張玨鋒 李芳 鐘海英 陳建明

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制霉菌素對褐飛虱若蟲解毒酶、尿酸酶含量的影響

張玨鋒 李芳 鐘海英 陳建明*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，杭州 310021；*通訊聯(lián)系人，E-mail：chenjm63@163.com)

【目的】為明確取食制霉菌素處理的水稻對褐飛虱[(St?l)]相關(guān)生理指標(biāo)的影響，【方法】以不同濃度制霉菌素處理的水稻飼養(yǎng)褐飛虱，檢測蟲體內(nèi)相關(guān)解毒酶含量與活性以及尿酸酶基因相對含量的變化?！窘Y(jié)果】結(jié)果顯示，取食制霉菌素處理的水稻，褐飛虱體內(nèi)芳香基酰胺酶(aromatic amidase，AAD)含量前期下降，后期抑制作用逐漸消失，酶含量回升；蟲體內(nèi)O-脫乙基酶(O-deethyl enzyme，ODEE)含量在72 h的處理時長內(nèi)顯著低于對照；羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)的活性在不同濃度制霉菌素的處理下呈現(xiàn)不同的動態(tài)變化，高濃度制霉菌素(600 U/mL)處理的褐飛虱種群體內(nèi)的CarE和GST的活性在處理時間段內(nèi)均呈現(xiàn)誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)的現(xiàn)象，而中(300 U/mL)、低濃度(150 U/mL)處理種群中兩種酶則隨著處理時間的延長呈上升趨勢。取食不同濃度制霉菌素處理水稻的褐飛虱種群體內(nèi)類酵母共生菌尿酸酶基因在24 h、48 h之后與對照相比均無顯著差異。取食48 h后，包括對照在內(nèi)的4個處理尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平均有下調(diào)趨勢，當(dāng)處理時長達(dá)72 h時，尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但取食不同濃度制霉菌素處理水稻的褐飛虱種群體內(nèi)含量顯著低于對照?！窘Y(jié)論】取食不同濃度制霉菌素處理的水稻對褐飛虱3齡若蟲的4種主要的解毒酶具有不同的影響；制霉菌素處理可通過減少類酵母共生菌數(shù)量從而降低尿酸酶的含量。

褐飛虱；制霉菌素；解毒酶；尿酸酶基因

褐飛虱[(St?l)]屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)、r-對策遷飛性害蟲，通過取食水稻韌皮部汁液為害。褐飛虱因具有繁殖速度快、生長周期短、內(nèi)稟增長率高等特點而極易暴發(fā)成災(zāi)?；瘜W(xué)殺蟲劑是目前褐飛虱田間防治的主要手段，然而化學(xué)殺蟲劑的濫用，不但對糧食安全造成隱患，而且導(dǎo)致田間褐飛虱抗藥性連年上升，這已成為褐飛虱防治中的瓶頸。

褐飛虱體內(nèi)存在類酵母共生菌(yeast-like symbiotes，YLS)，能合成蟲體所需氨基酸、固醇等物質(zhì)[1-3]。其中，YLS合成固醇類營養(yǎng)的功能歸因于該菌中存在的尿酸氧化酶(urate oxidase, EC1.7.3.3)，這是生物體內(nèi)嘌呤降解代謝途徑中的一種酶，可以將尿酸進(jìn)一步分解為尿囊素和其它含氮化合物，從而供給YLS作為原料合成膽固醇，因而消除或降低褐飛虱體內(nèi)的YLS數(shù)量可能導(dǎo)致尿酸酶含量降低；尿酸囤積而減少對褐飛虱的營養(yǎng)供給。制霉菌素(nystatin)是一種多烯類抗真菌藥，醫(yī)學(xué)上主要用于內(nèi)服治療消化道真菌感染或外用于表面皮膚真菌感染[4]。張玨鋒[5]、王國超[6]等發(fā)現(xiàn)用制霉菌素處理褐飛虱后會引起蟲體內(nèi)YLS數(shù)量減少、必需氨基酸含量降低、死亡率升高等；同時相對于化學(xué)殺蟲劑所還具有毒性低，不易殘留等特點。因而研究取食制霉菌素之后褐飛虱體內(nèi)相關(guān)生理指標(biāo)的變化對于尋求田間褐飛虱防控的安全有效措施具有重要意義。

