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(廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所, 廣西 桂林 541006)

山茶科(Theaceae)植物種類繁多，全科約36屬700種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶，主要集中于亞洲，其中我國(guó)分布有15屬480余種[1]。山茶科植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如茶組中多種茶的嫩葉可加工成茶葉，是風(fēng)靡世界的飲品；石筆木屬和金花茶組內(nèi)多種植物花色艷麗、樹形優(yōu)美，觀賞價(jià)值極高；油茶組和紅山茶組內(nèi)60多種植物茶籽含有豐富的油脂，是廣泛種植的重要油料植物，具有較高的食用和藥用價(jià)值[1-8]。此外，山茶科植物還包含多種具有經(jīng)濟(jì)用途和觀賞價(jià)值的種類尚未被開發(fā)利用[9-12]。由于環(huán)境變化和過度采集，山茶科內(nèi)大部分野外資源日益減少，已有不少種類被列為稀有瀕危種[13-15]。山茶科種子具有堅(jiān)實(shí)質(zhì)密的種皮，透水和透氣性差，屬于頑拗性種子且具有休眠特性，野外種子萌發(fā)率和成苗率低[16-17]。因此，打破山茶科種子休眠，提高發(fā)芽率和成苗率是山茶科植物擴(kuò)大開發(fā)利用的重要手段之一。

博白大果油茶(Camelliagigantocarpa)、多齒紅山茶(Camelliapolyodonta)、石筆木(Tutcheriachampioni)均為山茶科常綠喬木樹種，花碩大，樹形優(yōu)美，茶籽油脂含量高，是極具價(jià)值的園林樹種和油料植物[18-23]。目前，3種山茶科植物只有零星栽培或處于野生狀態(tài)，產(chǎn)業(yè)化程度不高，其繁殖手段主要采用扦插方式[20-22,25]，而相關(guān)種子育苗技術(shù)及外源激素對(duì)種子萌發(fā)影響的研究報(bào)道偏少。因此，本研究采用不同濃度的赤霉素(GA3)、細(xì)胞分裂素(6-BA)對(duì)博白大果油茶、多齒紅山茶、石筆木的種子進(jìn)行處理，研究其對(duì)3種山茶科種子發(fā)芽的影響，以期為外源激素用于山茶科種子育苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

3種山茶科種子采集于桂林植物園內(nèi)，采收時(shí)間為2017年10月中下旬，果實(shí)采收后置于陰涼處，待果皮開裂后，取出種子，并將種子冷藏于4 ℃冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子重量及形態(tài)觀察

試驗(yàn)在廣西植物研究所園林園藝研究中心進(jìn)行。對(duì)采集后的3種山茶科種子形狀、大小、顏色等形態(tài)特征進(jìn)行觀察。使用精密電子天平、游標(biāo)卡尺分別測(cè)量50顆種子形態(tài)特征：長(zhǎng)、寬、厚，測(cè)百粒重及單粒種子重量，百粒重重復(fù)測(cè)量10次，計(jì)算各指標(biāo)的變異系數(shù)。

1.2.2 種子萌發(fā)抑制試驗(yàn)

參照陳香波等[26]的方法，將3種山茶科種子材料的種皮和胚分離，并稱取博白大果油茶、多齒紅山茶的外種皮、內(nèi)種皮和胚各0.5 g；由于石筆木的內(nèi)外種皮難分離，因此，稱取石筆木的種皮和胚各0.5 g，分別用研缽研磨，研磨后置于錐形瓶中，加入100 mL 80%甲醇，放入4 ℃冰箱，浸提60 h，浸提過程中振蕩數(shù)次，過濾后得到種子不同物質(zhì)的醇提取物。將3種山茶科種子不同部位醇提取物為原液稀釋到5%，同時(shí)以80%甲醇為原液稀釋到5%，作為甲醇對(duì)照。用5%的醇提取物和甲醇對(duì)照浸泡白菜種子3 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，另外設(shè)置無菌水處理組。將浸泡后的種子放入2層濾紙的培養(yǎng)皿中，并加入適量對(duì)應(yīng)的浸泡液潤(rùn)濕濾紙，于25 ℃種子培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，48 h后測(cè)定發(fā)芽率。

