田 璐，游翹楚,，遲長鳳，宋紅彬,，樓 寶，徐冬冬

(1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022)

黃姑魚Nibea albiflora 屬于鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae、黃姑魚屬Nibea，是我國重要的海水經(jīng)濟魚類，具有生長快、抗逆性強、繁殖力強等特點，是開展近海網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖的適宜品種[1-2]。隨著黃姑魚繁育技術(shù)日趨成熟，其養(yǎng)殖規(guī)模在浙江、福建沿海迅速擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量已達8 000 余t，成為我國東南沿海重要的養(yǎng)殖魚種。但是，近年來我國沿海地區(qū)冬季常遭寒潮侵襲，致使養(yǎng)殖海區(qū)水溫偏低，養(yǎng)殖的黃姑魚大量凍死，尤以浙江沿海地區(qū)為甚，導(dǎo)致經(jīng)濟損失巨大，嚴重制約了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，探索黃姑魚低溫應(yīng)答的分子遺傳學(xué)機制，培育耐低溫(或耐寒)品種顯得十分迫切。

魚類屬變溫脊椎動物，水體溫度的變化可以影響其發(fā)育、生長、繁殖、新陳代謝、行為和地理分布等特征[3-4]。當(dāng)水溫急劇升高或降低而超過其耐受范圍時，魚類的生理功能就會受到嚴重干擾，甚至導(dǎo)致其死亡[5]。早期對魚類耐低溫的研究多從生理、生化等角度尋找和鑒定與低溫適應(yīng)的簡單標識物，如血糖、皮質(zhì)醇、腎上腺素、不飽和脂肪酸、熱激蛋白和抗凍蛋白等[6]，這些物質(zhì)通過直接與對應(yīng)酶及其它蛋白作用，提高耐低溫能力。李大鵬[7]等研究了史氏鱘Acipenser schrenckii，發(fā)現(xiàn)溫度馴化使血漿皮質(zhì)醇和血糖水平顯著升高，同時影響神經(jīng)內(nèi)分泌激素的釋放來調(diào)控其生長。賈明亮等[8]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫使奧尼羅非魚Oreochromis niloticus×O.aureus 腹腔和內(nèi)臟的脂肪被大量消耗，肌肉中粗脂肪和粗蛋白含量下降，都與對照組有顯著性差異。隨著低溫脅迫的延長，血清中谷草(丙)轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、膽固醇和血糖等顯著高于或低于對照組。王飛生等[9]研究了中華絨螯蟹Eriocheir sinensis 肌肉中不飽和脂肪酸含量在越冬期與越冬前后有顯著差異。隨著高通量測序的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在發(fā)現(xiàn)與低溫適應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過程及調(diào)控基因的變化等方面顯現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，促進了耐低溫機制的研究。例如，通過高通量測序研究發(fā)現(xiàn)，溫度變化會引起鯉Cyprinus carpio、斑馬魚Danio rerio 和線紋美銀漢魚Austrofundulus limnaeus 等魚類[10-11]的相關(guān)基因的表達變化，這些基因主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脂類合成、能量代謝等生物學(xué)過程。其中，冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)與神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament medium polypeptide，nefm)在低溫脅迫下均出現(xiàn)了顯著的表達變化。宋文華等研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白基因的上調(diào)表達是草魚抵御溫度應(yīng)激的重要生理響應(yīng)機制。胡金偉等[12]研究了牙鲆Paralichthys olivaceus 耐寒相關(guān)基因HMGB1 的克隆及表達特征，結(jié)果表明低溫誘導(dǎo)免疫相關(guān)因子響應(yīng)應(yīng)答，增強機體的免疫。在大西洋鮭Salmo salar 和牙鲆等魚類中，研究發(fā)現(xiàn)CIRP 參與環(huán)境脅迫的應(yīng)答過程[13]。本課題組在前期研究中，通過轉(zhuǎn)錄組分析，也發(fā)現(xiàn)CIRP 和nefm 參與了黃姑魚的低溫脅迫應(yīng)答過程，表明這2 個基因可能是參與黃姑魚應(yīng)答低溫脅迫的重要基因[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究對CIRP 和nefm 基因進行克隆和分子特征分析，明確這2 個基因在低溫脅迫下的表達模式及其可能作用，為進一步的黃姑魚分子育種提供的參考依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的黃姑魚是在浙江省海洋水產(chǎn)研究所下屬的西軒漁業(yè)科技島人工培育。實驗開始前2 周隨機抽取規(guī)格相當(dāng)且體表無傷、體色正常的6 月齡黃姑魚200 尾，平均體重為120.35±2.26 g(平均值±SD)，暫養(yǎng)在7 m3的水泥池中。所用海水均經(jīng)過暗沉淀后并沙濾處理，鹽度為28。為保持水質(zhì)每日換水2 次，每次換水量均保持為100% 以上，總氨氮濃度低于0.1 mg·L-1。水溫為18.0±0.5℃，溶解氧≥7.8±0.5 mg·L-1，每天投喂2 次(09:00，15:00)。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫脅迫實驗

