孟春英，張小軍，黃麗英，顧 捷

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021)

砷(As)是一種廣泛存在于自然界中的類金屬元素[1]，砷及其化合物在農(nóng)業(yè)上常用作殺蟲劑，工業(yè)生產(chǎn)中用于皮毛的防腐、脫毛，玻璃的脫色劑等。隨著工業(yè)化生產(chǎn)的不斷發(fā)展，砷的污染日益加劇，其污染源主要為飲用水、食品中的累積，對(duì)人類的身體健康威脅越來(lái)越大[2]。

砷的毒性大小與其存在的形態(tài)密切相關(guān)[3]。毒理學(xué)研究表明，無(wú)機(jī)砷的毒性大于有機(jī)砷，As(III)比As(V)的毒性強(qiáng)。As(III)化合物易被細(xì)胞吸收和蓄積，阻礙細(xì)胞呼吸、分裂和增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡等[4]。慢性砷中毒會(huì)使神經(jīng)功能紊亂，致癌、致畸形等[5-6]。常見(jiàn)的分離技術(shù)包括高效液相-原子熒光光譜(HPLC-AFS)[7-8]和高效液相-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(HPLC-ICP-MS)[9-11]等。HPLC 分離能力高，AFS 儀器設(shè)備價(jià)格低，其線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，所以HPLC-AFS 聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用更廣泛。本研究以HPLC-AFS 聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的形態(tài)和含量，對(duì)GB 5009.11-2014[12]中前處理方法做了改進(jìn)，縮短了前處理時(shí)間，提取條件更溫和，雜質(zhì)干擾少，獲得的峰形尖銳。同時(shí)以該方法測(cè)定了2016 年浙江省324 批次樣品中無(wú)機(jī)砷含量，客觀了解浙江省水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷含量情況，以期為監(jiān)測(cè)水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷含量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品來(lái)自浙江溫州的養(yǎng)殖企業(yè)及該區(qū)域的自然海域捕撈產(chǎn)品包括貝類、蟹類、蝦類和魚類等。樣品制備和保存按照SC/T 3016-2004《水產(chǎn)品抽樣方法》[13]進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

主要包括ProStar210 液相色譜泵(美國(guó)Varian 公司)；SA-10 原子熒光形態(tài)分析儀(配SAP-10 形態(tài)分析預(yù)處理裝置，北京吉天儀器有限公司)；砷空心陰極燈(北京有色金屬研究總院HAF-2)；陰離子交換色譜柱(美國(guó)Hamilton 公司，PRP-X100，250×4.1 mm，10 μm)；AL204 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；IKA T18 基本型漩渦振蕩器(德國(guó)IKA 公司)；Centrifuge 5810 臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)；pH計(jì)(德國(guó)Sartorius PB-10)等。

1.3 材料與試劑

砷酸根(AsO43-)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08667)，質(zhì)量摩爾濃度(0.233±0.005) μmol·g-1；亞砷酸根(AsO33-)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08666)，質(zhì)量摩爾濃度(1.011±0.016) μmol·g-1；一甲基砷(MMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBWO8668)，質(zhì)量摩爾濃度(0.335±0.011) μmol·g-1二甲基砷(DMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBWO8669)，質(zhì)量摩爾濃度(0.706±0.024) μmol·g-1均來(lái)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。甲醇(色譜純，Merck)；硝酸(色譜純，Merck)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)；磷酸氫二銨(色譜純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀為分析純。

1.4 無(wú)機(jī)砷形態(tài)分析方法

1.4.1 砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

將MMA 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、DMA 標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)、AsO33-標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)及AsO43-標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)分別轉(zhuǎn)移至5 mL 的容量瓶中，純水定容至5 mL，其濃度分別為9.67、22.05、29.39、7.04 μg·mL-1，密封保存于4℃冰箱中，有效期3 個(gè)月。

1.4.2 無(wú)機(jī)砷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置

依次準(zhǔn)確移取517、227、170、710 μL 的MMA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、DMA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、AsO33-標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和AsO43-標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于5 mL 容量瓶中，純水稀釋至5 mL，使各組分的最終質(zhì)量濃度均為1.0 μg·mL-1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.3 樣品提取

