黃克強,席貽龍,朱 韓,張丙行,潘 玲

安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省重要生物資源的保護和利用研究省級重點實驗室,皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心,蕪湖 241000

長期以來,學(xué)者們在污染物毒性生物監(jiān)測等研究中更多地關(guān)注常規(guī)的“優(yōu)先”污染物,特別是那些持久性有機物、重金屬、農(nóng)藥、化工產(chǎn)品及其中間產(chǎn)物。然而,這些化學(xué)品僅僅是整個環(huán)境風(fēng)險評價體系中的一部分,另一類數(shù)量巨大、生物活性復(fù)雜的新興污染物很少被提及和研究,而這類新興污染物中絕大部分是目前被大量使用的人用和獸用藥物[1]。

布洛芬,又名異丁苯丙酸(或2- 4-異丁基苯基丙酸),其制劑稱芬必得(布洛芬緩釋劑)、大亞克芬或美林(口服液)等,屬于新興污染物,為非甾體抗炎藥(NSAID),被廣泛用于治療風(fēng)濕性疾病、疼痛和發(fā)燒,具有較高的治療劑量(600—1200 mg/d)。但是,由于人們在服用后該藥物以母體化合物(游離或綴合的)或以代謝物的形式排泄至顯著程度(70%—80%的治療劑量),而現(xiàn)有的污水處理技術(shù)又不能有效地去除它們,由此導(dǎo)致其在水體中長期低劑量存在,造成“假性”持久性污染[2]。布洛芬在我國地表水環(huán)境中的濃度水平較高,在遼河流域和珠江廣州河段的最大檢出濃度分別可達(dá)246 ng/L和1417 ng/L[3- 4],低于或接近對英國河流(432—5044 ng/L)[5]及加拿大大西洋沿岸河流(6400 ng/L)[6]的報道。水體中的布洛芬對生態(tài)環(huán)境和人類健康具有一定的風(fēng)險[7]。

有關(guān)布洛芬對水生動物的慢性毒性作用已有一些報道。在個體和種群水平上,部分學(xué)者研究了布洛芬對日本青鳉(Oryziaslatipes)[8- 9]、海洋蝦類(Litopenaeus)[10]、淡水腹足類(Planorbiscarinatus)[11]、枝角類(Daphniamagna和Moinamacrocopa)[9, 12- 13]、輪蟲(萼花臂尾輪蟲和B.havanaensis)[14]和水螅(Hydravulgaris和H.attenuata)[15- 16]形態(tài)、生長、存活、攝食、生殖、種群增長和性激素平衡等的影響；在細(xì)胞水平上,Parolini等[17]和Contardo-Jara等[18]研究了布洛芬對淡水雙殼類(Dreissenapolymorpha)的細(xì)胞遺傳毒性；在分子水平上,Heckmann等[12]和Wang等[13]研究了布洛芬對與大型溞解毒相關(guān)的基因表達(dá)的影響。

輪蟲具有世代時間短、個體小、繁殖快速、易培養(yǎng)、對常見的毒物敏感性強等特點,已廣泛被應(yīng)用于水生態(tài)毒理學(xué)研究[19- 20]。已有的研究結(jié)果表明,污染物對輪蟲的生態(tài)毒性效應(yīng)常因水體中藻類等食物密度的不同而存在差異[21- 24],但布洛芬等抗炎藥物對輪蟲的生態(tài)毒性與食物密度之間的關(guān)系如何？不同食物密度下與環(huán)境相關(guān)濃度的布洛芬對輪蟲的生態(tài)毒性是什么？所有這些問題仍有待研究。為此,本文以淡水中常見的萼花臂尾輪蟲為受試生物,采用生命表試驗方法,探究布洛芬濃度對輪蟲生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)的影響及其與藻密度間的關(guān)系,旨在篩選出敏感的指標(biāo)用于水環(huán)境中布洛芬污染的生物監(jiān)測,為探明布洛芬影響輪蟲存活、生殖和種群增長的規(guī)律積累資料。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源和培養(yǎng)

受試生物萼花臂尾輪蟲采于蕪湖市鏡湖,實驗室內(nèi)進行克隆培養(yǎng)。培養(yǎng)液為EPA,由96 mg NaHCO3、60 mg CaSO4、60 mg MgSO4和4 mg KCl溶解于1 L蒸餾水中配制而成[25]；食物為斜生柵藻,以HB- 4培養(yǎng)基[26]培養(yǎng),當(dāng)其處于指數(shù)增長期時離心濃縮并經(jīng)顯微計數(shù)后使用。實驗前,將輪蟲置于(25±1)℃、自然光照(光照強度約130 lx,L∶D約12∶12)的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行為期1周的預(yù)培養(yǎng)。期間,每天投喂密度分別為1.0×106、2.0×106個細(xì)胞/mL和4.0×106個細(xì)胞/mL的斜生柵藻并更換輪蟲培養(yǎng)液一次,同時通過去除一部分個體使輪蟲種群始終處于指數(shù)增長期。