前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)黃姑魚在18℃的養(yǎng)殖條件下，其半致死溫度為7.5℃。實驗設(shè)置18.0℃對照組和8.0℃低溫脅迫組，每組設(shè)置2 個平行，每個平行放置30 尾魚。實驗開始后，從18.0℃(此時刻記為0 h)開始以0.1℃·min-1的速率快速降低至8.0℃(興成機電水族用品有限公司，RESUN，CW-3000A) 進行冷脅迫，溫度誤差控制±0.2℃，當(dāng)降至目標溫度(8.0℃)時，維持該溫度至48 h，并分別在2 h、4 h、24 h 和48 h進行取樣。每個處理組隨機取3 尾存活的魚，解剖取其腦、鰓、肝臟和腎臟等組織，采用生理鹽水洗凈，保存于RNAstore 保存液中，置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 合成

取-80℃保存的各組織樣品，以常規(guī)Trizol 法提取各組織總RNA。通過1%瓊脂糖電泳檢測RNA 完整性，紫外分光光度計(Bio-Rad，USA)測定其濃度。樣品A260/280 值均在1.8～2.0 范圍內(nèi)。以1 μg RNA 為模板，用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 試劑盒(TaKaRa，大連)對RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，獲得所需cDNA。

1.2.3 黃姑魚CIRP 和nefm 基因的克隆

黃姑魚CIRP 和nefm 基因克隆中RT-PCR 及qRT-PCR 的特異性引物如表1。以黃姑魚cDNA 為模板，克隆CIRP 和nefm 基因。反應(yīng)體系為25 μL，1×PCR 緩沖液，0.2 mmol/L dNTP，2 mmol/L Mg2+，1 μmol/L正反向引物，2 U TaqDNA 聚合酶，cDNA 模板約200 ng。PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 預(yù)變性5 min，94 °C 變性30 s，Tm(°C)見表1，退火30 s，72 °C 延伸30 s，循環(huán)35 次；72 °C 延伸10 min。采用1.0 % 瓊脂糖電泳檢測PCR 產(chǎn)物，選取預(yù)期片段大小的條帶，用Omega 瓊脂糖膠純化試劑盒純化，純化后的目的片段采用ABI3730 進行測序。

1.2.4 序列分析

通過Lasergene 軟件對CIRP 和nefm 基因的核心片段序列進行拼接，從而獲得黃姑魚完整的CIRP 和nefm 基因的cDNA 核心序列。利用在線分析軟件Predict Protein (http://www.predictprotein.or Scratch ProteinPredictor (http://www.ics.uci.edu/～baldig/scratch/)對CIRP 和nefm 基因的開放閱讀框(ORF)進行預(yù)測，推測ORF 所編碼的氨基酸序列。用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 對預(yù)測氨基酸序列包含的信號肽。用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對CIRP 和nefm 及其同源基因的氨基酸序列進行比對分析。通過Expasy-ProtParam (http://www.expasy.org/ tools/ protparam.html)推測蛋白的理論分子量和等電點，采用MEGA 7 軟件中的Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，不同物種CIRP 建樹所用的基因序列號為：人Homo sapiens(NP_001271.1)、小鼠Mus musculus(NP_031731.1)、褐家鼠Rattus norvegicus (AAH69219.1)、熱帶爪蟾 Xenopus tropicalis (CAJ83306)、美洲鱷 Crocodylus acutus(NP_001274230.1)、玻璃海鞘Ciona intestinalis(BAA77512.1)、大西洋鮭(NP_001133148)、胡瓜魚Osmerus mordax(ACO09027.1)、牙鲆(AIA63637)、銀鮫Chimaera phantasma(NP_001279973)、銀鱈魚Anoplopoma fimbria (ACQ58801)。不同物種CIRP 建樹所用的基因序列號為：家鼠(NP_032717.2)、青鳉Oryzias latipes(XP_004075033.1)、底鳉Fundulus heteroclitus(JAR72410.1)、斑馬魚(NP_001104684.2)、大黃魚Larimichthys crocea(KKF28570.1)、大西洋鮭(NP_001158883.1)、貝氏隆頭魚Labrus bergylta(XP_020514172.1)、銀鮫(AFO95338.1)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采用SMART 在線工具(http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測。