稱取1.0 g 左右大黃魚Larimichthys crocea 濕樣于50 mL 離心管中，加入0.15 mol·L-1硝酸溶液20 mL，渦旋混勻2 min 后于50℃振蕩過(guò)夜，取出冷卻至室溫，2 657 g 離心6 min，取5 mL 上清液于15 mL離心管中，加入5 mL 正己烷振蕩1 min，去除脂質(zhì)成分，再次離心(條件同上)，離心后棄去上層正己烷，吸取下清液，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜，待用。

1.4.4 樣品測(cè)定

選取色譜柱Hamilton PRP-X100(柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4 mm)；流動(dòng)相15 mmol·L-1的磷酸氫二銨(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1；柱溫25℃，手動(dòng)進(jìn)樣100 μL。

形態(tài)分析預(yù)處理裝置參數(shù)設(shè)置：泵速65 r·min-1；載流7% HCl；還原劑0.5% KOH+1.5% KBH4。

氫化物發(fā)生條件：元素?zé)綦娏?0/45，負(fù)高壓285 V，載氣(氬氣)流速400 mL·min-1；屏蔽氣(氬氣)流速600 mL·min-1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

砷形態(tài)測(cè)定曲線：配置1.0 μg·mL-1含MMA、DMA、AsO33-和AsO43-的4 種砷形態(tài)混標(biāo)使用液，用純水稀釋成0、5、10、20、30、50、100 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供HPLC-AFS 分析，保留時(shí)間定性，峰面積定量。以峰面積為縱坐標(biāo)，無(wú)機(jī)砷濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 質(zhì)量控制

選用外標(biāo)法，在待測(cè)樣品中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，做3 個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率和平行樣之間的RSD，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.7 無(wú)機(jī)砷含量計(jì)算方法

樣品中無(wú)機(jī)砷的含量是亞砷酸根和砷酸根含量的加和。單種形態(tài)含量計(jì)算公式見(jiàn)式(1)：

式(1) 中ρ-單種待測(cè)物的含量，mg·kg-1；c-提取液中單種待測(cè)物的含量，μg·L-1；V-提取液定容體積，mL；m-樣品的稱取量，g；n-稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及光譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相15 mmol·L-1的磷酸氫二銨(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1，色譜柱選用Hamilton PRP-X100；泵速65 r·min-1，載流7% HCL，還原劑0.5%KOH+1.5%KBH4；元素?zé)綦娏?0/45，負(fù)高壓285 V，載氣(氬氣)流速400 mL·min-1；屏蔽氣(氬氣)流速600 mL·min-1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1 所示。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 前處理優(yōu)化

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中4 種砷形態(tài)色圖譜Fig.1 Chromatogram of 4 kinds of arsenic forms in standard solution

本研究對(duì)GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》中的前處理進(jìn)行了部分改進(jìn)，以50℃恒溫振蕩過(guò)夜的處理方法代替國(guó)標(biāo)中樣品室溫放置過(guò)夜然后90℃恒溫箱中熱浸提2.5 h 的處理方法，前處理?xiàng)l件更溫和，避免了90℃高溫處理2.5 h，此舉可以更好的保護(hù)砷的形態(tài)，避免各砷形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化；每批次樣品前處理時(shí)間可縮短2.5 h，提高了檢測(cè)效率。

2.2.2 優(yōu)化結(jié)果

同一陽(yáng)性樣品提取值RSD 在2.01%～4.31%。在同一實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)GB 中前處理方法處理后，As(V)的加標(biāo)回收率67%～85%，鋒形拖尾；經(jīng)本研究中前處理后，As(V)的加標(biāo)回收率85%～99%，且鋒形較尖銳。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，在實(shí)際樣品檢測(cè)中各形態(tài)的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間會(huì)有0～10%的漂移，且DMA 和AsO33-的保留時(shí)間非常接近，為了更準(zhǔn)確的辨別樣品中的砷形態(tài)，方法中應(yīng)該加入MMA 和DMA；其次考慮到MMA 和DMA 也具有輕微毒性，也應(yīng)該監(jiān)測(cè)樣品中MMA 和DMA 的含量，使檢測(cè)結(jié)果更科學(xué)準(zhǔn)確。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 方法的線性范圍、回歸方程與定量限

以砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，2 種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表1，檢出限以3 倍信噪比的方法計(jì)算得出，定量限以10 倍信噪比計(jì)算。

表1 無(wú)機(jī)砷測(cè)定的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Tab.1 Linear range,regression equations,correlation coefficients,limits of detection of inorganic arsenic

