胡昭君， 陳 斌， 余岳林， 張少敏

（上海市靜安區(qū)食品藥品檢驗所，上海 200435）

陳香露白露片由甘草、次硝酸鉍、陳皮、碳酸鎂、川木香、氧化鎂、大黃、碳酸氫鈉、石菖蒲組成，功效健胃和中、理氣止痛，主要用于胃酸過多、慢性胃炎引起的胃脘痛等癥狀。目前，陳香露白露片質量標準[1］中的含有量測定僅針對化藥次硝酸鉍，尚未涉及甘草、陳皮等中藥成分；前期報道有測定次硝酸鉍中鉍含有量的[2］，測定陳皮中橙皮苷含有量的[3-6］，測定甘草中甘草酸銨、甘草次酸含有量的[7-8］，分別測定陳皮中橙皮苷、甘草中甘草酸銨含有量的[9］，但對其他中藥成分含有量測定均無報道。陳香露白露片中甘草有補中益氣、緩急止痛、清熱解毒的作用[10］，主要成分為甘草酸銨；陳皮有理氣健脾、燥濕化痰的作用[11］，主要成分為橙皮苷；川木香在治療胃腸道疾病方面有比較好的療效，其主要活性成分為木香烴內酯和去氫木香內酯[12］。本實驗通過HPLC法同時測定陳香露白露片中甘草酸銨、橙皮苷、木香烴內酯、去氫木香內酯的含有量，方法快速簡便，穩(wěn)定可靠，可更有效地控制該制劑內在質量，并為保證其臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀，配置真空脫氣機、四元泵、自動進樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極陣列管檢測器、色譜工作站 （美國 Waters公司）；Branson B55000S-MT超聲波清洗器 （上海必能信超聲有限公司）；ME-235S／CP124S電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥 橙皮苷 （110721-201617， 含有量96.1%）、 甘草酸銨 （110731-201619， 含有量93.0%）、木香烴內酯 （111524-201710， 含有量99.5%）、去氫木香內酯 （111525-201711，含有量99.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純 （德國Merck公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。5批陳香露白露片均購自藥店，來自5家生產(chǎn)企業(yè) （批號170105、20170502、161201、 160411、 A161260）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對照品橙皮苷9.83 mg、甘草酸銨19.34 mg、木香烴內酯9.50 mg、去氫木香內酯9.37 mg，置于4個50 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取4種貯備液5、2、1、1 mL置于同一20 mL量瓶中，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取質量差異項下片劑研勻，精密稱取約0.5 g，置于50 mL量瓶中，加適量50%甲醇超聲提取30 min，取出，放冷，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝，分別制備缺陳皮、甘草、川木香的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備相應溶液，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Agilent Eclipse C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相甲醇 （A） -0.1%磷酸 （B）， 梯度洗脫 （0～20 min，70%～60%B； 20～30 min， 60% ～40%B； 30～50 min， 40% ～30%B； 50～51 min， 30% ～10%B；51～56 min， 10%B； 56～57 min， 10% ～70%B；57～67 min， 70%B）； 體積流量 1.0 mL／min； 柱溫30℃；檢測波長230 nm；進樣量20 μL。理論塔板數(shù)按橙皮苷計均大于8 000，各成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于3.0。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，供試品在對照品相同保留時間處有色譜峰，陰性無干擾，待測成分與其他成分分離度良好。

2.4 線性關系考察 精密稱取橙皮苷對照品20.62 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，作為橙皮苷對照品貯備液；精密稱取甘草酸銨對照品19.80 mg、木香烴內酯對照品11.38 mg、去氫木香內酯對照品10.76 mg，置于同一20 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，作為混合對照品貯備液。分別精密量取前一種對照品貯備液2.5、5、10、15、30 mL，后一種對照品貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，作為相應對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣20 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標 （X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取供試品溶液 （批號170105）1份，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積 RSD分別為 0.31%、0.38%、0.32%、1.07%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號 （170105）片劑，按 “2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內酯、去氫木香內酯含有量RSD分別為1.07%、0.84%、1.23%、0.61%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 （批號170105）1 份， 于 0、 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、36 h在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積RSD分別為0.60%、0.53%、0.79%、0.36%，表明供試品溶液在36 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取橙皮苷、甘草酸銨、木香烴內酯、去氫木香內酯對照品適量，50%甲醇稀釋，制成每1 mL分別含上述對照品0.188 9、0.047 56、 0.041 16、 0.041 60 mg／mL的對照品溶液。精密稱取 “2.6”項下含有量已知的片劑 （批號170105）0.25 g，共9份，置于50 mL量瓶中，精密加入對照品溶液4、5、6 mL，再加入適量50%甲醇，按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.9 樣品含有量測定 取5批片劑，按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表3。

3 討論

3.1 流動相選擇 參照2015年版 《中國藥典》中陳皮、甘草、川木香含有量測定條件，本實驗考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰峰形在甲醇-0.1%磷酸中較好，而且與相鄰雜質峰的分離度均能達到要求，故選擇其作為流動相。

表2 各成分加樣回收率試驗結果 （n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

3.2 檢測波長選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器，在190～380 nm波長范圍內進行掃描，發(fā)現(xiàn)橙皮苷在194、284、328 nm附近有最大吸收，而且在230 nm處有1個肩峰，其吸收值高于 284、328 nm；甘草酸銨在194、251 nm附近有最大吸收，而且在250 nm處呈肩峰；木香烴內酯和去氫木香內酯在194 nm附近有最大吸收，而且其吸收值隨著波長增加呈下降趨勢，300 nm以上基本無吸收，考慮到194 nm為末端吸收，溶劑及雜質干擾會比較大，而在230、251 nm附近4種成分都會有一定吸收，故選擇230、251 nm作為檢測波長。然后，考察各成分響應值及雜質對測定的干擾，發(fā)現(xiàn)在230 nm波長處各成分響應值均較高，與雜質峰分離良好；在251 nm處木香烴內酯、去氫木香內酯響應值太低。最終，選擇230 nm作為檢測波長。

3.3 提取條件選擇 本實驗考察以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、稀乙醇為溶劑超聲30 min的提取效果，發(fā)現(xiàn)溶于50%甲醇時不僅各成分峰形良好，而且雜質對目標成分測定基本無干擾，故選擇50%甲醇作為溶劑。再考察超聲30 min、加熱回流30 min、室溫浸漬過夜的提取效果，發(fā)現(xiàn)室溫浸漬過夜時提取率最低，而加熱回流提取率略高于超聲，但雜質明顯更多，甚至有1個已經(jīng)干擾到目標成分測定，故選擇超聲作為提取方法。然后，考察超聲15、30、45、60 min時的提取率，發(fā)現(xiàn)提取45、60 min時的提取率接近30 min，高于15 min，故選擇30 min作為提取時間。

3.4 含有量分析 表3顯示，5批陳香露白露片中4種成分含有量存在顯著差異，以木香成分木香烴內酯、去氫木香內酯最明顯，RSD分別高達64.1%、83.3%，而陳皮成分橙皮苷RSD也高達33.2%。由于陳香露白露片中各藥材均以原粉入藥，故推測上述現(xiàn)象可能是投料用飲片質量參差不齊所致，為了保證該制劑臨床用藥安全有效，需要對其中所含成分的含有量進行監(jiān)控。