可使人T細胞有效增殖并誘導(dǎo)Th1細胞產(chǎn)生γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)。IL-17能增強T細胞的啟動，刺激成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞等產(chǎn)生大量促炎介質(zhì)，如IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶2、金屬蛋白酶和化學(xué)增活素等[42]，是T細胞腸道反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子。IL-32是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎細胞因子，主要由淋巴細胞、自然殺傷細胞、上皮細胞和外周血單個核細胞所分泌。IL-1β、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子可誘導(dǎo)克羅恩病患者腸上皮細胞，IL-32α及其mRNA表達增加，且TNF-α與IFN-γ具有協(xié)同作用，其通過NF-κB活化介導(dǎo)IL-1β和(或)TNF-α對IL-32α的誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致IL-32α在炎癥性腸炎尤其是克羅恩病患者中過量表達[43]。因此，IL-32α可能是克羅恩病腸組織中主要的炎癥細胞因子之一。上述炎癥因子與克羅恩發(fā)病機制關(guān)系密切，但與克羅恩肛瘺的相關(guān)性尚未明確，有待進一步研究。

6 遺傳易感性

隨著人類基因組計劃的完成，目前對基因研究的重點已由全基因組序列測定轉(zhuǎn)移到對基因組中個體基因多態(tài)性和功能的研究。個體基因多態(tài)性的主要形式—單鏈核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是目前全世界基因研究領(lǐng)域的熱點之一。有學(xué)者通過全基因掃描的方法對歐洲、加拿大等地區(qū)的炎癥性腸病患者進行研究，發(fā)現(xiàn)了一些與炎癥性腸炎，特別是克羅恩病患者密切相關(guān)的SNP位點，主要位于有機陽離子/麥角硫因轉(zhuǎn)運蛋白1、有機陽離子/麥角硫因轉(zhuǎn)運蛋白2、TNF-α、IL-23R、自噬相關(guān)16樣蛋白1、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2、10q21、NKX2.3、免疫相關(guān)鳥苷三磷酸酶家族成員M、哺乳動物STE20樣激酶1、胎盤和前列腺相關(guān)蛋白5、5p31等基因中[44]。

一項關(guān)于基因與炎癥性腸病臨床表型相關(guān)性的研究顯示[44]，PR結(jié)構(gòu)域蛋白1(rs7746082)基因、NOD-2變異型基因、IL-23R(rs11465804)基因、男性、回腸結(jié)腸疾病位置與腸瘺表型患者的病理改變相關(guān)。NOD-2位于染色體16q12上，是克羅恩病的最強易感基因。有研究發(fā)現(xiàn)[45-49]，NOD-2突變與克羅恩病穿透性、狹窄性病理改變、并發(fā)癥和手術(shù)風(fēng)險增加相關(guān)，若NOD-2具有兩個突變體，則對克羅恩病的特異性可達98%。Schnitzler等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在3種主要的NOD-2多態(tài)性缺失的情況下，NOD-2變異體rs72796353與肛瘺的發(fā)展相關(guān)。Henckaerts等[46]分析了西歐國家克羅恩患者的遺傳特征，發(fā)現(xiàn)周期素依賴性激酶5調(diào)節(jié)蛋白1樣蛋白(rs6908425)變異型的C等位基因和NOD-2變異型缺失與肛瘺具有相關(guān)性。還有研究顯示，腫瘤壞死因子超家族成員15 rs4574921CC基因型與肛瘺的發(fā)展相關(guān)[47]。IBD5是5號染色體上的易感位點，有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白的損傷會改變菌群環(huán)境并導(dǎo)致腸道炎癥；免疫相關(guān)的鳥苷三磷酸酶家族M成員是細胞自噬途徑的一部分，并且其多態(tài)性增加了肛周疾病的風(fēng)險[48]。Cleynen等[49]研究發(fā)現(xiàn)了與克羅恩病患者肛周疾病表型相關(guān)的特定位點，但是并沒有對具體肛周疾病分型進行分析，如肛門狹窄、肛裂、肛周感染等。

目前已有大量的關(guān)于克羅恩病遺傳易感位點的研究，但基因在不同人種、不同地區(qū)的患者中表達具有明顯差異，我國仍需研究出與我國民體質(zhì)相關(guān)的遺傳易感位點。由于目前尚缺乏對克羅恩肛瘺表型的易感位點的研究報道，這或可作為后繼研究的新方向。但除非有高質(zhì)量的研究表明基因變異可以預(yù)測疾病或疾病過程，否則目前基因研究可能存在過度解釋和(或)過度警示的風(fēng)險[49]。

7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

隨著生物分子學(xué)的發(fā)展以及檢驗方法的豐富，越來越多的研究表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)在疾病發(fā)生過程中具有重要作用。Schaefer等[50]研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA可以鑒別克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，可能有助于發(fā)現(xiàn)克羅恩病發(fā)病新機制。克羅恩病患者組織活檢中發(fā)現(xiàn)微小RNA-215表達，可能可預(yù)測其進展為瘺管型克羅恩病[51]。微小RNA對于臨床鑒別診斷腸道癥狀表現(xiàn)延遲的克羅恩病具有重要意義，微小RNA或可對克羅恩病的不同臨床表型進行分類，甚至可能對疾病預(yù)后具有影響。但目前仍缺少對克羅恩肛瘺微小RNA的研究。

8 小 結(jié)

克羅恩肛瘺作為復(fù)雜性肛瘺，具有難診斷、難治療、難愈合的特點，目前關(guān)于克羅恩肛瘺的研究相對較少，該病在蛋白組學(xué)和基因組學(xué)方面的研究缺乏針對性，且缺乏對其轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的研究，關(guān)于EMT和MMP在其發(fā)病機制中的作用也有待進一步研究。