周 頔，王志剛，文 明，李詠梅，呂發(fā)金*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所，重慶 400010)

研制集顯影和治療為一體的多功能納米粒是近年研究熱點[1]。理想的納米粒應具有特異性聚集、安全無毒及循環(huán)時間長等優(yōu)點[2]，但目前納米粒仍存在非特異性聚集、循環(huán)時間短等不足。硫化鉍(bismuth sulfide, Bi2S3)對X線有極高吸收力，是較好的CT成像對比劑[3]。全氟已烷(perfluorohexane, PFH)在一定條件下可發(fā)生液氣相變，增強超聲顯像效果[4]。本研究擬構(gòu)建葉酸靶向相變型載Bi2S3納米粒(folate-targeted phase-transition nanoparticles carrying bismuth sulfide， FBS-PFH-NPs)，觀察其基本特性、體外細胞靶向能力及CT/超聲(ultrasound， US)雙模態(tài)顯像效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipa lmitoyl phosphatidyl choline， DPPC； Sigma公司)，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000， DSPE(PEG2000)； Sigma公司]，膽固醇(cholesterol， CH； Avanti公司)，葉酸修飾的DSPE(PEG2000)[DSPE(PEG2000)Folate； Sigma公司]，二棕櫚酰磷脂酰甘油(distearoyl phosphatidylglycerol, DPPG； Sigma公司)，PFH(Avanti公司)，葉酸(Sigma公司)，Bi2S3納米顆粒(中國科學院上海硅酸鹽研究所)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)。

1.1.2 實驗儀器 Malvern激光粒徑儀，Olympus IX53光學顯微鏡(簡稱光鏡)，Hitachi H-7600透射電子顯微鏡，KLUKE st18遠紅外測溫儀，Agilent 7500ce電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectrometer， ICP-OES)，SONIC VCX-130超聲破碎儀，海扶JC型HIFU治療系統(tǒng)，百勝Mylab 90彩色超聲診斷儀，GE LightSpeed CT掃描儀，DFY圖像定量分析儀(重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所自行研發(fā))。

1.2 制備納米粒 將200 μl Bi2S3(10 mg/ml)與 200 mg DPPC、DSPE(PEG2000)Folate、DPPG及CH(4種試劑的體積比為5.0∶3.0∶1.5∶1.5)溶于20 ml三氯甲烷，于45℃下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸2 h(55 r/min)，加入2 ml PBS水化，而后滴加200 μl PFH，冰浴條件下采用超聲波破碎儀振動乳化5 min。將振動乳化后的混合溶液轉(zhuǎn)移至離心管，洗滌、3 500 r/min離心3次(每次5 min)，棄上清液和底層未包裹Bi2S3，加入少量PBS混勻，獲得FBS-PFH-NPs。按照相同方法采用DSPE(PEG2000)制備非靶向載硫化鉍及全氟已烷納米粒(non-folate-targeted nanoparticles carrying bismuth sulfide and perfluorohexane， NBS-PFH-NPs)，不加入Bi2S3制備葉酸靶向載全氟已烷納米粒(folate-targeted nanoparticles carrying perfluorohexane， F-PFH-NPs)。另取Bi2S3、DPPC、DSPE(PEG2000)Folate、DPPG及CH按上述方法溶于三氯甲烷，同時加入10 μl熒光染料DiI混合溶解，制備載DiI標記的FBS-PFH-NPs(DiI-FBS-PFH-NPs)，同時制備DiI標記的NBS-PFH-NPs(DiI-NBS-PFH-NPs)。

1.3 FBS-PFH-NPs基本特性檢測 采用光鏡及透射電鏡觀察FBS-PFH-NPs形態(tài)；激光粒徑儀測量粒徑；X線衍射檢測其衍射圖譜；ICP-OES檢測納米粒中Bi2S3含量。

1.4 體外細胞尋靶實驗 將宮頸癌Hela細胞置于37℃、5% CO2、恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞消化后接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，共9 ml，每個培養(yǎng)皿加入1 ml細胞懸液，每組3皿，培育24 h；隨機分為靶向組、非靶向組及抗體封閉組，分別在靶向組、非靶向組培養(yǎng)基中加入100 μl DiI-FBS-PFH-NPs (1 mg/ml)及100 μl DiI-NBS-PFH-NPs(1 mg/ml)，在抗體封閉組培養(yǎng)基中加入1 mmol/L游離葉酸溶液 1.5 ml及100 μl DiI-FBS-PFH-NPs(1 mg/ml)，均孵育 2 h；加入細胞膜熒光染料DiO(1 mg/ml)染色20 min，PBS沖洗；激光共聚焦顯微鏡下觀察各組納米粒與Hela細胞連接情況。

將對數(shù)生長期的Hela細胞(1×105/ml)接種于無菌離心管，各管中分別加入含不同濃度Bi2S3(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(靶向組)和NBS-PFH-NPs(非靶向組)，孵育2 h后PBS沖洗，采用流式細胞儀檢測納米粒與細胞的連接率。