1.2 測試液的配置

1.3 慢性毒性試驗

試驗設(shè)1、10、100、1000 μg/L和5000 μg/L等5個布洛芬濃度,以及1.0×106、2.0×106個細(xì)胞/mL和4.0×106個細(xì)胞/mL等3個斜生柵藻密度,各藻密度下另設(shè)置1個對照組,每組設(shè)置3個重復(fù)。實驗時,將孵化出的齡長4 h內(nèi)的輪蟲幼體挑出,放入8 mL玻璃杯中作為受試母體,并加入5 mL測試液(其中分別含有相應(yīng)密度的斜生柵藻),每個玻璃杯中放置10只輪蟲幼體。實驗在(25±1)℃、自然光照的恒溫培養(yǎng)箱中進行。實驗過程中,每間隔12 h觀察1次并記錄母體的存活數(shù)和孵化出的幼體數(shù),移去死亡個體,并將新生的幼體移至另一玻璃杯中繼續(xù)培養(yǎng),待其產(chǎn)卵后確定雌體類型,用于計算輪蟲一生所產(chǎn)全部后代中的混交雌體比例。每間隔24 h更換1次含有相應(yīng)密度的藻類的測試液。實驗進行至輪蟲母體全部死亡為止。

1.4 研究參數(shù)的定義與計算方法

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用SPSS 16.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。使用Kaplan-Meier分析各藻密度下布洛芬濃度對輪蟲存活率的影響。對所得數(shù)據(jù)作正態(tài)性檢驗后,對符合正態(tài)分布的各組數(shù)據(jù)通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗)分析各布洛芬濃度組與空白對照組間的差異顯著性,通過雙因素方差分析檢測布洛芬濃度、藻密度及其相互作用對輪蟲各生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)的影響；對輪蟲各生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)與布洛芬濃度之間的關(guān)系進行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藻密度下布洛芬對萼花臂尾輪蟲存活率和繁殖率的影響

各藻密度下,布洛芬密度對輪蟲的存活率均無顯著性影響(P>0.05)。當(dāng)藻密度為1.0×106和2.0×106個細(xì)胞/mL時,輪蟲的繁殖率峰值均在5000 μg/L的布洛芬中最高,分別為2.85個后代/雌體/12 h和3.74個后代/雌體/12 h；當(dāng)藻密度為4.0×106個細(xì)胞/mL時,輪蟲的繁殖率峰值在100 μg/L的布洛芬中最高,為3.90個后代/雌體/12h(圖1)。

圖1 不同藻密度和布洛芬濃度下萼花臂尾輪蟲的存活率和繁殖率Fig.1 Survivorship and fecundity of Brachionus calyciflorus exposed to different concentrations of ibuprofen at three algal densities

2.2 不同藻密度下布洛芬對輪蟲生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)的影響

當(dāng)藻密度為1.0×106個細(xì)胞/mL時,布洛芬濃度對輪蟲的生命期望、平均壽命、世代時間、凈生殖率和后代混交率均有顯著性影響(P<0.05)。與對照組相比,100—5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的生命期望和平均壽命顯著縮短,100 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的世代時間顯著縮短,1.0 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的凈生殖率顯著提高,10—5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的后代混交率顯著提高(表1)。

當(dāng)藻密度為2.0×106個細(xì)胞/mL時,布洛芬濃度對輪蟲的生命期望、平均壽命、世代時間、種群內(nèi)稟增長率和后代混交率均有顯著性影響(P<0.05)。與對照組相比,10—5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的生命期望和平均壽命顯著縮短,1000 μg/L和5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的世代時間顯著縮短,1、10、1000 μg/L和5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的種群內(nèi)稟增長率顯著提高,1 μg/L和1000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的后代混交率顯著提高(表1)。

當(dāng)藻密度為4.0×106個細(xì)胞/mL時,布洛芬濃度對輪蟲的生命期望、平均壽命和世代時間均有顯著性影響(P<0.05)。與對照組相比,10—5000 μg/L布洛芬處理組中輪蟲的生命期望、平均壽命和世代時間輪蟲顯著縮短(表1)。

