李 靖 廖梅杰 李 彬 王印庚 榮小軍 張 正 范瑞用 劉安然

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；4.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司 青島 266400)

刺參(Apostichopus japonicus)，又名仿刺參，在中國主要分布于山東半島和遼東半島沿海，是中國北方地區(qū)重要的海珍品之一，具有很高的藥用與營養(yǎng)價值(Bordbaret al,2011)。隨著刺參集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各種傳染性疾病也頻頻發(fā)生，如耳狀幼體時期的爛邊病、爛胃病，稚參時期的化板癥、腸炎病和腐皮綜合征等(王印庚等,2012、2013; 張文澤等,2015; 逄慧娟等,2017)，給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

感染微生態(tài)學認為，細菌性疾病的發(fā)生與體內(nèi)菌群失調(diào)密切相關。解析刺參早期發(fā)育時期體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境菌群相關性對其健康養(yǎng)殖具有重要意義。近年來，對于刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究已成為熱點，腸道內(nèi)的細菌群落組成直接受到刺參棲息環(huán)境中的菌群變化影響(李彬等,2012)，且與疾病發(fā)生密切相關。現(xiàn)已對刺參腸道、腸含物及養(yǎng)殖環(huán)境(水、底泥、附著基)菌群(Gaoet al,2014a,b; Zhanget al,2013;李彬等,2016)，以及不同季節(jié)、養(yǎng)殖時期和鹽度下刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)開展了相關研究(關曉燕等,2011; 李建光等,2014; 李彬等,2012; 王姣姣等,2015a,b)，而關于刺參早期發(fā)育各階段體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的研究未見報道。刺參早期發(fā)育過程包括受精卵、囊胚期、原腸期、耳狀幼體、樽形幼體、五觸手幼體和稚參幾個時期。其中，耳狀幼體攝食單胞藻等餌料，樽形幼體不攝食，五觸手幼體和稚參之后階段屬沉積性食性。解析其腸道菌群的發(fā)生、發(fā)展以及變化，將為建立糾正腸道菌群失調(diào)、增強機體體質(zhì)、提高抗病力的微生態(tài)學方法提供理論依據(jù)。本研究以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對養(yǎng)殖刺參早期發(fā)育各階段幼體體內(nèi)及環(huán)境(投入餌料及培育用水)菌群的組成與結(jié)構(gòu)開展研究，對分離的優(yōu)勢細菌進行分子鑒定，在此基礎上，進行了刺參幼體體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)相關性分析，以期為解析刺參消化道菌群的形成過程和演替規(guī)律以及養(yǎng)殖用益生菌的篩選與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 早期發(fā)育階段養(yǎng)殖刺參樣品的采集及處理

2017年3～10月，在山東青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司采集樣品。親參為升溫促熟的成熟刺參，育苗用水為砂濾海水。分別采集發(fā)育成熟的雌性性腺(CX)、雄性性腺(XX)以及未受精卵(L)、受精卵(SJL)、原腸胚(YC)、耳狀幼體(EZ)、樽形幼體(ZX)和附著后1月齡(ZS5)、2月齡(ZS6)、4月齡(ZS8)、6月齡(ZS10)時期的稚參，同時，采集同期培育池進水口水樣(W)與餌料(EL)。

1.1.1 刺參幼體腸道的采樣及處理 鑒于浮游期無法區(qū)分腸道，故這幾個發(fā)育期的幼體經(jīng)250目滅菌篩絹收集后，用滅菌3% NaCl溶液反復沖洗數(shù)次，對幼體計數(shù)后，研磨、勻漿、梯度稀釋，然后涂布于含1.5% NaCl的TSA和TCBS瓊脂培養(yǎng)基，每梯度3個平行。對于稚參時期后的樣本，采樣方法為停食12 h，空胃后解剖摘取稚參腸道，用滅菌3% NaCl溶液沖洗腸道。對采集的腸道稱重后研磨、勻漿、梯度稀釋，然后涂布TSA和TCBS瓊脂培養(yǎng)基，每梯度3個平行。涂布后的平板在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)TSA和TCBS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計算各樣品中的可培養(yǎng)細菌總數(shù)和可培養(yǎng)弧菌(Vibrio)總數(shù)。

