郭蘋，程鵬，王鵬飛，陳小兵

（1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473007；2.河南省腫瘤醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 450022）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, LncRNA）長(zhǎng)度＜200 nt，其表達(dá)失調(diào)可引起多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。母系表達(dá)基因3（maternal expression gene 3,MEG3）屬于非編碼RNA，在多種腫瘤中表達(dá)降低或缺失，而其高表達(dá)可抑制多種腫瘤的增殖和生長(zhǎng)[3-7]。胃癌中LncRNA-MEG3的研究相對(duì)較少。有研究表明，LncRNA-MEG3在胃癌細(xì)胞及組織中表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3可抑制癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，但目前LncRNA-MEG3對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及其化療敏感性尚不清楚[8-9]。因此，本研究旨在研究過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及順鉑化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Bibco公司），胎牛血清、LipofectamineTM2000及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），順鉑（美國(guó)Sigma公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8, CCK8）（美國(guó)Coring公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）試劑盒（上海碧云天公司），STAT3、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3, p-STAT3）、Cyclin D1及Bcl-2抗體（美國(guó)Abcam公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1和胃癌MKN28、SGC7901、AGS及BGC823細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將在液氮罐中保存的GES1、MKN28、SGC7901、AGS及BGC823細(xì)胞解凍，解凍后的細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用Trizol法提取 MKN28、SGC7901、AGS及BGC823細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，LncRNA-MEG3正向引物：5′-GCCTGCTGCCCATCTACAC-3′，反向引物：5′-CCTCTTCATCCTTTGCCATC-3′；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶正向引物：5′-AGCCACA TCGCTCAGACAC-3′，反向引物：5′-GCCCAATAC GACCAAATCC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR所得Ct值通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算MEG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 轉(zhuǎn)染及效果檢測(cè)

通過(guò)LipofectamineTM2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。采用pcDNA3.1-MEG3上調(diào)BGC823細(xì)胞中LncRNAMEG3的表達(dá)。轉(zhuǎn)染前接種1 ml/孔（1×105個(gè)/ml）接種BGC823細(xì)胞懸液于6孔板，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞達(dá)70%生長(zhǎng)密度時(shí)將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)MEG3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為pcDNA3.1-MEG3組，同時(shí)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒作為pcDNA3.1組，并設(shè)置空白對(duì)照Control組。嚴(yán)格參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸出轉(zhuǎn)染試劑，加入細(xì)胞培養(yǎng)基后常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA-MEG3的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)

將BGC823細(xì)胞分為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG3組、順鉑組（50μmol/L順鉑處理細(xì)胞）及pcDNA3.1-MEG3+順鉑組（pcDNA3.1-MEG3處理細(xì)胞后加入50μmol/L順鉑）。以100μl/孔（5×103個(gè)細(xì)胞）接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的BGC823細(xì)胞于96孔板，在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將pcDNA3.1-MEG3、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48、72及96 h，并按照分組情況處理細(xì)胞48 h，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，在每個(gè)待測(cè)孔中加入CCK8試劑10μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的光密度（optical density, OD）值，OD值反映細(xì)胞活力，可以間接反映出細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌處理后的細(xì)胞，胰酶消化后懸浮細(xì)胞于500μl Binding緩沖液中，充分混勻后分別加入Annexin V-FITC和PI各5μl進(jìn)行熒光染色，室溫避光條件下孵育細(xì)胞10～15 min，1 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測(cè)

各組細(xì)胞中加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解反應(yīng)30 min后離心取上清，上清即為提取的總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后于100℃水浴鍋中變性5 min，每泳道中等量變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后切下目的蛋白膠，通過(guò)電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中，于搖床中室溫輕搖2 h，洗膜，4℃孵育稀釋好的STAT3、p-STAT3、Cyclin D1及Bcl-2一抗，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)法顯色，化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)曝光并保存圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和正常細(xì)胞的LncRNA-MEG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

以人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1作為對(duì)照細(xì)胞。以GES1細(xì)胞為1，MKN28、SGC7901、AGS及BGC823細(xì)胞中LncRNA-MEG3的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.521±0.056）、（0.626±0.061）、（0.443±0.039）和（0.301±0.032）， 各 細(xì) 胞 LncRNA-MEG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=111.116，P=0.000），LncRNA-MEG3在 BGC823細(xì)胞中的表達(dá)最低，因此選擇BGC823細(xì)胞作為研究對(duì)象。見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌和正常細(xì)胞中的LncRNA-MEG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

2.2 3組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中LncRNA-MEG3相對(duì)表達(dá)量比較

Control組、pcDNA3.1組及pcDNA3.1-MEG3組LncRNA-MEG3相對(duì)表達(dá)量分別為1、（1.018±0.111）和（8.458±0.526），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（F=576.004，P=0.000）；pcDNA3.1-MEG3組 LncRNA-MEG3表達(dá)量高于 Control組（P＜0.05），pcDNA3.1組LncRNA-MEG3相對(duì)表達(dá)量與Control組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.281，P=0.793）。見(jiàn)圖2。

圖2 3組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中LncRNA-MEG3相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