2.4.2 回收率和精密度

稱取樣品于50 mL 離心管中，先加入0.6 mL 的4 種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，再加入0.15 mol·L-1的硝酸溶液定容至20 mL，做3 個(gè)平行。3 次測(cè)定的加標(biāo)回收率：As(III)的均值為98%，RSD 為2.16%；As(V)的均值為95%，RSD 為2.75%；表明2 種形態(tài)的無(wú)機(jī)砷測(cè)定數(shù)值均在規(guī)定范圍內(nèi)，方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足檢測(cè)的要求。樣品加標(biāo)色譜圖如圖2 所示。

圖2 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatogram of spiked sample

不同形態(tài)的砷的毒性存在很大差異，所以對(duì)不同砷形態(tài)的研究很有必要。邱宗清等[14]用陰離子交換色譜-ICP-MS 法測(cè)定了福建花蛤中的砷形態(tài)，1.00 mmol·L-1(NH4)2CO3和10.00 mmol·L-1的(NH4)2HPO4梯度洗脫，砷甜菜堿(ASB)、MMA、DMA、As(III)和As(V)在15 min 內(nèi)分離開(kāi)。而吳思霖等[15]選用HPLC-AFS 聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷，采用1 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 9.0)、20 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 8.0)，色譜柱Hamilton PRP-X100，20 min 內(nèi)將MMA、DMA、As(III)和As(V)分離開(kāi)。還有部分學(xué)者選用等度洗脫，如周秀清[16]選用15.00 mmol·L-1的NH4H2PO4(pH 10.0)為流動(dòng)相，將As(III)、As (V)、ASB 和MMA 在9 min 內(nèi)分開(kāi)，使用儀器為HPLC-ICP-MS，色譜柱為Hamilton PRP-X100。HPLC-AFS[17]聯(lián)用技術(shù)分離海藻中的無(wú)機(jī)砷，也用等度洗脫，流動(dòng)相為15 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 6.0)，色譜柱同上，12 min 內(nèi)將MMA、DMA、As(III)和As(V)分離開(kāi)。綜上所述，多數(shù)研究中無(wú)機(jī)砷的分離多選用陰離子交換柱，流動(dòng)相多為磷酸鹽，流動(dòng)相pH 影響各形態(tài)的出峰順序及分離度。但存在的共同問(wèn)題是As(V)峰形較其他3 種差，推測(cè)原因是As(V)通常是最后一個(gè)出峰，保留時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)峰形有一定影響。這一點(diǎn)還有待驗(yàn)證。

2.5 檢測(cè)樣品測(cè)定

結(jié)合2016 年浙江省常見(jiàn)水產(chǎn)品中國(guó)無(wú)機(jī)砷的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，本研究對(duì)采自浙江溫州養(yǎng)殖企業(yè)及近海海域的324 個(gè)樣品的無(wú)機(jī)砷含量進(jìn)行分析[18]，具體數(shù)據(jù)如表2。

表2 檢測(cè)樣品中無(wú)機(jī)砷測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of inorganic arsenic in aquatic products

由表2 見(jiàn)，324 個(gè)樣品中67 個(gè)樣品有無(wú)機(jī)砷檢出，檢出率為20.7%。泥蚶Tegillarca granosa 的檢出率為18.1%(最高含量為0.39 mg·kg-1)；縊蟶Sinonovacula constricta 檢出率為63.0%(最高含量為1.79 mg·kg-1)，有2 個(gè)樣品(比例為7.4%)無(wú)機(jī)砷含量超標(biāo)；青蛤Cyclina sinensis 的檢出率為65.6%(最高含量為0.17 mg·kg-1)；厚殼貽貝Mytilus coruscus 共3 個(gè)樣品，均有檢出(最高含量為0.068 mg·kg-1)；遠(yuǎn)海梭子蟹Portunus pelagicus 的檢出率為26.9%(最高含量為0.49 mg·kg-1)；海捕蝦、槍烏賊Loligo chinensis、中華鱉Trionyx sinensis 和魚均未檢出?？傮w來(lái)說(shuō)，貝類無(wú)機(jī)砷含量最高。