1.2.5 RT-PCR 及Real-Time RT-PCR

根據(jù)黃姑魚CIRP、nefm 的cDNA 序列分別設(shè)計特異性引物(表1)，進行RT-PCR 擴增，檢測這2 個基因在不同組織的表達。以β-actin 基因作為內(nèi)參基因，18℃處理0 h 的黃姑魚樣品的基因表達量作為參照標準，對低溫脅迫實驗2 h、4 h、24 h 和48 h 的黃姑魚腦、鰓、肝和腎組織樣品提取RNA，制備cDNA，采用Real-Time RT-PCR 分析表達量的相對變化。熒光定量PCR 實驗操作參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡKit(Tli RNaseH Plus) 試劑盒使用說明。反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10.0 μL，滅菌水7.2 μL，cDNA 模板0.8 μL，正反向引物0.8 μL(濃度為10 μmol·L-1)，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL。PCR 反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR 儀進行，反應(yīng)程序為：55～95℃逐漸升溫2 min，95℃30 s；95℃5 s，62℃30 s，40 個循環(huán)。上述實驗進行3 次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后由ABI 7500 Real Time PCR 儀繪制標準曲線并記錄Ct值，采用2-△△Ct法分析基因的相對表達量[15]。

表1 黃姑魚CIRP 和nefm 基因克隆和擴增所用特異性引物Tab.1 Specific primers used in cloning and RT-PCR of CIRP and nefm for N.albiflora

2 結(jié)果

2.1 CIRP 的cDNA 序列及結(jié)構(gòu)分析

通過克隆獲得黃姑魚CIRP 基因cDNA 核心序列3 460 bp，其開放閱讀框為543 bp，編碼180 個氨基酸(圖1)。CIRP 的分子量為18.94 KD，理論等電點為8.92，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為28 個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為25 個。通過BLAST 序列比對分析發(fā)現(xiàn)黃姑魚CIRP 與銀鱈、牙鲆、斑馬魚、虹鱒Oncorhynchus mykiss、胡瓜魚、大西洋鮭蛋白同源性分別為79.03%、78.28%、77.42%、69.86%、69.44%、68.89% (圖2)。采用NJ 法構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示：黃姑魚CIRP 與銀鱈的親緣關(guān)系最近，與牙鲆共同構(gòu)成了一個分支。采用SignalP 4.1 預(yù)測在CIRP ORF 區(qū)未檢測到明顯的信號肽。對CIRP蛋白進行跨膜區(qū)域和糖基化位點預(yù)測，結(jié)果表明CIRP 蛋白為膜外蛋白，沒有明顯的跨膜區(qū)域，也沒有明顯糖基化位點。利用NetPhos 2.0 Server 預(yù)測蛋白激酶C(PKC)位點與Ser，Thr，Thy 磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)在42 Thr、94Ser 具有顯著的PKC 位點，而整個翻譯區(qū)共有16 個Ser，3 個Thr 和9 個Tyr 磷酸化位點。

圖1 黃姑魚CIRP 基因序列及其預(yù)測氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the N.albiflora CIRP

圖2 黃姑魚CIRP 與其他物種的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequences alignment of CIRP among N.albiflora and other species

圖3 采用N-J bootstrap 方法構(gòu)建CIRP 的系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1 000 次)Fig.3 Phylogenetic tree of nefm by 1000 times N-J bootstrap

