湯秀梅， 楊 燕， 丁江生， 孔美江， 張 煌， 王澤人

（1.云南省藥物研究所，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南昆明 650111；2.深圳市藥欣生物科技有限公司，廣東深圳 518000）

燈盞花素口崩片是云南省藥物研究所采用燈盞花素研制的口崩片，服用方便，適用于吞咽困難的患者，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)功效，用于腦絡(luò)瘀阻、中風(fēng)偏癱、心脈痹阻、胸痹心痛、中風(fēng)后遺癥及冠心病心絞痛證候者[1］。本實(shí)驗(yàn)將燈盞花素口崩片用聚氯乙烯泡罩包裝后進(jìn)行穩(wěn)定性研究，考察其性狀、崩解時(shí)限、溶出度、含有量變化情況，初步確定貯存有效期。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 708-DS溶出度儀、Agilent 1260高效液相色譜儀 （美國(guó)Agilent公司）；KB-1口崩片崩解儀 （天津天大天發(fā)科技有限公司）；恒溫恒濕箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 燈盞花素口崩片 （云南省藥物研究所制劑室，

批號(hào)20160414、20160623、20160624、20160625）。 野黃芩苷對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110842-201508，含有量91.3%）。甲醇、四氫呋喃為色譜純；磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測(cè)定[2］

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 通過(guò)高效液相色譜儀中的二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)得到三維圖譜，發(fā)現(xiàn)燈盞花素最大吸收波長(zhǎng)為335 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故確定335 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相甲醇-四氫呋喃-0.2%磷酸（28∶10∶62）；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按野黃芩苷計(jì)，應(yīng)不低于5 000。

2.1.3 溶劑選擇 分別用甲醇、65%甲醇、0.2%磷酸溶解口崩片，發(fā)現(xiàn)其在甲醇中溶解度最高，故確定甲醇作為溶劑。

2.1.4 超聲時(shí)間選擇 口崩片分別超聲20、40、60 min，發(fā)現(xiàn)超聲40 min時(shí)供試品含有量最高，故確定40 min作為超聲時(shí)間。

2.1.5 對(duì)照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇超聲40 min，冷卻至室溫，甲醇稀釋成每1 mL含80 μg野黃芩苷的溶液，過(guò)濾，即得。

2.1.6 供試品溶液制備 取口崩片20片，研細(xì)，精密稱取約80 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇超聲40 min溶解，冷卻至室溫，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密稱取野黃芩苷對(duì)照品，甲醇稀釋至刻度，制得貯備液 （0.836 mg／mL），分別精密吸取5、1、 1、 2、 1、 1 mL 置于 10、 5、 10、 25、 25、 100 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積 （Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y＝16 419X-156.8（r＝0.999 91）， 在 0.016 7～0.836 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按 “2.1.6”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得野黃芩苷含有量RSD為1.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按 “2.1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、3、6、9、12、18、24 h在 “2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD為0.94%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按 “2.1.5”項(xiàng)下方法制備貯備液，精密稱取9份口崩片 （每份10 mg）置于25 mL量瓶中，分別加入貯備液1、2、3 mL，按 “2.1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；另取貯備液4 mL置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。將對(duì)照品、供試品溶液在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得回收率為95%～102%，RSD為2.21%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.11 范圍試驗(yàn) 分別精密稱取供試品量的50%、100%、150%各3份，置于100 mL量瓶中，按 “2.1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得在0.4～1.2 mg／mL范圍內(nèi)RSD為2.02%，可進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.12 中間精密度試驗(yàn) 3名人員對(duì)同一批口崩片按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別用不同高效液相色譜儀在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得含有量RSD為1.67%，表明方法中間精密度良好。