1.5 體外成像

1.5.1 體外CT成像 將生理鹽水(saline組)、 F-PFH-NPs(F-PFH-NPs組)及含不同濃度Bi2S3(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs組)分別加入Eppendof管中進行CT掃描(管電流170 mA、管電壓100 kV、層厚5 mm)，以GE AW 4.3軟件測量管中溶液CT值。

1.5.2 體外聲致相變 將5 ml FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs組)加入Eppendof管，分別采用60、90、120、150及180 W功率HIFU輻照2 s，以saline為對照(saline組)，采集saline組及FBS-PFH-NPs組相變前后二維及造影模式聲像圖，使用DFY圖像定量分析儀測量回聲強度值。輻照完畢，采用遠紅外測溫儀記錄溶液溫度變化，光鏡觀察相變前后納米粒數(shù)量及大小等。

1.5.3 體外超聲成像 將saline(saline組)、F-PFH-NPs(F-PFH-NPs組)及含不同濃度Bi2S3(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs組)分別裝入孔洞瓊脂糖凝膠模型，采用超聲診斷儀采集各組二維聲像圖，以DFY測量回聲強度。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FBS-PFH-NPs基本特性 FBS-PFH-NPs于光鏡下呈球形，分散性好；透射電鏡下呈殼核結(jié)構(gòu)，Bi2S3分布于脂質(zhì)殼膜；平均粒徑為(458.50±69.22)nm。FBS-PFH-NPs與單純Bi2S3的衍射圖譜峰值相對應；FBS-PFH-NPs中Bi2S3含量為1.0 mg/ml。

2.2 體外細胞尋靶 激光共聚焦顯微鏡下，靶向組大量FBS-PFH-NPs結(jié)合在Hela細胞周圍(圖1A)，而非靶向組(圖1B)和抗體封閉組(圖1C)均未見紅色納米粒與Hela細胞結(jié)合。相同Bi2S3濃度下，靶向組與Hela細胞的連接率均高于非靶向組(P均<0.01)，隨納米粒中Bi2S3濃度增加，2組納米粒與Hela細胞連接率均增加(P均<0.01),見表1。

2.3 體外成像

2.3.1 體外CT成像 saline組和F-PFH-NPs組CT圖像均呈低密度，F(xiàn)BS-PFH-NPs組呈高密度(圖2A)。納米粒中Bi2S3濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0 mg/ml時，F(xiàn)BS-PFH-NPs組CT值分別為(30.60±4.30)HU、(56.60±2.90)HU、(83.70±10.60)HU、(110.00±8.60)HU及(150.00±9.60)HU，隨Bi2S3濃度增高CT值逐漸增高(F=146.14，P<0.01)。

2.3.2 體外聲致相變 二維(圖2B)及造影模式(圖2C)聲像圖均顯示，輻照后saline組回聲強度及溫度均無明顯變化，F(xiàn)BS-PFH-NPs組回聲強度及溫度逐漸增加(F=110.09、440.69，P均<0.01)，且均高于saline組(P均<0.01)，見表2、3。光鏡下觀察，HIFU未輻照時FBS-PFH-NPs未見異常；當以60 W HIFU輻照時相變增大的氣泡少見，功率為90 W時可見小氣泡，120 W時氣泡增多、增大，150 W時氣泡數(shù)量更多、體積更大，且部分融合破裂，180 W時氣泡數(shù)量最多、體積最大，但多數(shù)破裂。

表1 靶向組、非靶向組與Hela細胞連接率比較(%，±s)

表1 靶向組、非靶向組與Hela細胞連接率比較(%，±s)

組別Bi2S3濃度(mg/ml)0.250.501.001.502.002.50F值P值靶向組23.44±2.3333.81±1.2948.14±2.0660.59±4.0075.58±0.8187.44±5.56183.12<0.01非靶向組9.61±3.4618.79±3.4423.27±2.0732.72±1.6840.24±5.6357.27±2.7474.08<0.01t值5.747.0814.7311.1210.768.43——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

表2 saline組與FBS-PFH-NPs組不同功率HIFU輻照下回聲強度比較(dB，±s)

表2 saline組與FBS-PFH-NPs組不同功率HIFU輻照下回聲強度比較(dB，±s)

組別HIFU功率(W)6090120150180F值P值saline組12.33±2.5211.67±2.0812.33±2.0812.67±2.0813.67±2.52——FBS-PFH-NPs組64.33±4.0486.00±5.29110.00±4.00131.33±6.51154.33±8.39110.09<0.01t值-18.92-22.64-37.52-30.09-27.83——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

2.3.3 體外超聲成像 saline組無回聲,F-PFH-NPs組及FBS-PFH-NPs組均呈中等回聲(圖2D)。納米粒中Bi2S3濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml時，F(xiàn)BS-PFH-NPs組回聲強度分別為(49.13±8.93)dB、(55.5±9.85)dB、(64.60±8.49)dB、(73.69±14.30)dB及(86.43±14.13)dB，隨Bi2S3濃度增高回聲強度逐漸增高(F=16.74，P<0.01)，且均高于F-PFH-NPs組[(14.39±3.14)dB，P均<0.01]。

