周華興 胡玉婷 段國慶 凌 俊 江 河 潘庭雙

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 合肥 230031)

新安江源于黃山南麓，流域上游多為山間溪流，地勢復(fù)雜，水流湍急。下游東入浙江省西部，經(jīng)淳安至建德與蘭江匯合后為錢塘江。溫州光唇魚(Acrossocheilus wenchowensis)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、光唇魚屬(Acrossocheilus)(Nelsonet al,2016)，是新安江流域中上游棲息的淡水型魚類，在浙江、廣東、福建境內(nèi)也有分布。因其成魚常棲息于石縫間，體側(cè)具有多條鮮艷的黑色橫斑而被地方稱為“石斑魚”。由于溫州光唇魚肉質(zhì)細嫩、體色鮮艷，具有較高的食用和觀賞價值，深受消費者的青睞(冀德偉等,2009)。近年來，受水質(zhì)污染、棲息地破壞、過度捕撈等人類活動的影響，新安江流域溫州光唇魚的野生資源急劇減少，其分布范圍日益減縮，資源數(shù)量逐漸下降，個體規(guī)格也越來越小(胡玉婷等,2017)。因此，開展新安江流域溫州光唇魚群體遺傳結(jié)構(gòu)研究和保育工作已迫在眉睫。

由于具有高突變率、低重組率及嚴格的母系遺傳等特征，線粒體基因序列一直是群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究中的理想標記(Cannet al,1987)。馬春艷等(2009)采用線粒體細胞色素b基因(Cytb)對鯧屬3種魚類系統(tǒng)進 化關(guān)系進行分析，提出銀鯧(Pampus argenteus)是3種鯧屬魚類中較早分化出的種，而刺鯧(Psenopsis anomala)則是鯧屬魚類的原始類群的觀點。李大命等(2017)利用線粒體Cytb和細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因作為分子標記，分析洪澤湖大銀魚(Protosalanx hyalocranius) 40個個體的序列多態(tài)性，提出該群體可能經(jīng)歷種群擴張事件，且單倍型未出現(xiàn)遺傳分化。張爭世等(2017)基于線粒體Cytb基因探討齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，長江上游4個齊口裂腹魚野生群體未經(jīng)歷過種群擴張，且群體間和群體內(nèi)存在顯著的遺傳分化。

本研究采用線粒體Cytb基因，探討新安江流域 的6個不同溫州光唇魚地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)，并重建其群體進化歷史，以期為該類魚種的保育和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗所用的溫州光唇魚樣本于2016年10月～ 2017年8月采集自新安江流域。6個自然群體分別采自畢村(BC)、杞梓里(QZL)、南塘(NT)、上豐(SF)、北岸(BA)、朱家坑(ZJK)，共170個個體(表1，圖1)。樣本采集后做好標記，保存于95%的酒精中固定。

表1 溫州光唇魚樣本采集信息 Tab.1 Sampling information of A.wenchowensis

圖1 溫州光唇魚6個群體樣本采集點 Fig.1 Sampling sites of 6 populations of A.wenchowensis

1.2 基因組DNA提取

取樣本背部肌肉組織，采用Sambrook法提取基因組DNA(Sambrooket al,1989)。

1.3 PCR擴增及測序

Cytb基因的擴增和測序引物為H15915(5′-CTC CGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)和L14724(5′-GAC TTGAAAAACCACCGTTG-3′)(Xiaoet al,2001)。

PCR反應(yīng)體系：200 ng的模板DNA，10×Buffer緩沖液(TaKaRa) 5 μl，dNTP(2.5 mmol/L) 3 μl，MgCl2(2.5 mol/L) 4 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2 μl，TaqDNA聚合酶0.75 U，補充無菌超純水至50 μl。

PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程(上海)有限公司雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列通過Seqman軟件(Burland,2000)輔助人工進行拼接組裝，獲得完整的mtDNA Cytb基因。序列集通過MAFFT v.7(Katohet al,2013)在線比對，并輔以人工校正。采用DNAsp 5.0(Libradoet al,2009)計算多態(tài)位點、單倍型數(shù)目、錯配分布(Mismatch distribution)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,Pi)。使用Network 5繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。通過MrBayes3.1.2(Ronquistet al,2003)采用貝葉斯法(Bayesian inference,BI)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進化樹。使用MEGA 6(Tamuraet al,2013)(Kumara2-parameter)計算種群遺傳距離，并通過Arlequin 3.11(Excoffieret al,2005)計算種群遺傳分化指數(shù)(F-statistics,Fst)并進行分子變異分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)。使用Beast1.6軟件包(Drummondet al,2007)進行貝葉斯天際線(Bayesian skyline plot,BSP)分析，檢測種群變化的歷史動態(tài)?；诰垲悩涞耐負鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，使用RASP 3.0軟件(Yuet al,2015)重建溫州光唇魚祖先種群起源地，追溯其原種群。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征和遺傳多樣性分析

測序獲得的170條溫州光唇魚mtDNA Cytb序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為MH141624～ MH141793。經(jīng)過同源比對后，用于下游分析的基因片段全長1039 bp，共檢測到69個突變位點，突變率6.6%，包含簡約信息位點(Parsimony-informative sites) 31個，單突變位點(Singleton sites)38個。序列中A、T、G和C的平均含量分別為27.8%、27.3%、14.8%和30.1%，遵循A+T＞G+C的規(guī)律。編碼序列出現(xiàn)了明顯的反G偏倚(Anti-G bias)現(xiàn)象，尤其體現(xiàn)在第3位密碼子G的含量(7%)上。Saccone等(1999)認為這種偏倚現(xiàn)象與線粒體基因組的進化趨勢相關(guān)，物種由低等向高等進化過程中，反G偏倚會逐漸弱化，在鳥類和哺乳類動物線粒體中G的含量達到最高。

溫州光唇魚6個群體共170條序列定義了28個單倍型，其中，群體間共享單倍型9個，包含148個個體，占總樣本數(shù)的87.06%；特有單倍型19個，包含22個個體，占總樣本數(shù)的12.94%。

各群體的單倍型多樣性為0.308～0.876，核苷酸多樣性為0.00112～0.00838。其中，BC群體定義13條單倍型，單倍型多樣性最高；NT群體檢測到38個多態(tài)位點，核苷酸多樣性最高(表2)。

表2 溫州光唇魚6個群體遺傳多樣性參數(shù) Tab.2 Population genetic diversity of 6 populations of A.wenchowensis

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

單倍型系統(tǒng)發(fā)生分析選擇光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)(登錄號：KF781289)作為外群，構(gòu)建進化樹。如圖2所示，28個單倍型形成了4個支系，其中 HAP1、4、5、11、12、13、17、18、21、22聚為支系一，HAP6、7、9、15、16、19、20、27聚為支系二，HAP2、8、10、14、23、24、25、26、28聚為支系三，HAP3聚為支系四。

圖2 基于貝葉斯法構(gòu)建的28個單倍型系統(tǒng)進化樹 Fig.2 Phylogenetic tree for 28 haplotypes constructed based on BI method

采用中介網(wǎng)絡(luò)理論(Median joining,MJ)繪制的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中，28個單倍型也形成了4個支系。不同支系內(nèi)出現(xiàn)了多個主體單倍型(支系一為HAP1，支系二為HAP7，支系三為HAP2)，其他單倍型呈輻射狀環(huán)繞在主體單倍型周圍(圖3)。

將溫州光唇魚6個不同地理種群設(shè)定為同一組群，執(zhí)行AMOVA分析(表3)，估算種群間和種群內(nèi)個體間變異率。結(jié)果表明，新安江溫州光唇魚整體的變異主要來自于群體內(nèi)，變異比例為66.85%，而種群間的變異僅占33.15%。

圖3 基于中介網(wǎng)絡(luò)理論構(gòu)建的單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖 Fig.3 Haplotypes network based on MJ method