1.1.2 培育用水與餌料的采樣及處理 分別收集各幼體發(fā)育時期培育用進水口水樣和所投喂餌料樣本。初耳幼體時期的餌料主要為代用餌料(海洋紅酵母、干酵母等)與螺旋藻混合而成，大耳幼體向樽形幼體轉(zhuǎn)變時期的餌料又添加了EM菌、食母生片，稚參時期的餌料主要為基礎配合飼料[原料為馬尾藻(Scagassum)、海帶(Laminaria japonica)、扇貝邊]與新鮮海泥混合而成。培養(yǎng)及計數(shù)方法同1.1.1，計算各樣本中的可培養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)。

1.2 菌株的分離、純化與保藏

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小等特征，對不同時期幼體、培育用水和餌料樣本TSA培養(yǎng)基獲得的可培養(yǎng)細菌進行分類和優(yōu)勢度統(tǒng)計，對優(yōu)勢菌進行分離、純化并保種。

1.3 細菌16SrDNA序列測定

采用熱裂解法制備細菌DNA，采用16S rDNA序列進行細菌鑒定，所用引物：27F 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，1492R 5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3。反應體系及擴增條件采用史秀清等(2015)方法。擴增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結(jié)果采用Contigexpress軟件拼接后與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，選出相似性最高、分類地位清楚的標準菌株，對各樣品中的菌株進行匯總及分類分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

菌落計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果采用SPSS 17.0軟件，用單因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's多重比較進行差異顯著性檢驗，結(jié)果用平均值±標準差(Mean±SD)表示，P＜0.05為差異性顯著。根據(jù)16S rDNA鑒定結(jié)果，統(tǒng)計各菌株在刺參幼體不同時期、不同樣本的分布情況，基于屬的分類水平利用R語言軟件包對各樣本相關性進行主成分分析(PCA分析)。

2 結(jié)果

2.1 幼體不同發(fā)育期體內(nèi)及環(huán)境可培養(yǎng)細菌的定量分析

以TSA培養(yǎng)獲得的菌落數(shù)對各樣本可培養(yǎng)細菌的定量分析結(jié)果見表1。從表1可以看出，在幼體開口前的各發(fā)育時期(性腺、未受精卵、受精卵、原腸胚)所采集的樣本均未培養(yǎng)出可培養(yǎng)細菌；當胚胎發(fā)育到耳狀幼體以后，開始投喂餌料，此后的耳狀幼體、樽形幼體體內(nèi)可分離獲得可培養(yǎng)細菌，但數(shù)量級較 低，為101CFU/ind.；至幼體發(fā)育到稚參以后，消化道可培養(yǎng)細菌總數(shù)急劇增加，數(shù)量級為105～108CFU/g，并在4月齡時達到最大數(shù)量級(108CFU/g)。整個育苗期用水中可培養(yǎng)細菌數(shù)量級較低，且維持在一個相對穩(wěn)定的水平，為102CFU/ml；鑒于不同發(fā)育期餌料種類不同，各發(fā)育時期投喂的餌料中可培養(yǎng)細菌數(shù)量差異顯著，數(shù)量級為103～107CFU/ml。

以TCBS瓊脂平板培養(yǎng)獲得的菌落數(shù)對各樣本可培養(yǎng)弧菌的定量分析結(jié)果見表2。從表2可以看出，在幼體開口前的各發(fā)育時期（性腺、未受精卵、受精卵、原腸胚)及投餌后的耳狀幼體、樽形幼體時期均未獲得可培養(yǎng)弧菌；至幼體發(fā)育到稚參以后，消化道可培養(yǎng)弧菌急劇增加，數(shù)量級為104～107CFU/g，并在4月齡時達到最高。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中，雖然，整個育苗期用水中可培養(yǎng)弧菌數(shù)量級變化不明顯，且維持在一個相對穩(wěn)定的水平(102CFU/ml)，但可培養(yǎng)弧菌占可培養(yǎng)細菌的比例波動較大，幅度為14.0%～97.3%；各發(fā)育時期所投喂的餌料中，可培養(yǎng)弧菌數(shù)量差異顯著，除了1～2月齡稚參時期中可培養(yǎng)弧菌數(shù)量級達到106～107CFU/ml，且可培養(yǎng)弧菌占可培養(yǎng)細菌的比例分別為75.7%和83.7%外，其他餌料中均未檢測到弧菌。

表1 不同發(fā)育時期刺參幼體體內(nèi)及養(yǎng)殖系統(tǒng)中可培養(yǎng)細菌總數(shù)(對數(shù)值) Tab.1 The total number(Logarithm) of culturable bacteria in gastrointestinal tract of sea cucumber larva at different developmental stages and its aquaculture system