2.2 nefm 的cDNA 序列及結(jié)構(gòu)分析

通過克隆獲得黃姑魚nefm 基因cDNA 核心序列1 116 bp，其開放閱讀框為1 107 bp，共編碼368 個氨基酸(圖4)。nefm 分子量為42.69 KD，理論等電點為5.1，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為51 個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為66 個。通過BLAST 檢索分析發(fā)現(xiàn)黃姑魚nefm 與大黃魚、銀鱈魚、貝氏隆頭魚、底鳉、青鳉及斑馬魚的蛋白同源性都在80%以上(圖5)。采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，發(fā)現(xiàn)黃姑魚與大黃魚、貝氏隆頭魚的親緣關(guān)系最近，共同構(gòu)成了一個分支，與青鳉、底鳉、斑馬魚位于一個大的分支。在ORF 區(qū)未檢測到明顯的信號肽和糖基化位點，nefm 同樣是一個膜外蛋白基因，沒有明顯的跨膜區(qū)域。利用NetPhos 2.0 Server 預(yù)測蛋白激酶C(PKC)位點與Ser，Thr，Thy 磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)在29 Thr，34 Ser，42 Ser，51 Thr，52 Thr，53 Ser，68 Ser，69 Thr，318 Ser，365 Thr 具有顯著的PKC 位點，而整個翻譯區(qū)共有30 個Ser，14個Thr 和4 個Tyr 磷酸化位點。

圖4 黃姑魚nefm 基因的cDNA 序列及其預(yù)測蛋白序列Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the N.albiflora nefm

圖5 黃姑魚nefm 與其他物種氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequences alignment of nefm among N.albiflora and other species

圖6 采用N-J bootstrap 方法構(gòu)建nefm 的系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1 000 次)Fig.6 Phylogenetic tree of nefm by 1 000 times N-J bootstrap

2.3 黃姑魚CIRP 和nefm 的時間差異表達

采用RT-PCR 對2 個基因進行組織表達分析，黃姑魚CIRP 和nefm 基因在心、腦、鰓、脾、肝、胃、腎、性腺、肌和鰭等10 個組織中均有不同程度的表達。對黃姑魚進行低溫脅迫，選取表達量較高的腦、鰓、肝、腎組織進行時間差異表達分析。采用qRT-PCR 對2 h、4 h、24 h 和48 h 的不同組織中的CIRP 和nefm 基因的差異表達量進行檢測(圖4)。在低溫實驗中，隨著處理時間的延長，2 個相關(guān)基因的表達呈不同變化趨勢。CIRP 在肝臟的表達變化不顯著，在鰓、腦和腎中顯著變化。在鰓中在2 h 時達到最大值，在2～4 h 內(nèi)驟減，在24 h 時再達到1 個峰值，在24～48 h 下降。在腦中，0～4 h 期間表達量逐漸上升在4 h 達到最大值，在4～48 h 期間表達量逐漸下降。在腎中在2 h 達到最大值，2～48 h 表達量逐漸下降(圖7)。

nefm 在在腦、肝和腎中變化顯著，在鰓中變化不大。在腦和腎中在0～4 h 逐漸升高，在4 h 達到最大值，4～24 h 下降，24～48 h 又逐漸上升。在鰓中0～24 h 表達量逐漸下降，24～48 h 再上升。在肝中，0～4 h 逐漸升高，在4 h 時達到最大值，4～24 h 急劇下降，24～48 h 其表達量均較少(圖7)。

圖7 低溫處理下黃姑魚的CIRP 和nefm 基因在各組織的差異表達Fig.7 The expression of CIRP and nefm genes in N.albiflora tissues in the duration of cold treatment

3 討論

3.1 黃姑魚CIRP 和nefm 基因結(jié)構(gòu)和組織表達分析

冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白最早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，其表達量在冷刺激下急劇增加，同時具有調(diào)控冷誘導(dǎo)細胞激活抑制作用，因此被視為是冷誘導(dǎo)的標記基因[16]。CIRP 基因?qū)儆诟缓拾彼岬腞NA 結(jié)合蛋白家族，序列中都包含一個氨基端共有序列RNA 結(jié)合域(consensus sequence RNA binding domain，CS-RBD)。CS-RBD 是RNA 識別基序(RNA recognition motif，RRM)，是RAN 結(jié)合基序之一[17-18]，有2 個高度保守序列(一個為八聚體，另一個為六聚體)，分別是核糖核蛋白1,2 (ribonucleoprotein 1,2；RNP1，RNP2)。本研究中黃姑魚CIRP 氨基酸序列中同樣存在RNP1 和RNP2 兩個結(jié)合基序。其中RNP1 結(jié)合基序是八聚體，前6位氨基酸相同，最后2 位氨基酸是賴氨酸和酪氨酸(黃姑魚、大西洋鮭，銀鱈魚和牙鲆中)或蘇氨酸和苯丙氨酸(斑馬魚，胡瓜魚和虹鱒中)。RNP2 結(jié)合基序是六聚體，第3 位氨基酸是異亮氨酸(黃姑魚、斑馬魚、牙鲆和銀鱈魚中)或纈氨酸(大西洋鮭、虹鱒、胡瓜魚中)[13,19-20]。