表3 saline組與FBS-PFH-NPs組不同功率HIFU輻照下溫度比較(℃，±s)

表3 saline組與FBS-PFH-NPs組不同功率HIFU輻照下溫度比較(℃，±s)

組別HIFU功率(W)6090120150180F值P值saline組11.67±1.5317.00±2.0025.67±2.0829.67±3.5136.33±2.08——FBS-PFH-NPs組37.33±2.5268.33±2.5284.33±0.5889.67±1.5392.67±1.53440.69<0.01t值-15.10-27.66-47.04-27.14-37.79——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察FBS-PFH-NPs與Hela細胞結(jié)合情況(×400) A.靶向組，大量紅色FBS-PFH-NPs結(jié)合在Hela細胞周圍； B、C.非靶向組(B)及抗體封閉組(C)均未見紅色納米粒與Hela細胞結(jié)合

3 討論

目前多功能納米粒是分子影像學發(fā)展的重點及熱點，既可同時實現(xiàn)多種影像技術(shù)顯影，又能攜帶藥物、基因等對疾病進行治療，具有廣闊應用前景[5]。傳統(tǒng)超聲造影劑多為微米級，顯影效果好，但很難穿過腫瘤血管內(nèi)皮間隙[6]。本實驗制備的FBS-PFH-NPs成功包裹Bi2S3，粒徑約400 nm，可穿透血管內(nèi)皮間隙而聚集于腫瘤組織，即被動靶向；同時FBS-PFH-NPs通過葉酸靶向作用可主動結(jié)合于細胞表面，即主動靶向。乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等上皮源性的惡性腫瘤細胞表面高表達葉酸受體，而正常組織幾乎不表達，故葉酸可作為特異靶向腫瘤組織的靶點[7]；葉酸與腫瘤細胞特異性結(jié)合時，可開啟受體介導的主動靶向策略，使納米粒精準、大量到達腫瘤組織。本研究體外尋靶實驗顯示，靶向組大量FBS-PFH-NPs結(jié)合于宮頸癌Hela細胞周圍，表明FBS-PFH-NPs具有主動靶向Hela細胞的能力；而非靶向組和抗體封閉組均未見納米粒與細胞結(jié)合，提示加入游離葉酸后，葉酸受體被游離葉酸占據(jù)，阻斷納米粒與Hela細胞結(jié)合。

超聲顯像與組織聲環(huán)境密切相關(guān)，而聲環(huán)境又與納米粒的聲學特性相關(guān)，納米粒構(gòu)成越復雜，其與周圍組織聲阻抗差異越大，背向散射越顯著，超聲成像效果越好。造影劑外殼包裹可增加其表面張力，改善納米粒的共振特性及振幅等聲學特征，增強背向散射強度，提高超聲顯像效果[8]。FBS-PFH-NPs殼膜中包裹Bi2S3，使納米粒聲阻抗改變，超聲成像效果提高。傳統(tǒng)納米粒半衰期短(3～15 min)，顯影效果差，限制了其作為超聲分子探針的應用[9]。本實驗中，F(xiàn)BS-PFH-NPs包裹的PFH在室溫下為液態(tài)，外界壓力減小至氣化壓力閾值或溫度升高至沸點以上時，可發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變而成為微氣泡[10]，從而增強超聲顯影。FBS-PFH-NPs具有聲致相變特性，可有利于解決傳統(tǒng)超聲造影劑穿透組織深度與顯影能力的矛盾。本組結(jié)果顯示，隨HIFU功率增大，F(xiàn)BS-PFH-NPs溫度及回聲強度逐漸增強，相變的納米粒數(shù)量逐漸增多、體積逐漸增大，原因可能為HIFU產(chǎn)生的熱效應等促使PFH發(fā)生液氣相變，相變的納米粒協(xié)同增強HIFU的空化效應。

碘油是目前臨床常用CT對比劑，但半衰期短，且具有潛在腎毒性及致過敏反應等缺點。Bi2S3中鉍元素原子序數(shù)較大，且X線衰減系數(shù)高(約為碘油的5倍)，對X線有強大吸收能力，可提高CT成像對比度，同時具有低毒性、性價比高、粒子直徑小、循環(huán)時間長及表面可修飾等優(yōu)點[11]。本研究中saline組及F-PFH-NPs組CT圖像均呈低密度，F(xiàn)BS-PFH-NPs組呈高密度，且隨Bi2S3濃度增高，F(xiàn)BS-PFH-NPs組CT值逐漸增高。

綜上所述，本研究成功制備的FBS-PFH-NPs具備靶向?qū)m頸癌Hela細胞及增強CT/超聲雙模態(tài)顯像的能力，但液氣相變后氣泡的大小難以控制，可能影響結(jié)果。今后將進一步優(yōu)化實驗條件，以期將相變后的微泡體積控制在一定范圍內(nèi)。