昆蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶(P450)、羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)以及芳基酰胺酶(arylacylamidase，AAD)等解毒代謝酶在蟲體代謝化學(xué)殺蟲劑等物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。解毒酶系活性的增強(qiáng)是害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生高水平抗性和交互抗性的主要原因之一[9-10]，而解毒酶的表達(dá)和代謝能力，易被包括化學(xué)殺蟲劑的外源化合物所誘導(dǎo)。孫璟琰[11]等發(fā)現(xiàn)芳基酰胺酶參與了小菜蛾對呋喃蟲酰肼的抗性的形成；邢靜等[12]在用氯蟲苯甲酰胺連續(xù)處理小菜蛾之后發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的羧酸酯酶和細(xì)胞色素P450 O-脫乙基酶的比活力有明顯的誘導(dǎo)增強(qiáng)作用，因而推測該兩種酶的比活力增強(qiáng)可能與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性下降有關(guān)。除化學(xué)殺蟲劑之外，茉莉酸甲酯[13]、增效醚[14]等外源化學(xué)物質(zhì)也能激活昆蟲體內(nèi)羧酸酯酶、O-脫乙基酶以及P450 酶等與解毒化學(xué)物質(zhì)相關(guān)的代謝酶的表達(dá)。本研究通過不同濃度制霉菌素處理的水稻飼養(yǎng)褐飛虱后，檢測褐飛虱體內(nèi)相關(guān)解毒酶含量與活性以及尿酸酶基因相對含量的變化，以明確取食制霉菌素處理的水稻對褐飛虱相關(guān)生理指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究利用制霉菌素控制褐飛虱為害提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種TN1種子催芽后播種，至秧齡30~40 d時，移栽至塑料盆缽中，7~10 d后用于飼養(yǎng)褐飛虱。

供試褐飛虱采集杭州田間種群的褐飛虱高齡若蟲和成蟲，用上述TN1稻苗連續(xù)飼養(yǎng)2代后，取褐飛虱初孵若蟲進(jìn)行試驗。

所用的實驗材料包括制霉菌素(上海生工生物技術(shù)有限公司)、柱式酵母總RNA抽提純化試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit, TaKaRa)、昆蟲O-脫乙基酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海裕平生物科技有限公司)、昆蟲芳基酰胺酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海裕平生物科技有限公司)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)、羧酸酯酶試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。

A－芳基酰胺酶(AAD)；B－O-脫乙基酶(ODEE)；C－羧酸酯酶(CarE)；D－谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一時間點不同處理間標(biāo)注不同小寫字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

Fig. 1. Effect of nystatin on detoxifying enzymes in the

1.2 方法

1.2.1 制霉菌素處理水稻

水稻品種TN1催芽后，播于瓷盆中，7 d后將稻苗移至直徑15 mm、長150 mm試管中，每管1株，分別用150、300、600 U/mL的制霉菌素溶液培養(yǎng)，每個濃度設(shè)置250個重復(fù)，清水為對照。每管接入2頭褐飛虱3齡若蟲，每24 h、48 h、72 h取樣。

1.2.2 解毒酶活性測定

不同時間段取樣褐飛虱20頭，加入5 mL PBS (pH 7.4)研磨，3000下離心20 min取上清，根據(jù)各個試劑盒步驟進(jìn)行測定。

1.2.3 尿酸酶基因的RT-PCR分析

各處理褐飛虱20頭，液氮研磨后，用Ambion公司酵母RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA 提取操作。

按照TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)使用說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系如下:5×PrimeScript 緩沖液(for Real Time) 4 μL;逆轉(zhuǎn)錄酶I 1 μL；寡核苷酸(50 μmol/L)1 μL；6核苷酸隨機(jī)引物(100 μmol/L)1 μL；總RNA 5 μL。ddH2O(無RNA酶) 加至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件: 37℃，15 min，85℃，5 s，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于?20℃。

qRT-PCR驗證: 應(yīng)用 Light Cycler Real Time PCＲ擴(kuò)增儀(羅氏) 的操作方法，使用TaKaRa公司的 SYB Premix Ex試劑盒，以5＇-TCATCTTT GCTTGGCTAT-3＇；5＇-TCTTGTTACCCTTATGTT TG-3＇為引物，按照使用說明進(jìn)行RT-PCR檢測。條件如下：50.0℃下3 min；95.0℃下3 min；95.0℃下10 s；60.0℃下30 s(40次循環(huán))；溶解曲線 60℃ to 95℃ : 增量為 0.5℃下10 s 讀板。

所有結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤值的形式呈現(xiàn)，并制成表格。使用Graphpad prism (Graphpad Software, San Diego, CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下褐飛虱體內(nèi)各解毒酶活性變化