1.2.3 種子破休眠處理

選擇無病蟲害的3種山茶科種子各30粒，用0.5%的高錳酸鉀浸泡15 min后，蒸餾水沖洗干凈。在各激素浸泡24 h，其中6-BA和GA3分別設(shè)計(jì)400，200，100 mg/L不同濃度梯度。對(duì)照組(Control group)為蒸餾水浸泡24 h，3種山茶科種子和激素濃度梯度各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將處理完成后的種子放入鋪有2層發(fā)芽紙的萌發(fā)盒內(nèi)，種子萌發(fā)期間保持濕潤(rùn)，種子培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為25 ℃，濕度為90%，黑暗培養(yǎng)。每3天觀察1次種子發(fā)芽情況，以胚根伸長(zhǎng)2 mm為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，持續(xù)觀測(cè)60 d。 測(cè)試指標(biāo)如下：

發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間為從發(fā)芽試驗(yàn)開始到第1粒種子開始萌發(fā)所需天數(shù)(d)

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù))×100%；

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(處理組發(fā)芽數(shù)/對(duì)照組發(fā)芽數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑在不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性分析應(yīng)用Duncan法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，檢驗(yàn)顯著性水平為0.05，計(jì)算數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種山茶科種子形態(tài)特征和種子重量

圖1所示，博白大果油茶和多齒紅山茶種子外種皮均呈茶褐色，石筆木種子種皮呈現(xiàn)黑褐色或茶褐色。3種山茶科種子種皮角質(zhì)堅(jiān)硬，且光滑無毛。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見表1)：3種山茶科種子體積大小依次為：博白大果油茶>多齒紅山茶>石筆木。變異指數(shù)顯示，3種山茶科種子長(zhǎng)度平均變異系數(shù)值相對(duì)較小，而種子寬度和厚度平均變異系數(shù)相對(duì)較大。此外，不同山茶科種子重量有顯著差異，博白大果油茶種子顆粒最大，質(zhì)量最大，為3.779 g/顆，多齒紅山茶次之，最低為石筆木種子，平均為1.899 g/顆。

注：A為博白大果油茶；B為多齒紅山茶；C為石筆木。 圖1 3種山茶科種子形態(tài)特征

圖2 3種山茶科種子各部位浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制作用

表1 3種山茶科種子形態(tài)特征

注：表中同行不同小寫字母表示在0.05水平的差異顯著性。下同。

2.2 種子萌發(fā)抑制作用

3種山茶科種子各部分提取液對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制結(jié)果見圖2，其中博白大果油茶種子的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要存在于內(nèi)外種皮中，與甲醇對(duì)照間存在顯著差異，且外種皮提取液對(duì)白菜種子萌發(fā)抑制強(qiáng)于內(nèi)種皮提取液，具有顯著性差異。多齒紅山茶的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要存在于外種皮和胚中，與甲醇對(duì)照間存在顯著差異，而內(nèi)種皮提取液處理白菜種子的萌發(fā)率顯著高于外種皮提取液，且具有顯著性差異。石筆木種子的5%種皮和胚提取液對(duì)白菜種子萌發(fā)無明顯抑制作用，與甲醇對(duì)照組間無顯著差異。