表2 不同發(fā)育時期刺參幼體體內(nèi)及養(yǎng)殖系統(tǒng)中可培養(yǎng)弧菌數(shù)量(對數(shù)值)及占比Tab.2 The number(Logarithm) and proportion of culturable Vibrios in gastrointestinal tract of sea cucumber larva at different developmental stages and its aquaculture system

2.2 不同發(fā)育期消化道及養(yǎng)殖系統(tǒng)(培育用水、餌料)可培養(yǎng)優(yōu)勢菌的分離及鑒定結(jié)果

根據(jù)各時期不同樣品中TSA上所培養(yǎng)細菌的菌落形態(tài)，共獲得優(yōu)勢細菌65株，其中，幼體、培育用水、餌料中的菌株數(shù)量分別為27株、18株和20株。將獲得的16S rDNA測序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中標準菌株的16S rDNA序列進行同源性比對分析的鑒定結(jié)果見表3和表4。從表3和表4可以看出，65株細菌共鑒定到3門4綱14屬43種，分屬于放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria) 3個門，放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria) 4個綱，優(yōu)勢屬包括弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus) 等，其中，弧菌屬種類最多，為18種。

從不同發(fā)育期刺參消化道內(nèi)優(yōu)勢菌鑒定結(jié)果可以看出，耳狀幼體期，幼體體內(nèi)分離出4株優(yōu)勢菌，優(yōu)勢度最高的為海水嗜冷桿菌(Psychrobacter aquimaris)，優(yōu)勢度占60.0%；樽形幼體時期，幼體體內(nèi)菌種多樣性很高(10株，6個屬)，各菌株的優(yōu)勢度為2.2%～36.2%，優(yōu)勢度最高的屬為鹽單胞菌屬(Holomonas)，占47.2%；發(fā)育到稚參以后，1、2、4和6月齡時期，稚參消化道中的優(yōu)勢菌株分別為5株、5株、2株和1株，但鑒定后集中到弧菌屬、芽孢桿菌屬和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)，6月齡時，稚參消化道中的優(yōu)勢屬僅有芽孢桿菌屬。由此可以看出，隨著幼體的發(fā)育，幼體時期體內(nèi)的菌群多樣性較高，而發(fā)育到稚參以后，其腸道菌群相對穩(wěn)定。

從各發(fā)育期培育用水分離的優(yōu)勢菌可以看出，盡管培育用水中可培養(yǎng)細菌總數(shù)較低，但水樣中細菌的種類卻很豐富，在耳狀幼體、樽形幼體、1、2、4和6月齡稚參培育期水樣中的優(yōu)勢菌株分別為2株、5株、3株、4株、1株和3株。根據(jù)鑒定結(jié)果可以看出，水樣中弧菌種類所占優(yōu)勢度較高，為22.3%～52.1%。

從同期培育所用餌料中分離得到的優(yōu)勢菌鑒定結(jié)果可以看出，由于不同發(fā)育期所使用的餌料種類不同，各時期細菌種類和豐度差異顯著，在耳狀幼體時期所用餌料共分離出5株優(yōu)勢菌，其中，大西洋弧菌(Vibrio atlanticus)豐度最高，達到76.0%；樽形幼體時期所用餌料僅分離出1株優(yōu)勢菌，為特基拉芽胞桿菌(Bacillus tequilensis)，優(yōu)勢度達到85.4%；幼體發(fā)育到底棲生活的稚參以后，其優(yōu)勢細菌種類較為豐富，在1、2、4和6月齡稚參培育期，餌料中的優(yōu)勢菌種類分別為4株、6株、1株和3株，餌料中以芽孢桿菌(Bacillussp.)和弧菌為主要種類，優(yōu)勢度分別為8.0%～100.0%和6.8%～ 80.0%。