表1不同藻密度和布洛芬濃度下萼花臂尾輪蟲的生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

Table1LifetabledemographicparametersofBrachionuscalyciflorusexposedtodifferentconcentrationsofibuprofenatthreealgaldensities

藻密度Algal density/(×106個細(xì)胞/mL)布洛芬濃度Ibuprofen concen./(μg/L)生命期望Life expectancy at hatching /h平均壽命Average lifespan /h世代時間Generation time/h凈生殖率Net reproduction rate /(offspring/female/life)內(nèi)稟增長率Intrinsic rate of population increase/h后代混交率Proportion of sexual offspring1.0083.2±2.171.2±2.157.4±0.78.9±1.10.0377±0.00210.058±0.0021.088.8±1.276.8±1.261.7±3.112.1±0.4?0.0406±0.00170.084±0.00410.075.6±3.263.6±3.255.8±1.510.8±0.40.0427±0.00080.122±0.005?100.065.6±3.8?53.6±3.8?47.9±2.6?8.3±0.90.0444±0.00360.130±0.015?1000.070.0±2.8?58.0±2.8?53.8±1.29.6±0.00.0420±0.00090.116±0.011?5000.070.8±1.2?58.8±1.2?56.6±3.38.9±0.90.0389±0.00430.132±0.011?2.0085.6±1.473.6±1.460.8±2.612.3±1.80.0409±0.00070.107±0.0041.086.4±3.074.4±3.058.5±1.914.4±0.70.0456±0.0012?0.153±0.016?10.072.8±1.1?60.8±1.1?55.8±1.212.0±0.30.0445±0.0012?0.098±0.011100.072.0±2.5?60.0±2.5?55.5±3.011.7±1.30.0440±0.00100.113±0.0031000.068.0±0.4?56.0±0.4?51.9±1.2?11.0±0.20.0462±0.0013?0.139±0.009?5000.064.8±2.1?52.8±2.1?51.2±1.0?11.0±0.10.0469±0.0011?0.101±0.0114.0085.2±2.573.2±2.557.8±2.215.6±2.60.0469±0.00230.115±0.0071.078.0±5.466.0±5.454.1±1.714.4±1.00.0493±0.00040.099±0.03210.075.2±2.1?63.2±2.1?53.1±0.3?14.1±0.80.0498±0.00110.107±0.020100.070.8±1.4?58.8±1.4?50.4±0.3?14.2±0.50.0526±0.00060.105±0.0141000.074.0±0.8?62.0±0.8?51.6±0.1?16.0±0.70.0537±0.00100.089±0.0095000.060.4±0.8?48.4±0.8?49.4±2.3?10.7±0.60.0481±0.00340.092±0.033

* 表示與同一食物密度下的對照組相比有顯著性差異

雙因素方差分析結(jié)果表明,藻密度對輪蟲的世代時間、凈生殖率和種群內(nèi)稟增長率有顯著性影響(P<0.05),布洛芬濃度對輪蟲的生命期望、平均壽命、世代時間、凈生殖率和種群內(nèi)稟增長率有顯著性影響(P<0.05),藻密度和布洛芬濃度的交互作用對輪蟲的生命期望、平均壽命和后代混交率有顯著性影響(P<0.05)(表2)。3個藻密度間,輪蟲的世代時間在1.0×106個細(xì)胞/mL的藻密度下顯著長于4.0×106個細(xì)胞/mL下,凈生殖率和種群內(nèi)稟增長率均隨著藻密度的升高而升高。各布洛芬濃度和對照組之間,100—5000 μg/L的布洛芬顯著縮短了輪蟲的生命期望、平均壽命和世代時間,5000 μg/L的布洛芬顯著降低了輪蟲的凈生殖率,1—1000 μg/L的布洛芬顯著降低了輪蟲的種群內(nèi)稟增長率。

表2藻密度和布洛芬濃度對萼花臂尾輪蟲生命表統(tǒng)計參數(shù)的影響(雙因素方差分析)

Table2EffectsofalgaldensityandibuprofenconcentrationonlifetabledemographicparametersofBrachionuscalyciflorus(Two-way ANOVA)