2.3 不同激素濃度處理對(duì)3種山茶科種子萌發(fā)的影響

2.3.1 不同激素濃度對(duì)博白大果油茶種子萌發(fā)的影響

表2所示，博白大果油茶種子經(jīng)激素浸泡24 h后的博白大果茶種子在6 d時(shí)可以啟動(dòng)發(fā)芽，而對(duì)照組在12 d時(shí)才啟動(dòng)發(fā)芽，表明6-BA和GA3對(duì)博白大果油茶種子萌動(dòng)有一定的促進(jìn)作用。在48 d時(shí)，博白大果油茶種子萌發(fā)基本結(jié)束，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，其中濃度為6-BA 100 mg/L和GA3200 mg/L浸泡的博白大果油茶種子萌發(fā)率最高，分別達(dá)到99.07%和99.05%，不同激素濃度浸泡24 h的種子發(fā)芽率均高于對(duì)照組發(fā)芽率。表明6-BA和GA3對(duì)博白大果油茶發(fā)芽有促進(jìn)作用，但與對(duì)照相比無顯著性差異。在發(fā)芽勢(shì)方面，除了GA3100 mg/L處理組發(fā)芽勢(shì)低于對(duì)照組外，其余處理組發(fā)芽勢(shì)均高于對(duì)照組，其中6-BA 100 mg/L處理下的發(fā)芽勢(shì)最高，達(dá)到87.69%，顯著高于對(duì)照組，表明博白大果油茶種子在激素處理后，促進(jìn)種子生命力，萌發(fā)速度加快。此外，激素處理后的種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于對(duì)照，且具有顯著性差異，表明激素處理后的博白大果油茶種子發(fā)芽速度和整齊度均高于對(duì)照組。

2.3.2 不同激素濃度對(duì)多齒紅山茶種子萌發(fā)的影響

通過分析發(fā)現(xiàn)，在第12天時(shí)，不同濃度GA3處理的多齒紅山茶種子均出現(xiàn)萌動(dòng)，而不同濃度6-BA處理組和對(duì)照組均在15 d時(shí)啟動(dòng)萌發(fā)，GA3處理的多齒紅山茶萌發(fā)結(jié)束時(shí)間為第42天，6-BA處理組和對(duì)照組萌發(fā)結(jié)束時(shí)間為第54天，表明GA3處理多齒紅山茶種子24 h后，能促進(jìn)其提早萌發(fā)，縮短種子萌發(fā)時(shí)間。表3結(jié)果顯示，GA3處理多齒紅山茶種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均顯著高于6-BA處理和對(duì)照組，且具有顯著性差異，其發(fā)芽率達(dá)95.9%～98.8%，而6-BA處理的發(fā)芽率為72.8%～85.5%，對(duì)照組發(fā)芽率為86.37%，表明GA3處理能提高多齒紅山茶種子發(fā)芽率和種子生命力。

表2 不同激素濃度處理下博白大果油茶發(fā)芽情況

表3 不同激素濃度處理下多齒紅山茶發(fā)芽情況

表4 不同激素濃度處理下石筆木發(fā)芽情況

2.3.3 不同激素濃度對(duì)石筆木種子萌發(fā)的影響

通過分析可知，石筆木種子發(fā)芽啟動(dòng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)照組在第40天左右種子才啟動(dòng)萌發(fā)，而GA3處理石筆木種子24 h后，在27 d發(fā)芽啟動(dòng)，6-BA處理的種子在第30～39天啟動(dòng)發(fā)芽，表明GA3處理石筆木種子能促進(jìn)其發(fā)芽，縮短萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間。表4結(jié)果顯示，低濃度的GA3和6-BA有利于石筆木種子萌發(fā)，高濃度反而抑制種子萌發(fā)。與對(duì)照組相比，濃度為100 mg/L的GA3處理后的石筆木發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)顯著升高，其發(fā)芽率達(dá)到28.62%，表明GA3處理石筆木種子能提高其發(fā)芽率，但萌發(fā)率依然偏低，不能有效打破石筆木種子休眠。