表3 溫州光唇魚6個群體分子變異分析 Tab.3 AMOVA of 6 populations of A.wenchowensis

不同群體間的Fst值見表4，溫州6個地理群體出現(xiàn)了不同程度的分化，其中，SF和ZJK兩個群體之間的分化程度最高(Fst=0.73281)，而BC和NT群體間未檢測到明顯分化(Fst=0.02389)。少數(shù)群體間存在著不同水平的基因流(Nm＞1)，6個群體間的平均基因流Nm=2.04。

表4 群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)和群體間有效 遷徙個體數(shù)(Nm) Tab.4 Pairwise values of Fst (below diagonal) and Nm(above diagonal) between populations

2.3 群體歷史動態(tài)

6個群體的中性檢驗顯示Tajima'sD和Fu'sFs為負值，其中Fu'sFs結(jié)果顯著(表5)?；谄谕党掷m(xù)增長模式下的錯配分布分析結(jié)果顯示，曲線呈現(xiàn)單峰泊松分布，且實際觀測結(jié)果與期望的假定模型吻合度較高(圖4)。因此，認為新安江溫州光唇魚群體可能經(jīng)過擴張或者仍處于持續(xù)增長狀態(tài)。

表5 溫州光唇魚群體中性檢驗和錯配分布參數(shù) Tab.5 Neutral test and mismatch distribution of nucleotide of A.wenchowensis populations

圖4 溫州光唇魚堿基錯配分布 Fig.4 Nucleotide mismatch distribution of A.wenchowensis

選擇GTR+Gamma替代模型，基于寬松分子鐘(Relaxed clock)理論構(gòu)建了貝葉斯天際線圖來模擬群體變化動態(tài)。BSP結(jié)果顯示(圖5)，新安江溫州光唇魚6個群體發(fā)生過擴張事件。由于未見溫州光唇魚mtDNA Cytb基因分子進化速率的報道，研究基于Gamma替代模型并輔以選擇壓估算校正，估算了溫州光唇魚mtDNA Cytb基因位點進化速率u為2.87～3.00/百萬年?？紤]到光唇魚屬于2齡性成熟魚類，將表5中的τ值代入公式τ=2ut，推算出新安江溫州光唇魚群體擴張時間約為335萬年前。

為了追溯該流域光唇魚群體的擴張歷史，重建其祖先群體的分布情況，本研究基于貝葉斯二進制法(Bayesian binary method,BBM)和分散-隔絕理論(Statistical dispersal-vicariance method,S-DIVA)，重新構(gòu)建了溫州光唇魚祖先群體分布地(圖6)。圖中上半?yún)^(qū)是新安江的地圖，按照采集到的群體分布，將該區(qū)域劃分成A～F六片區(qū)域，分別為A率水上游、B率水下游、C昌溪、D休寧河、E練江、F錦溪。下半?yún)^(qū)則是基于Fst值構(gòu)建的鄰接樹(Neighbor joining)拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)，進行的祖先起源地重建以及隨后的物種區(qū) 域進化推測結(jié)果。結(jié)果顯示，新安江水系溫州光唇魚可能起源于率水上游和練江上游，隨后群體逐漸擴張，形成現(xiàn)在的分布。

圖5 溫州光唇魚群體歷史動態(tài) Fig.5 Historical demography of A.wenchowensis

圖6 基于BBM和S-DIVA理論重建的祖先起源地 Fig.6 The ancestral area reconstruction inferred from BBM and S-DIVA

3 討論

3.1 新安江流域溫州光唇魚群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是種群適應(yīng)外界環(huán)境、延續(xù)物種生存的遺傳基礎(chǔ)，與種群的擴張、遷徙、選擇和分化息息相關(guān)(Crawfordet al,2010; Lacy,1987)。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評價種群遺傳多樣性的重要指標，其數(shù)值的大小可直觀地反映遺傳多樣性的高低。