圖3 貝類中無(wú)機(jī)砷含量Fig.3 The content of inorganic arsenic in shellfish

從圖3 可以看出，縊蟶中無(wú)機(jī)砷含量最高，范圍0.03～1.79 mg·kg-1，均值為0.3 mg·kg-1，分別是泥蚶，青蛤，貽貝的3.6、3.8、6.3 倍。其次為泥蚶，范圍0.03～0.12 mg·kg-1，均值為0.08 mg·kg-1，貽貝含量最低。關(guān)于貝類中砷的研究較多。郝云杉等[19]2010 年在浙江省舟山市主要菜場(chǎng)中采集了菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、縊蟶、牡蠣和貽貝4 種貝類并研究無(wú)機(jī)砷的含量，發(fā)現(xiàn)貝類無(wú)機(jī)砷含量范圍在0.07～0.19 mg·kg-1，菲律賓蛤仔含量最高，縊蟶次之，牡蠣第3，貽貝最低。李學(xué)鵬等[20]研究了2006 年杭州市近江市場(chǎng)幾種食用貝類中重金屬含量，包括牡蠣、菲律賓蛤仔、文蛤Meretrix meretrix和泥蚶，無(wú)機(jī)砷含量最高的是菲律賓蛤仔(0.78 mg·kg-1)，全部樣品的無(wú)機(jī)砷含量范圍在0.11～0.84 mg·kg-1，均值為0.42 mg·kg-1。程家麗等[21]從2001-2015 年發(fā)表的文獻(xiàn)中收集了中國(guó)海洋食用貝類重金屬含量數(shù)據(jù)，報(bào)道的區(qū)域從海南沿海至大連沿海，包括長(zhǎng)江口-浙江沿海、山東沿海、珠江口、渤海灣、福建沿海幾大海域，比較了牡蠣、菲律賓蛤仔、縊蟶及貽貝中總砷的含量，縊蟶中總砷含量最高(2.14±3.97) mg·kg-1，貽貝最小(1.2±0.83) mg·kg-1。通常貝類中無(wú)機(jī)砷的含量約為總砷含量的10%[22]，因此基于獲得的數(shù)據(jù)，縊蟶中無(wú)機(jī)砷含量約為(0.214±0.397) mg·kg-1，與本研究評(píng)估2016 年浙江省貝類中縊蟶無(wú)機(jī)砷含量最高的結(jié)論一致。孫慧玲[23]2013-2014 年在大連主要水產(chǎn)品市場(chǎng)采集了4 種貝類(長(zhǎng)牡蠣Crassostrea gigas、蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis、縊蟶和中國(guó)槍烏賊)，分析其體內(nèi)重金屬的含量，發(fā)現(xiàn)縊蟶體內(nèi)的砷含量最高，且其含量顯著高于蝦夷扇貝和中國(guó)槍烏賊。王玲等[24]研究了三門灣海域水產(chǎn)品中的重金屬含量發(fā)現(xiàn)貝類中砷含量高于甲殼類和魚類。貝類產(chǎn)品對(duì)無(wú)機(jī)砷的富集能力要高于魚蝦類。這可能是由于貝類生活在底泥中，而重金屬在底泥中的含量由于累積作用往往比相應(yīng)的水體中的含量要高得多[25-26]。也有可能是因?yàn)樨愵悶闉V食性生物，對(duì)污染物的釋放和代謝比魚類和甲殼類慢，對(duì)重金屬的富集程度高[27-28]。重金屬在體內(nèi)代謝慢，易積累，所以沿海地區(qū)貝類的監(jiān)管應(yīng)當(dāng)受高度重視。

3 結(jié)論

本研究選用15 mmol·L-1(pH 6.0)的磷酸氫二銨在8 min 內(nèi)將DMA、MMA、As(III)和As(V)分離開(kāi)，加標(biāo)回收率在80%～99%之間，RSD 范圍為1.82%～2.75%。此方法可以滿足檢測(cè)的要求。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，該方法前處理?xiàng)l件溫和，時(shí)間短，As(III)和As(V)的峰形尖銳，出峰時(shí)間穩(wěn)定，重復(fù)性良好，加標(biāo)回收率和RSD均在要求的范圍內(nèi)。檢測(cè)的324 個(gè)樣品，無(wú)機(jī)砷檢出率為20.7%，其中95.6%的樣品只含As(III)，4.4%的樣品含As(III)和As(V)。貝類的檢出率最高，縊蟶體內(nèi)的無(wú)機(jī)砷含量最高，超標(biāo)率為7.4%。建議沿海地區(qū)的水產(chǎn)品無(wú)機(jī)砷監(jiān)管應(yīng)當(dāng)受高度重視貝類，至于貝類無(wú)機(jī)砷含量能否反映出環(huán)境中砷含量的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。