2.1.13 耐用性試驗(yàn) 選擇體積流量 0.8、1.0、1.2 mL／min，柱溫20、30、40℃，流動(dòng)相甲醇-四氫呋喃-0.2%磷酸 （26∶8∶66、28∶10∶62、30∶12∶58），Ecosil-C18、 Kromasi 100-5 C18、 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，供試品、對(duì)照品溶液在 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得野黃芩苷色譜峰分離度均大于2.0，表明方法耐用性良好。

2.2 溶出度測(cè)定[3-7］

2.2.1 溶出介質(zhì)選擇 由于燈盞花素在水中幾乎不溶，故選擇pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液、0.25%十二烷基硫酸鈉溶液、0.5%十二烷基硫酸鈉溶液作為溶出介質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)口崩片在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中溶出量最高，故確定pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。

表1 影響因素試驗(yàn)結(jié)果 （）

表1 影響因素試驗(yàn)結(jié)果 （）

條件 時(shí)間／d 性狀 崩解時(shí)限／s 溶出度／% 含有量／（mg·片-1）—0淡黃色，味微甜 36±2.32 91.7±3.07 39.7±0.32高溫 5 淡黃色，味微甜 38±2.64 91.4±2.46 39.2±0.38 10 淡黃色，味微甜 30±2.23 90.8±2.24 39.4±0.67高濕 5 淡黃色，味微甜 41±2.37 93.3±1.89 39.0±0.39 10 淡黃色，味微甜 36±2.07 90.9±2.42 39.5±0.54光照 5 淡黃色，味微甜 32±2.48 90.5±2.44 40.2±0.78 10 淡黃色，味微甜 39±2.61 92.5±3.31 40.4±0.99

2.2.2 溶出介質(zhì)體積 文獻(xiàn) [8］報(bào)道，燈盞花素在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶解度為4.6 mg／mL。每片口崩片中含40 mg燈盞花素，由于溶出介質(zhì)500 mL時(shí)大于每片飽和溶解體積的5倍以上，達(dá)到漏槽條件，故確定500 mL作為溶出介質(zhì)體積。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同 “2.1.2”項(xiàng)。

2.2.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷對(duì)照品適量，pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成每1 mL中含80 μg野黃芩苷的溶液，即得。

2.2.5 供試品溶液制備 取口崩片適量，以500 mL pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速75 r／min，同法操作，30 min后取樣，濾過(guò)，即得。

2.3 穩(wěn)定性考察[2，9-10］

1批燈盞花素口崩片進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，3批口崩片（中試）進(jìn)行6個(gè)月加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和18個(gè)月長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)。參照2015版 《中國(guó)藥典》四部中口崩片崩解時(shí)限檢查法，將崩解籃浸入1 000 mL量杯中，杯內(nèi)水體積約900 mL，溫度 （37±1）℃，分別測(cè)定6片，記錄崩解時(shí)間。

2.3.1 影響因素試驗(yàn) 將口崩片 （批號(hào)20160414）置于高溫 （60℃）、 高濕 [（90±5）%］、 強(qiáng)光 [（4 500±500）lx］下10 d后，分別于第0、5、10天取樣，檢測(cè)口崩片性狀、溶出度、含有量，結(jié)果見(jiàn)表1，可知在不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。

2.3.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 將3批燈盞花素口崩片 （中試，批號(hào)20160623、20160624、20160625）采用聚氯乙烯泡罩包裝，在溫度 （40±2）℃、相對(duì)濕度 （75±5）%下放置6個(gè)月，分別于第1、2、3、6個(gè)月末取樣，檢測(cè)口崩片性狀、崩解時(shí)限、溶出度、含有量，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1，可知在不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。

2.3.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn) 將3批口崩片 （中試，批號(hào)20160623、20160624、20160625）采用聚氯乙烯泡罩包裝，在溫度 （25±2）℃、相對(duì)濕度 （60±10）%下放置18個(gè)月，分別于第3、6、9、12、18個(gè)月末取樣，檢測(cè)口崩片性狀、崩解時(shí)限、溶出度、含有量，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2，可知在不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。

圖1 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)溶出度 （A）、含有量 （B）趨勢(shì)