2.3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較

Control組、pcDNA3.1組及pcDNA3.1-MEG3組在24 h的OD值分別為（0.356±0.028）、（0.322±0.026）和（0.215±0.020），48 h 的 OD 值分別為（0.648±0.047）、（0.621±0.041）和（0.345±0.036），72 h的OD值分別為（0.887±0.062）、（0.851±0.058）和（0.578±0.045），96 h的OD值分別為（1.113±0.074）、（1.012±0.078）和（0.811±0.069），經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析：①不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=102.713，P=0.000）；②3組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.198，P=0.000）；③3組OD值變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.919，P=0.000）（見(jiàn)圖3A）。pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG3組、順鉑組及pcDNA3.1-MEG3+順鉑組處理48 h的OD值分別為（0.636±0.046）、（0.339±0.035）、（0.367±0.038）和（0.209±0.023），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.553，P=0.000）。pcDNA3.1-MEG3組和順鉑組OD值分別與pcDNA3.1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.980和9.039，均P=0.000），pcDNA3.1組的細(xì)胞活力較高；分別與pcDNA3.1-MEG3+順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.368和5.309，P=0.002和0.001）；pcDNA3.1-MEG3+順鉑組細(xì)胞活力較低（見(jiàn)圖3B）。

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 （±s）

2.4 過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3或順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG3組、順鉑組及pcDNA3.1-MEG3+順鉑組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.36±0.35）%、（13.48±1.13）%、（10.02±1.04）%和（18.19±1.22）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=152.679，P=0.000）；pcDNA3.1-MEG3組和順鉑組細(xì)胞凋亡率高于pcDNA3.1組（P＜0.05），但低于 pcDNA3.1-MEG3+ 順鉑組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、5。

圖4 過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3或順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的影響

圖5 4組胃癌細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG3組、 順鉑組及pcDNA3.1-MEG3+順鉑組Cyclin D1的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.273±0.032）、（0.121±0.018）、（0.134±0.016）和（0.061±0.008），Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.425±0.045）、（0.172±0.019）、（0.231±0.023）和（0.120±0.009），STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.410±0.046）、（0.423±0.043）、（0.416±0.044）和（0.422±0.040），p-STAT3 的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.154±0.017）、（0.083±0.010）、（0.101±0.012）和（0.024±0.007），4組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2及p-STAT3比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.834、67.890 和 59.251， 均P=0.000），pcDNA3.1-MEG3組和順鉑組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2和p-STAT3表達(dá)低于pcDNA3.1組（P＜0.05），但高于 pcDNA3.1-MEG3+順鉑組（P＜0.05）。4組 STAT3比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.058，P=0.980)。見(jiàn)圖6。

圖6 過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的影響

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)非編碼蛋白的RNA在基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用LncRNA是非編碼RNA中較為重要的一類，參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程，胃癌中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)LncRNA通過(guò)一些復(fù)雜的形式影響其發(fā)生、發(fā)展[10-11]。MEG3是具有腫瘤抑制功能的LncRNA，在正常和腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種人類惡性腫瘤細(xì)胞系中MEG3的表達(dá)缺失，如前列腺、肝臟等。其表達(dá)缺失可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，而其高表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，如宮頸癌、肺癌中MEG3的高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，這提示MEG3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，但LncRNA-MEG3對(duì)胃癌的影響尚不清楚[12-14]。有研究顯示，胃癌中MEG3表達(dá)下調(diào)，與是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)MEG3可降低細(xì)胞增殖能力，阻滯細(xì)胞周期[8-9]。

本研究旨在研究MEG3對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響，以人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1作為對(duì)照，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)LncRNA-MEG3在人胃癌高分化細(xì)胞MKN28、中分化細(xì)胞SGC7901和AGS及低分化細(xì)胞BGC823中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3在BGC823細(xì)胞的表達(dá)最低，因此選擇作為研究對(duì)象。將過(guò)表達(dá)MEG3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后，IncRNA-MEG3的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。順鉑是腫瘤治療中聯(lián)合化療常用的一個(gè)藥物。有研究顯示，多種藥物或分子靶點(diǎn)聯(lián)合順鉑可增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤的化療敏感性[15-16]。本研究中通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)LncRNAMEG3和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合處理BGC823細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者均降低癌細(xì)胞活力，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這提示過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3可增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌的化療敏感性。STAT3是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大量研究顯示，在多種腫瘤細(xì)胞及組織中STAT3呈現(xiàn)高表達(dá)，其高表達(dá)可伴隨多種抑制凋亡的基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[17-18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，利用抑制劑抑制STAT3活性可明顯提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，因此在多種人類腫瘤的干預(yù)治療中，STAT3途徑成為有效的分子標(biāo)靶[19]。STAT3本身不能激活癌細(xì)胞，但可通過(guò)對(duì)多個(gè)靶基因的調(diào)控影響癌細(xì)胞的生理及病理功能，如CyclinD1、Bcl-2及Survivin[20]。CyclinD1與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Bcl-2是Bcl-2家族一員，發(fā)揮抑凋亡作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)降低CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3和順鉑可下調(diào)磷酸化STAT3、CyclinD1及Bcl-2的表達(dá)，兩者聯(lián)合的抑制作用更強(qiáng)，這提示LncRNA-MEG3可通過(guò)下調(diào)STAT3信號(hào)增強(qiáng)順鉑胃癌化療敏感性。

綜上所述，胃癌細(xì)胞中LncRNA-MEG3表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3可降低胃癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高順鉑的化療敏感性，其機(jī)制與下調(diào)STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究可能為胃癌的治療提供新的方法，但本研究?jī)?nèi)容有限，還需更多的實(shí)驗(yàn)研究作為支撐。