參數(shù)Parameter差異源Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareFP生命期望食物密度(A)27.25213.630.77P>0.05Life expectancy 布洛芬濃度(B)2922.455584.4933.06P<0.01at hatchingA×B478.351047.842.71P<0.05誤差636.483617.68平均壽命食物密度(A)27.25213.630.77P>0.05Average布洛芬濃度(B)2922.455584.4933.06P<0.01lifespanA×B478.351047.842.71P<0.05誤差636.483617.68世代時間食物密度(A)97.40248.704.33P<0.05Generation time布洛芬濃度(B)445.24589.057.91P<0.01A×B209.131020.911.86P>0.05誤差405.113611.25凈生殖率食物密度(A)172.21286.1028.30P<0.01Net布洛芬濃度(B)59.02511.813.88P<0.01reproductionA×B49.19104.921.62P>0.05rate誤差109.52363.04內(nèi)稟增長率食物密度(A)0.0020.0033.17P<0.01Intrinsic rate of布洛芬濃度(B)0.0053.51×10-53.16P<0.05populationA×B8.65×10-5108.65×10-60.78P>0.05increase誤差0.00361.11×10-5后代混交率食物密度(A)0.00320.0012.074P>0.05 Proportion of布洛芬濃度(B)0.00350.0010.927P>0.05sexualA×B0.019100.0022.907P<0.01offspring誤差0.024360.001

2.3 不同藻密度下輪蟲生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)與布洛芬濃度間的關(guān)系

回歸分析結(jié)果顯示,在實驗設(shè)置的布洛芬濃度范圍內(nèi),在2.0×106個細(xì)胞/mL藻密度下,輪蟲的生命期望、平均壽命和世代時間與布洛芬濃度之間均具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。4.0×106個細(xì)胞/mL藻密度下,輪蟲的生命期望、平均壽命和凈生殖率與布洛芬濃度之間均具有顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)(表3)。

表3各藻密度下萼花臂尾輪蟲的生命期望、平均壽命、世代時間和凈生殖率與布洛芬濃度間的關(guān)系

Table3Therelationshipsbetweenlifeexpectancyathatching,averagelifespan,generationtimeaswellasnetreproductionrateofBrachionuscalyciflorusculturedatthreealgaldensitiesandibuprofenconcentration

藻密度(個細(xì)胞/mL)Algal density參數(shù)Parameters回歸方程Regressive equation顯著性差異Significant test2.0×106 生命期望y=2.419×10-6x2-0.015x+79.818R2=0.536, P<0.01平均壽命y=2.419×10-6x2-0.015x+67.818R2=0.536, P<0.01世代時間y=1.229×10-6x2-0.007x+57.941R2=0.462, P<0.054.0×106生命期望y=2.483×10-7x2-0.005x+77.624R2=0.551, P<0.01平均壽命y=2.483×10-7x2-0.005x+65.624R2=0.551, P<0.01凈生殖率y= -5.434×10-7x2+0.002x+14.530R2=0.439, P<0.05

3 討論

3.1 布洛芬濃度和藻密度對浮游動物存活和生殖的影響

已有研究結(jié)果表明,較高濃度的布洛芬對枝角類和輪蟲的存活產(chǎn)生不利的影響。如80.0 mg/L的布洛芬使大型溞(D.magna)的存活率顯著降低,100.0 mg/L的布洛芬使大型溞無法存活[9,12]；12.5 mg/L的布洛芬使萼花臂尾輪蟲的平均壽命顯著縮短,25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾輪蟲(B.havanaensis)的平均壽命顯著縮短[14]。本研究結(jié)果也表明,較高濃度的布洛芬使萼花臂尾輪蟲的生命期望和平均壽命顯著縮短,藻密度由1.0×106個細(xì)胞/mL升高至2.0×106個細(xì)胞/mL和4.0×106個細(xì)胞/mL使布洛芬對輪蟲存活的最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)降低(由100 μg/L降低至10 μg/L)。

較高濃度的布洛芬對枝角類和輪蟲的生殖也具有不利的影響。如50.0 mg/L的布洛芬使多刺裸腹溞(M.macrocopa)的凈生殖率顯著降低[12],25.0 mg/L的布洛芬使萼花臂尾輪蟲的凈生殖率顯著降低,6.25—25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾輪蟲的凈生殖率顯著降低[14]。與上述結(jié)果不同的是,本研究所測試的大多數(shù)濃度的布洛芬對輪蟲的凈生殖率均無顯著的影響,這可能與所測試的布洛芬最高濃度(5000 μg/L)較低有關(guān)。此外,當(dāng)斜生柵藻密度為1.0×106個細(xì)胞/mL時,1.0 μg/L的布洛芬使輪蟲的凈生殖率顯著高于對照組。究其原因,可能與布洛芬具有雌激素活性[12]有關(guān)。一些已被證明具有環(huán)境雌激素效應(yīng)的、較低濃度的污染物也可以促進輪蟲的生殖,如20—320 μg/L的艾氏劑、0.5—50.0 μg/L的十氯丹和100—900 μg/L的Zn2+顯著提高了萼花臂尾輪蟲的凈生殖率[24, 27- 28]。