3 結(jié)論與討論

山茶科種子屬于厚實(shí)種子，種皮堅(jiān)硬。本研究中3種供試山茶科種子均具有堅(jiān)實(shí)的外種皮，體積大而重，3種山茶科種子長(zhǎng)度平均變異系數(shù)值相對(duì)較小，而種子寬度和厚度平均變異系數(shù)相對(duì)較大，與浙江紅山茶類似[27]，博白大果油茶與多齒紅山茶種子形狀接近，均與石筆木種子形狀差異較大，可能是不同屬間差異所致。博白大果油茶種子質(zhì)量最大，平均單粒種子重可達(dá)3.8 g左右(CV：0.035)。有研究發(fā)現(xiàn)，種子質(zhì)量越大，其貯存內(nèi)含物質(zhì)越多，種子生命力越強(qiáng)[28]，呂曉梅等對(duì)5種山茶屬種子萌發(fā)特性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：長(zhǎng)柱紅山茶重量最大，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)均顯著高于其他4種山茶屬種子[16]。本試驗(yàn)中，博白大果油茶種子啟動(dòng)萌發(fā)時(shí)間早于多齒紅山茶和石筆木，且發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均高于后兩者，可能與博白大果油茶種子所含內(nèi)含物質(zhì)較多，為種子萌發(fā)過程提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。而石筆木種子質(zhì)量最小，所含內(nèi)含物質(zhì)最少，導(dǎo)致其萌動(dòng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)芽率偏低，萌發(fā)整齊度較差。

本研究發(fā)現(xiàn)，博白大果油茶的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要集中在種皮中，多齒紅山茶的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要集中在外種皮和胚中，且萌發(fā)抑制物活性較高，但在種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，博白大果油茶和多齒紅山茶萌發(fā)率均較高，推測(cè)其可能與萌發(fā)過程中萌發(fā)抑制物質(zhì)容易向外溶解有關(guān)，從而解除其對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。石筆木的種皮和胚提取液對(duì)白菜種子無明顯抑制作用，但其種子萌發(fā)率偏低，僅有12.67%，可能原因：一是抑制試驗(yàn)所使用的萌發(fā)抑制物質(zhì)濃度為5%，所含活性物質(zhì)濃度較低；二是種子萌發(fā)過程與種皮厚度、致密度密切相關(guān)[29]，有研究發(fā)現(xiàn)，堅(jiān)硬的種皮是阻礙山茶科種子吸水的重要因素[16]，去除種皮后的厚殼紅瘤果茶種子，發(fā)芽率明顯提高，萌發(fā)時(shí)間提前[30]。石筆木的種皮厚度和質(zhì)密度較大，對(duì)石筆木種子吸水和萌動(dòng)有一定的阻礙作用，從而導(dǎo)致石筆木發(fā)芽率偏低。

種子的休眠和萌發(fā)實(shí)際是促萌發(fā)因子與抑制萌發(fā)物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果[26]。植物激素ABA(脫落酸)是促種子休眠的重要因子之一，其間接參與調(diào)控和維持種子休眠[31]。而GA3是萌發(fā)的主要促進(jìn)因子，在種子萌發(fā)過程中與ABA互為拮抗關(guān)系，可解除種子休眠狀態(tài)，促進(jìn)種子萌發(fā)[31-32]。此外，細(xì)胞分裂素能促進(jìn)多種物種解除休眠，與GA協(xié)同促進(jìn)種子萌發(fā)[31]。大量研究發(fā)現(xiàn)，外源添加GA3、6-BA可提高種子萌發(fā)效果，減少萌發(fā)時(shí)間[26,33-36]。本研究中，較蒸餾水浸種處理，GA3、6-BA浸泡博白大果油茶種子，發(fā)芽率、發(fā)芽整齊度有所上升，且發(fā)芽時(shí)間提前。同樣處理多齒紅山茶發(fā)現(xiàn)，GA3浸泡種子后，能促進(jìn)種子萌發(fā)，發(fā)芽時(shí)間提前，而6-BA則對(duì)種子萌發(fā)作用不大。有研究發(fā)現(xiàn)，貴州石筆木種子存在生理后熟現(xiàn)象，用100 mg/L 6-BA和300 mg/L GA3共同浸泡24 h，種子活力上升，且發(fā)芽率達(dá) 96.7%[37-38]，有效打破其休眠。本試驗(yàn)中，低濃度的GA3能提高石筆木的發(fā)芽率、發(fā)芽整齊度，且發(fā)芽時(shí)間提前，但發(fā)芽率依然偏低，可能是石筆木同樣存在生理后熟現(xiàn)象，需進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究。