新安江流域溫州光唇魚6個地理群體的單倍型多樣性為0.799，核苷酸多樣性為0.00631，群體遺傳多樣性水平較低，這與胡玉婷等(2017)對皖南山區(qū)光唇魚的研究結(jié)果相一致。新安江水系較為封閉，與其他水系的光唇魚物種群體交流較少，加之近年來光唇魚價格越來越高，當?shù)卮迕癫遏~熱情高漲，溫州光唇魚野生群體數(shù)量較少，多種原因造成了該水系溫州光唇魚群體遺傳多樣性較低的現(xiàn)象。建議該水域的溫州光唇魚資源應(yīng)以保護為主，科學(xué)劃定休漁期和禁捕區(qū)，對資源量豐富、遺傳多樣性相對高的群體(BC、NT)可適度開發(fā)。

3.2 溫州光唇魚群體遺傳分化

新安江流域河流呈現(xiàn)出支流多、蜿蜒盤曲、河道窄、河水淺、河床地質(zhì)為巖石、水質(zhì)清澈、河道比降大等特點(王文劍,2014)。采樣過程中，發(fā)現(xiàn)光唇魚分布豐度由一級支流至二級、三級支流呈現(xiàn)顯著的增長趨勢，這與Zhu等(2017)的研究結(jié)果相印證。復(fù)雜的水系加之季節(jié)性的干旱斷流和人為建壩的影響，導(dǎo)致了溫州光唇魚出現(xiàn)了棲息地斑塊化(Habitat Patch)現(xiàn)象(Er?set al,2005)，不同地理群體間很少有基因交流的機會。因此，在長期遺傳漂變的作用下，各個群體分別出現(xiàn)了不同程度的遺傳分化。BC群體采集于多條支流交匯后的水域，個體可能來自上游多個群體，因此，未檢測到地理分化，群體個體分布于4個進化支系中。

然而，AMOVA分析結(jié)果顯示，6個地理群體的主要遺傳變異仍來自于群體內(nèi)部，群體間的遺傳變異占33.15%。結(jié)合估算的群體擴張時間為335萬年前，認為新安江溫州光唇魚群體擴張-隔絕-分化事件所處地質(zhì)年代較新(上新世晚期)，群體間隔絕時間較短，較之遺傳漂變，基因流在形成群體遺傳結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)作用(平均基因流Nm=2.04)。因此，雖然6個群體檢測到一定的地理分化，但大多數(shù)的分子遺傳變異仍來自于群體內(nèi)個體間。

3.3 新安江溫州光唇魚群體擴張歷史

研究表明，多數(shù)物種，如魚類、爬行類，在冰川時期都經(jīng)歷過種群收縮(Zhouet al,2015; 周偉等,2017)。由于地表溫度過低，物種僅能存活在冰期避難所中，以免滅絕。而處于避難所中的物種，由于溫度適宜、資源豐富，往往比冰期后擴張的物種有著更長的群體進化歷史。對新安江溫州光唇魚群體歷史動態(tài)分析暗示，溫州光唇魚于335萬年前(上新世晚期)發(fā)生過群體擴張事件，此時全球處于末次冰川時期的早期(Zachoset al,2001)。地表溫度驟降并未影響到新安江溫州光唇魚群體的擴張。因此，推測新安江流域可能是潛在的冰期避難所。

原種保護一直是保育生物學(xué)的重點工作，檢測到不同地理群體間的遺傳分化，引起了作者對該流域溫州光唇魚原種群鑒定的興趣。結(jié)合溫州光唇魚現(xiàn)有的分布和祖籍地重建分析結(jié)果，推測新安江流域溫州光唇魚起源于ZJK和SF兩個種群，即原種群，經(jīng)過一系列的種群擴散-隔絕-分化事件，形成現(xiàn)今的分布。研究通過廣泛采樣，采用嚴格母系遺傳的mtDNA Cytb基因序列作為分子標記，追溯該物種的起源，鑒定新安江流域溫州光唇魚的原種群，為該物種種群保護的優(yōu)先級提供理論依據(jù)。