神經(jīng)微絲蛋白(nefm)基因編碼中等神經(jīng)絲蛋白，是特異表達在外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元及其鄰近軸突細胞骨架的主要結(jié)構(gòu)單位[21-22]。在魚類中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)調(diào)應(yīng)激反應(yīng)，而這種蛋白質(zhì)通常被用作神經(jīng)元損傷的生物標志物[23]，根據(jù)GO 注釋，nefm 在分子功能上是電子載體，動力蛋白等，在生物學(xué)過程上參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]、質(zhì)子轉(zhuǎn)運等，所以本研究認為nefm 是一個耐寒相關(guān)基因。通過組織差異表達分析發(fā)現(xiàn)，nefm 基因在黃姑魚多個組織均有不同程度的表達，這表明nefm 基因可能參與不同的生理活動。但關(guān)于該基因在魚類上的研究還較少，需要進一步的研究。

3.2 黃姑魚CIRP 和nefm 基因?qū)Φ蜏孛{迫響應(yīng)

CIRP 基因是具有調(diào)控冷誘導(dǎo)細胞激活抑制作用的冷誘導(dǎo)的標記基因，隨著低溫脅迫的時間增長，CIRP 在腦、鰓和腎臟組織中顯著變化，尤其在0～2 h 其表達量發(fā)生了劇烈上調(diào),在鯉魚和斑馬魚的耐低溫實驗中，CIRP 基因在低溫下同樣顯示表達上調(diào)，上述研究表明CIRP 基因可能參與了生物體抵抗冷脅迫過程。同時，在人類以及小鼠中研究發(fā)現(xiàn)CIRP 基因還與炎癥反應(yīng)有關(guān)，外界脅迫下，CIRP 基因在肝臟和心臟中有明顯上調(diào)[25]，通過TLR4-MD2 復(fù)合體(Toll-like receptor4(TLR4)-myeloid differentiation factor 2(MD2) complex)來調(diào)節(jié)CIRP 基因的表達量從而參與炎癥反應(yīng)，所以CIRP 基因可能通過參與炎癥反應(yīng)來提高生物體抵抗力來達到生物體抗寒的效果。關(guān)于炎癥反應(yīng)的推測以及不同物種結(jié)果差異性的具體原因，在魚類中都尚未有相關(guān)研究，需要進一步的驗證。

在低溫脅迫下，黃姑魚nefm 在腦、鰓、肝臟和腎臟均發(fā)生了顯著變化。在人類中，nefm 是參與調(diào)節(jié)醛固酮分泌對多巴胺反應(yīng)的選擇性基因[26]，其中醛固酮是調(diào)節(jié)細胞外液容量和電解質(zhì)的激素，可以調(diào)節(jié)細胞的鈉鉀平衡，而多巴胺又是人體的神經(jīng)傳遞物質(zhì)，與人體的興奮感有關(guān)。所以在魚類中nefm 可能是通過調(diào)節(jié)醛固酮來調(diào)節(jié)魚體的鈉鉀轉(zhuǎn)運與多巴胺反應(yīng)來參與冷應(yīng)激。多巴胺用以傳遞生物體遇見脅迫時的神經(jīng)興奮，鈉鉀轉(zhuǎn)運則伴隨著ATP 的水解和合成，而能量是環(huán)境脅迫下必不可少的成分。

構(gòu)建黃姑魚抗低溫功能基因超表達載體、建立遺傳轉(zhuǎn)化體系和探究能量代謝信號通路等方面內(nèi)容，將是耐寒生物選育研究工作的方向。近幾年基因芯片技術(shù)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)等的完善，更多直接或間接的耐低溫甚至耐寒的功能基因?qū)⒈惶暨x出來，從而隨著研究的深入，魚類耐寒的生理生化機制及分子機制更加清晰。目前關(guān)于nefm 基因參與了生物體抵抗冷脅迫過程的響應(yīng)機制的研究在魚類中較少，所以需要更深入的研究。