取食制霉菌素處理的水稻，褐飛虱體內(nèi)AAD含量前期下降，后期抑制作用逐漸消失，含量回升；蟲體內(nèi)ODEE含量在72 h內(nèi)顯著低于對照，僅在48 h時，300 U/mL及600 U/mL處理短暫上升至12.57 U/L與12.82 U/L，與對照無顯著差異，至72 h時長3處理ODEE含量又呈現(xiàn)顯著低于對照處理的狀態(tài)。CarE和GST的活性在不同濃度制霉菌素的處理下呈現(xiàn)不同的發(fā)展趨勢，高濃度制霉菌素(600 U/mL)處理的褐飛虱種群體內(nèi)的CarE和GST的活性在處理時間段內(nèi)均呈現(xiàn)誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)的現(xiàn)象，而中、低濃度處理種群中兩種酶則隨著處理時間的延長呈上升趨勢。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因推測可能600U/mL的高濃度，在短期內(nèi)易對蟲體內(nèi)解毒酶產(chǎn)生了抑制作用，但抑制現(xiàn)象隨著處理時間延長會解除，且酶活升高數(shù)值高于中、低濃度處理。

2.2 不同處理褐飛虱體內(nèi)尿酸酶基因相對含量轉(zhuǎn)錄水平的變化

表1顯示了褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌尿酸酶基因在寄主取食制霉菌素處理水稻不同時長之后相對于對照種群的表達(dá)情況。取食不同濃度制霉菌素處理水稻24 h、48 h之后，褐飛虱種群體內(nèi)尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平與對照均無顯著差異。取食48 h時，包括對照在內(nèi)的4個處理尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平相對于24 h時均有下調(diào)趨勢，其中600 U/mL處理下調(diào)近69.70%。而當(dāng)處理時長達(dá)72 h時，尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，150、300及600 U/mL處理的尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平分別上升為48 h的1.71倍、6.22倍及1.78倍，而對照處理在取食72 h之后，尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平上升至17.53倍，顯著高于其余處理。產(chǎn)生72 h尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平上升推測與實驗中所用的3齡若蟲在飼養(yǎng)72 h之后，向高齡若蟲轉(zhuǎn)化，體內(nèi)共生菌的數(shù)量快速增長有關(guān)。

表1 取食不同處理水稻后褐飛虱體內(nèi)尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法檢測在0.05水平上差異顯著。

Data in the table are mean±SE. Different letters in the same row indicate significant difference among different concentrations at 0.05 level by the Duncan’s new multiple range test.

3 討論

制霉菌素是一種多烯型抗生素，具有共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。制霉菌素的處理可以抑制褐飛虱體內(nèi)的YLS的數(shù)量，降低部分氨基酸的含量[5-6]。昆蟲在外源化學(xué)物質(zhì)的選擇壓力下，會通過增加體內(nèi)代謝解毒酶活力，加快對外源物質(zhì)的代謝解毒過程。本研究中發(fā)現(xiàn)取食制霉菌素處理的水稻對褐飛虱體內(nèi)ODEE酶含量具有顯著的抑制作用，對AAD酶含量前期具有先抑制后誘導(dǎo)的作用；CarE和GST的活性在不同濃度制霉菌素的處理下呈現(xiàn)不同的發(fā)展趨勢，高濃度(600 U/mL)處理褐飛虱種群體內(nèi)的CarE和GST的活性在處理時間段內(nèi)均呈現(xiàn)誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)的現(xiàn)象，而中、低濃度處理種群中兩種酶則隨著處理時間的延長呈上升趨勢。可見，取食不同濃度制霉菌素處理的水稻對褐飛虱3齡若蟲的4種主要的解毒酶具有不同的影響。GST和CarE作為重要的解毒酶，也是昆蟲代謝化學(xué)藥劑的重要酶系，在有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和有機(jī)氯等化學(xué)藥劑的代謝中發(fā)揮了重要作用[15]。但同一昆蟲不同時期對外界化學(xué)藥劑的敏感性存在差異，因為不同時期昆蟲中靶標(biāo)酶和解毒酶的活性不同，因而可能會形成中低濃度制霉菌素處理對GST酶與CarE酶有誘導(dǎo)作用，而高濃度處理具有不同的時間效應(yīng)產(chǎn)生誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)的現(xiàn)象，李陽等[14]增效醚處理二化螟4齡幼蟲發(fā)現(xiàn)蟲體內(nèi)ECOD和CarE的活性變化也具有不同的時間效應(yīng)，呈現(xiàn)誘導(dǎo)與抑制交錯的現(xiàn)象[16-17]。芳基酰胺酶(AAD)是生物體內(nèi)農(nóng)藥及其他外源物質(zhì)的重要水解酶之一，由于芳基酰胺酶參與了昆蟲對含有酰胺基團(tuán)的化學(xué)藥劑的水解代謝[11]，所以芳基酰胺酶對含有酰胺鍵的有機(jī)磷類、苯甲基酰基脲類及雙酰肼類殺蟲劑的代謝中起著重要作用[18-19]。制霉菌素屬于共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，不含有酰胺基團(tuán)，因此，可能對AAD的含量無影響，但本研究中隨著處理時間的延長，AAD酶的活性已呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，此現(xiàn)象可能與實驗中所用試蟲在實驗過程中齡期的增長有關(guān)。ODDE屬于細(xì)胞色素P450酶系，與 CarE酶、GST酶是昆蟲中不同功能的解毒酶，該類酶主要運(yùn)用-脫烷基作用、烷基和芳基的羥基化作用、環(huán)氧化作用等作用來進(jìn)一步代謝有毒化合物，而該類功能可能對制霉菌素的共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的降解并無效果，因而本實驗結(jié)果顯示取食霉菌素處理水稻對褐飛虱3齡若蟲的ODDE酶具有顯著的抑制作用影響。