表2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 ）

表2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 ）

批號(hào) 時(shí)間／月 性狀 崩解時(shí)限／s 溶出度／% 含有量／（mg·片-1）20160623 0 淡黃色，味微甜 28±2.19 87.5±2.67 36.2±0.27 1淡黃色，味微甜 25±2.80 86.8±3.31 36.7±0.60 2淡黃色，味微甜 32±2.37 88.4±2.22 36.5±0.47 3淡黃色，味微甜 30±2.04 87.1±2.56 37.4±0.61 6淡黃色，味微甜 29±2.58 89.7±2.22 37.1±0.56 RSD／% — — — 1.32 1.26 20160624 0 淡黃色，味微甜 38±2.73 89.2±2.63 36.3±0.37 1淡黃色，味微甜 36±2.45 87.5±1.87 36.8±0.34 2淡黃色，味微甜 38±2.76 88.3±2.24 36.7±0.28 3淡黃色，味微甜 39±2.19 91.0±2.33 37.5±0.61 6淡黃色，味微甜 34±2.90 87.6±3.03 36.9±0.68 RSD／% — — — 1.63 2.16 20160625 0 淡黃色，味微甜 34±2.32 88.2±2.40 36.6±0.59 1淡黃色，味微甜 32±2.64 87.4±2.09 37.0±0.68 2淡黃色，味微甜 31±2.73 89.7±3.36 36.4±0.50 3淡黃色，味微甜 35±1.72 88.1±2.35 37.6±0.45 6淡黃色，味微甜 37±2.53 87.6±2.10 36.4±0.58 RSD／% — — — 1.02 1.34

表3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 （x ±s）

圖2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)溶出度 （A）、含有量 （B）趨勢(shì)

3 討論

野黃芩苷為燈盞花素主要有效成分，故本實(shí)驗(yàn)以其為HPLC法測(cè)定含有量、溶出度的指標(biāo)。參考2010年版 《中國(guó)藥典》一部中燈盞花素含有量測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)考察流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸 （40∶60）洗脫時(shí)野黃芩苷峰與雜質(zhì)峰未分開(kāi)，導(dǎo)致峰型拖尾；四氫呋喃-1%冰醋酸（含0.05%三乙胺） （28∶72）[8］洗脫時(shí)出峰較快，但野黃芩苷峰與雜質(zhì)峰均未分開(kāi)；甲醇-四氫呋喃-0.2%磷酸（28∶10∶62）洗脫時(shí)野黃芩苷峰與雜峰達(dá)到基線分離，分離度達(dá)1.5以上，故確定其作為流動(dòng)相。

然后，本實(shí)驗(yàn)考察了轉(zhuǎn)速和取樣時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，轉(zhuǎn)速 50 r／min時(shí)口崩片溶出度較低；轉(zhuǎn)速100 r／min時(shí)溶出度過(guò)高，10 min即達(dá)到最大值，不利于控制；轉(zhuǎn)速75 r／min時(shí)溶出度在30 min后基本達(dá)到最大值，故確定轉(zhuǎn)速75 r／min，取樣時(shí)間30 min。

表4 轉(zhuǎn)速、取樣時(shí)間考察結(jié)果

燈盞花素口崩片在口腔內(nèi)可崩解，故要求其崩解速度快于常規(guī)劑型[11］，同時(shí)溶出度檢測(cè)的是藥物溶出速率和程度，而含有量是片劑主要檢測(cè)項(xiàng)，故本實(shí)驗(yàn)將崩解時(shí)限、溶出度、含有量作為穩(wěn)定性研究的關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)。影響因素、加速穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)中的崩解時(shí)限均小于60 s，達(dá)到了口崩片相應(yīng)要求，故不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，其中加速、長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，溶出度、含有量變化趨勢(shì)平緩，RSD均小于2.5%，與0月比較基本無(wú)變化，故將有效期暫定為18個(gè)月。