2.3 不同發(fā)育期幼體體內(nèi)菌群與環(huán)境菌群相關性分析

對比不同發(fā)育期幼體、培育用水和餌料的優(yōu)勢細菌組成可以看出，從時間軸來看，鹽單胞菌(Halomonas alkaliantarctica)成為耳狀幼體、樽形幼體共有優(yōu)勢菌；2～4月齡時，強壯弧菌(Vibrio fortis)是其消化道的共有優(yōu)勢菌；從養(yǎng)殖系統(tǒng)這一空間軸來看，在耳狀幼體和樽形幼體時期，幼體、水和餌料中無共有優(yōu)勢菌；1月齡時，餌料、水中的大西洋弧菌、需納弧菌(Vibrio natriegens)在幼體中完成了較好的定植，其次是餌料中的特基拉芽胞桿菌；2月齡時，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是消化道和餌料中的共同優(yōu)勢菌；6月齡時，來自餌料、水中的暹羅芽胞桿菌(Bacillus siamensis)在消化道內(nèi)完成了較好的定植 。 相應結(jié)果顯示，在幼體發(fā)育到營底棲生活以后，其體內(nèi)的菌株與餌料中的優(yōu)勢菌株具有較好的相關性。

鑒于16S rDNA鑒定結(jié)果在屬水平上的準確性高，從屬水平上分析相應菌株的分類地位及在整個培育時期養(yǎng)殖系統(tǒng)的分布結(jié)果見表4。從表4可以看出，檢出率較高的屬為弧菌屬(41.9%)、芽孢桿菌屬(9.3%)、假交替單胞菌屬(9.3%)、鹽單胞菌屬(9.3%)。對比幼體、培育用水和餌料中各細菌屬水平上的分布可以看出，芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬和弧菌屬是在3個系統(tǒng)中同時檢出的菌屬，嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)是在幼體及水中共檢出的菌。進一步對比，共檢出菌在系統(tǒng)中的分布可以看出，在幼體發(fā)育早期(樽形時期)幼體與水中的共有菌較多，而發(fā)育到底棲生活(1、2、4和6月齡)時期，幼體中與餌料中的共有菌較多。

在屬的水平進行各樣本相關性的主成分分析(P r incipal Component Analysis,PCA) 結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，第1主成分PC1對樣品差異的貢獻值為69.6%，第2主成分PC2對樣品差異的貢獻值為18%。根據(jù)不同發(fā)育期各樣本所處的位置可以看出，第2主成分對浮游期(耳狀幼體和樽形幼體)和底棲生活期(1、2、4月齡)差異貢獻較大，而發(fā)育到6月齡時，第1主成分則對樣品差異貢獻顯著。根據(jù)相同時期幼體與水和餌料所處的位置可以看出，浮游幼體時期，幼體菌群與培育用水菌群和餌料菌群相距較遠，表明二者對幼體菌群影響均不大；隨著幼體的發(fā)育，當幼體發(fā)育到1月齡后，幼體菌群與培育用水菌群相距小于其與餌料菌群的距離，表明水對幼體菌群 影響較大，當發(fā)育到6月齡時，其幼體體內(nèi)腸道菌群與餌料距離最近，表明受餌料影響較大。

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表4 不同發(fā)育時期刺參幼體體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境可培養(yǎng)優(yōu)勢菌系統(tǒng)分類Tab.4 Classification of culturable dominant bacteria in gastrointestinal tract of sea cucumber at different developmental stages and its aquaculture system

3 討論

腸道菌群作為腸道的重要組成部分，與宿主以及所處的環(huán)境存在相互依賴和相互制約的關系，不僅影響著食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，還在宿主免疫反應中發(fā)揮重要作用(Schrijveret al,2000; Zhaoet al,2012)。以刺參早期發(fā)育期體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)為研究對象， 解析體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)演替和變化規(guī)律以及其與環(huán)境菌群的相關性，將為刺參苗種的健康管理提供理論基礎。 本研究通過傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)方法結(jié)合優(yōu)勢菌鑒定，對養(yǎng)殖刺參早期發(fā)育各時期幼體體內(nèi)可培養(yǎng)細菌進行了定量分析。在幼體開口攝食前，體內(nèi)沒有培養(yǎng)出可培養(yǎng)細菌；開口并攝食后，從浮游時期發(fā)育到底棲生活，其體內(nèi)的可培養(yǎng)細菌總數(shù)急劇增加，表明腸道細菌是隨著攝食行為的進行而使特定菌株在腸道內(nèi)逐步定植的過程。通過TCBS弧菌選擇性培養(yǎng)基對幼體體內(nèi)弧菌數(shù)量進行測定，表明自刺參發(fā)育到營底棲生活后，弧菌開始檢出，且一直是占據(jù)體內(nèi)菌群的優(yōu)勢菌屬。史秀清等(2015)對大菱鲆(Scophthalmus maximus)仔稚魚發(fā)育期消化道可培養(yǎng)細菌的菌群特征進行分析發(fā)現(xiàn)，消化道中的細菌數(shù)量逐漸增加，且弧菌已成為仔稚魚后期消化道中的優(yōu)勢菌群。Zhao等(2012)對雜色鮑(Haliotis diversicolor)不同發(fā)育階段幼體消化道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，幼體開始攝食后的消化道細菌數(shù)量要比未攝食時高，弧菌屬的細菌成為之后3個發(fā)育階段中消化道的優(yōu)勢菌。Verner-Jeffreys等(2003)研究了3個不同孵化場的大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)仔稚魚消化道菌群演替時發(fā)現(xiàn)，在仔稚魚開口攝食后，消化道菌群的數(shù)量呈穩(wěn)定增長；隨著仔稚魚的生長，弧菌屬細菌逐漸取代假交替單胞菌屬細菌成為消化道中的優(yōu)勢菌種。這些研究均表明，水產(chǎn)動物腸道菌群的形成是動物攝食餌料后，對餌料中特定菌株的選擇性定植和擴增的過程，弧菌作為海洋細菌的重要種類，也在海水養(yǎng)殖動物腸道菌群中占有重要地位。