3.2 藻密度和布洛芬濃度對浮游動物種群增長影響

有研究發(fā)現(xiàn),50.0 μg/L的布洛芬使大型溞的種群增長率顯著降低[12- 13],12.5—25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾輪蟲的種群增長率顯著降低[14],但0.0125 mg/mL的氯霉素、0.2500 mg/mL和0.5000 mg/mL的鹽酸氟哌酸均顯著地促進褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)的種群增長[29],6.25 μg/mL的紅霉素和氯霉素均顯著地促進萼花臂尾輪蟲的種群增長[30]。當(dāng)藻密度為2.0×106個細(xì)胞/mL時,除了0.3 mg/L外,其他濃度的 Zn2+顯著提高了萼花臂尾輪蟲的種群內(nèi)稟增長率；當(dāng)藻密度為 4.0×106個細(xì)胞/mL時,0.1、0.3 mg/L和0.7 mg/L的Zn2+顯著提高了萼花臂尾輪蟲的種群內(nèi)稟增長率[24]。當(dāng)藻密度為2.0×106個細(xì)胞/mL和4.0×106個細(xì)胞/mL時,各濃度的利福平均顯著提高了萼花臂尾輪蟲的種群內(nèi)稟增長率[23]。本研究所測試的布洛芬濃度均對萼花臂尾輪蟲的種群增長具有促進作用,促進作用的顯著性與否取決于藻類食物密度。當(dāng)藻密度為1.0×106個細(xì)胞/mL和4.0×106個細(xì)胞/mL時,布洛芬濃度對輪蟲的種群增長率均無顯著性影響；但當(dāng)藻密度為2.0×106個細(xì)胞/mL時,1、10、1000 μg/L和5000 μg/L的布洛芬顯著提高了輪蟲的種群內(nèi)稟增長率。一定濃度的布洛芬等水體污染物對輪蟲種群增長的促進作用,可能與其所具有的雌激素效應(yīng)有關(guān)。

3.3 藻密度和布洛芬濃度對輪蟲有性生殖的影響

混交雌體的產(chǎn)生是輪蟲有性生殖的開始,對輪蟲產(chǎn)生休眠卵以適應(yīng)不利的環(huán)境條件具有重要的意義。已有的研究表明,一定濃度的、具有雌激素活性的水體污染物,如500 μg/L的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、50 μg/L和500 μg/L的鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)以及500 μg/L的鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)使萼花臂尾輪蟲的后代混交率顯著升高[31]；各藻密度下,各濃度的利福平都使萼花臂尾輪蟲的后代混交率顯著升高[23]。本研究結(jié)果表明,布洛芬對輪蟲后代混交率的顯著促進作用取決于藻類食物密度。當(dāng)藻密度為1.0×106個細(xì)胞/mL時,10—5000 μg/L的布洛芬顯著提高了輪蟲的后代混交率；隨著藻密度的升高,布洛芬對輪蟲后代混交率的顯著促進作用逐漸消失。

3.4 輪蟲各生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)對污染物的敏感性

輪蟲各生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)對污染物的敏感性常因污染物種類的不同而異。儲昭霞[32]、Rao和Sarma[21]、Xi和Hu[33]均發(fā)現(xiàn),輪蟲種群內(nèi)稟增長率是低濃度水體污染物毒性檢測的一個很敏感指標(biāo)；Ferrando等[34]發(fā)現(xiàn)凈生殖率和種群增長率是比世代時間和生命期望更敏感的指標(biāo)；Janssen等[35]、徐曉平等[36]和Araujo等[37]發(fā)現(xiàn)種群內(nèi)稟增長率并不總是最敏感的指標(biāo),凈生殖率有時具有更低的LOEC值；翟盼等[23]發(fā)現(xiàn)各藻密度下,輪蟲后代混交率是最敏感的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,輪蟲生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)對布洛芬污染的敏感性與藻密度有關(guān)。在較低的藻密度(1.0×106個細(xì)胞/mL)下,輪蟲的凈生殖率最敏感；在中等藻密度(2.0×106個細(xì)胞/mL)下,輪蟲的種群內(nèi)稟增長率和后代混交率較敏感；而在較高的藻密度(4.0×106個細(xì)胞/mL)下,輪蟲的生命期望、平均壽命和世代時間較敏感。