尿酸酶存在于褐飛虱體內(nèi)的YLS中，不屬于解毒酶系，但由于該酶具有降解尿酸，提供合成寄主必需氨基酸原材料的功能，因而對寄主具有重要意義。由于昆蟲尿酸酶的測定缺少成熟的方法，本研究中采用測定尿酸酶基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的方法[20]。包括對照在內(nèi)的4個褐飛虱種群在72 h之后體內(nèi)尿酸酶相對轉(zhuǎn)錄水平都顯著升高，但3個處理種群體內(nèi)尿酸酶基因相對轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照降低。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因推測可能為制霉菌素處理對低齡若蟲體內(nèi)的類酵母菌含量影響不顯著[5]，而實驗中所用的3齡若蟲在飼養(yǎng)72 h之后，向高齡若蟲轉(zhuǎn)化，體內(nèi)共生菌的數(shù)量快速增長有關(guān)，尿酸酶含量隨之增長，制霉菌素對尿酸酶的抑制作用隨之逐漸顯現(xiàn)。由此可推測制霉菌素處理可能通過減少YLS數(shù)量從而降低尿酸酶的含量，使褐飛虱蟲體內(nèi)尿酸分解被抑制，從而減少寄主所需合成膽固醇、必需氨基酸等必需營養(yǎng)元素的原料供給。

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Effects of Nystatin Treatment on Detoxification Enzymes andUricase Content in Nymphs of the Brown Planthopper [(St?l)]

ZHANG Juefeng, LI Fang, ZHONG Haiying, CHEN Jianming*

(,,,;,:)

s：【Objective】To illuminate theeffect of concentrations of nystatin on physiological indicators of brown planthoppers [(St?l)],【Method】detoxifying enzymes and uricase gene relative transcriptional level in brown planthoppers () were measured after treatment with different concentrations of nystatin. 【Result】The content of aromatic amidase (AAD) in the brown planthopper(BPH) populationfed on nystatin treated rice was decreased in the early stage, and increased gradually in the late stage. Nystatin treatment could significantly decrease the content of O-deethyl enzyme (ODEE).Activity of carboxylesterase(CarE) and glutathione S-transferase(GST) in BPH showed different trends under the treatment of nystatin. The activities of CarE and GST in 600 U/mL nystatin treated BPH population was induced-inhibited-induced during the treatment period, while there has been general uptrend of activities of two enzymes in the 300 U/mL and 150 U/mL nystatin treated populations within 72 h.The relative transcriptional level of uricase gene in different concentrations nystatin treated BPH populations had no significant difference with control by treatment with 24 h and 48 h. After feeding 48 h, the transcriptional level in three nystatin treated BPH populations and control population all decreased. To 72 h, the relative transcriptional level of uricase gene increased and transcriptional level in treated population was significantly lower than that in control population. 【Conclusion】Four detoxifying enzymesshowed different trends after BPH was fed on rice treated with nystatin at different concentrations, nystatin treatment also reduce the content of uricase by reducing the number of yeast-like symbiotes.

; nystatin; detoxifying enzymes; uricase gene

10.16819/j.1001-7216.2019.7129

S435.112+.3; S482.2

A

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浙江省公益科技計劃資助項目(2016C32100)。