圖1 不同發(fā)育時期刺參幼體體內(nèi)菌群與 環(huán)境菌群差異的主成分分析 Fig.1 PCA of the samples among the gastrointestinal tract of sea cucumber at different developmental stages and its aquaculture system

根據(jù)各優(yōu)勢菌株分類鑒定結(jié)果可以看出，早期發(fā)育階段耳狀幼體(含4屬)、樽形幼體(含6屬)的消化道菌群多樣性較高，1～6月齡稚參的消化道菌群趨于單一，僅含弧菌屬和芽孢桿菌屬2個屬，推測刺參消化系統(tǒng)在幼體發(fā)育完全后，才對定植的細菌具有較強的選擇性，且其消化道對弧菌屬和芽孢桿菌屬細菌的選擇性更強，與本研究結(jié)果相似。Grisez等(1997)對金頭鯛(Sparus aurata)和歐洲舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)的研究結(jié)果推測，消化系統(tǒng)在稚魚和成魚發(fā)育完全后，才對弧菌屬細菌具有選擇性。

本研究從分離優(yōu)勢菌的屬水平、種水平并利用PCA方法，分析了刺參早期發(fā)育階段幼體體內(nèi)菌群與養(yǎng)殖系統(tǒng)中培育用水和餌料菌群的相關性。結(jié)果表明，在幼體發(fā)育初期，其體內(nèi)菌群與培育用水的相關性較大，而隨著幼體發(fā)育的進行，其體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與餌料的相關性逐漸增加。Verner-Jeffreys等(2003)研究表明，大西洋庸鰈仔稚魚開口攝食后，其消化道內(nèi)菌群存在明顯演替現(xiàn)象，優(yōu)勢菌屬由未開口的卵黃囊階段時，假交替單胞菌屬變?yōu)橐誀N爛弧菌(Vibrio splendidus)、溶藻弧菌的弧菌屬，且餌料中僅有一部分細菌能夠定植于仔魚的消化道。史秀清等(2015)對大菱鲆仔稚魚發(fā)育期消化道的可培養(yǎng)細菌菌群進行分析發(fā)現(xiàn)，生物餌料中的細菌對仔稚魚消化道中可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生的影響相對較大，而水中的細菌似乎沒有對仔稚魚的消化道菌群產(chǎn)生影響。Sugita等(2002)對牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚魚消化道細菌的種類和數(shù)量的研究也發(fā)現(xiàn)，消化道菌群會隨投喂不同餌料而變化，受水體中菌群的影響較小。但也有學者認為,水中的微生物菌群對水生動物消化道菌群影響顯著，Tanasomwang等(1989)研究牙鲆仔稚魚時發(fā)現(xiàn)，水中的菌群組成會明顯影響仔稚魚的消化道菌群組成。周金敏等(2010)對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)腸道和養(yǎng)殖水體中的微生物菌群進行研究時發(fā)現(xiàn)，黃顙魚腸道與養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢菌基本相同，均為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌。本研究表明，刺參幼體發(fā)育過程中，體內(nèi)的細菌菌群經(jīng)歷了由培育用水到發(fā)育后期與餌料密切相關的過程，可見養(yǎng)殖環(huán)境中水和餌料對體內(nèi)菌群的建立和演替均起到重要作用。