楊德平，劉維薇

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201318；2.上海市同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072；3.上海市皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200070)

近年來(lái)，微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)作為新一代PCR，具有高靈敏度、高精密度和高準(zhǔn)確度，使它在檢測(cè)體細(xì)胞稀有等位基因突變或低濃度的DNA樣本時(shí)比傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)更加可靠和適用[1]。它使用絕對(duì)定量取代標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，已作為一種替代方法廣泛用于臨床和醫(yī)學(xué)研究[2-4]。該方法依賴(lài)于對(duì)傳統(tǒng)PCR反應(yīng)有限的稀釋和泊松統(tǒng)計(jì)[2,5]。在有限的稀釋后，大多數(shù)反應(yīng)不包含或僅包含一個(gè)靶分子，并且每個(gè)反應(yīng)是獨(dú)立的測(cè)試。通過(guò)泊松統(tǒng)計(jì)計(jì)算出有熒光信號(hào)的比值，最后得出樣本中的絕對(duì)模板量[6-7]。PUC57質(zhì)粒是大腸桿菌載體含有2 710 bp。本實(shí)驗(yàn)利用ddPCR檢測(cè)含有目的基因的PUC57質(zhì)粒，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的酶切、酶切孵育時(shí)間和酶切后放置天數(shù)的問(wèn)題進(jìn)行了探討，為同行提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 根據(jù)GenBank中乙肝病毒DNA(HBV DNA)的序列，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，針對(duì)HBV DNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，用引物擴(kuò)增的那段目的基因片段(95 bp)構(gòu)建PUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒的構(gòu)建由上海生工生物工程有限公司完成。質(zhì)粒含有2 806 bp，質(zhì)粒的濃度為237 ng/μL，通過(guò)換算為7.82×1010copies/μL。為獲得線(xiàn)性DNA模板，用ECORⅠ酶對(duì)PUC57質(zhì)粒進(jìn)行酶切。酶切好的質(zhì)粒放在2～8 ℃冰箱保存待用。

1.2儀器與試劑 ECORⅠ酶、10×ECORⅠ buffer購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，ddPCR試劑及其耗材購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。QX200TM微滴生成儀、PX1TMPCR板封口機(jī)、QX100TMPCR儀、QX200TM微滴讀取儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。DH100-2恒溫金屬浴購(gòu)自杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.3引物與探針 通過(guò)序列比對(duì)分析，針對(duì)HBV DNA保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成，5′→3′引物探針序列為F:TAG ACC ACC AAA TGC CCC TA；R:GAG GCG AGG GAG TTC TTC TT；探針:FAM-ACT GTT GTT AGA CGA CGA GGC AGG TCC-BHQ1。

1.4酶切 將含有目的基因的PUC57質(zhì)粒與ECORⅠ試劑按比例進(jìn)行混合，放入37 ℃恒溫金屬浴中孵育，為了使酶切后的質(zhì)粒通過(guò)ddPCR檢測(cè)后所得值與質(zhì)粒理論值相符，研究者用了2個(gè)孵育時(shí)間，一份混合物孵育2 h，另一份混合物孵育4 h，在孵育的時(shí)間到達(dá)后，每份混合物再65 ℃孵育20 min，滅活ECORⅠ酶，酶切總體積為20 μL(包括ECORⅠ 1 μL、10×buffer 2 μL、PUC57質(zhì)粒4 μL、ddH2O 13 μL)。酶切得到的線(xiàn)性DNA模板再用ddH2O稀釋成100、101、102、103copies/μL，稀釋的模板用于ddPCR檢測(cè)。最后比較兩個(gè)孵育時(shí)間后，酶切混合物經(jīng)過(guò)ddPCR檢測(cè)所得值與質(zhì)粒理論值差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5ddPCR檢測(cè) 按照儀器操作指南，反應(yīng)體系為20 μL，其中ddPCR Supermix 10 μL，上下游引物(900 nmol/L)各1 μL，探針(250 nmol/L)0.3 μL，質(zhì)粒4 μL，ddH2O 3.7 μL。使用QX200TM微滴生成儀生成微滴，然后用PX1TMPCR板封口機(jī)熱封96孔板，最后使用QX100TMPCR儀對(duì)含有目的基因的PUC57質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后將96孔板放入QX200TM微滴讀取儀中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，檢測(cè)到熒光信號(hào)的被記為陽(yáng)性反應(yīng)，沒(méi)有檢測(cè)到熒光的被記為陰性反應(yīng)。最后通過(guò)QuantaSoft分析軟件計(jì)算出質(zhì)粒的絕對(duì)濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。所有拷貝數(shù)進(jìn)行Log10轉(zhuǎn)換，正態(tài)分布資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布資料采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ddPCR檢測(cè)酶切孵育2 h與4 h后的PUC57質(zhì)粒結(jié)果比較 酶切孵育2 h后檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Log10轉(zhuǎn)換后分別為0.146、1.531、2.486、3.475 copies/μL，酶切孵育4 h后檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Log10轉(zhuǎn)換后分別為0.663、1.556、2.643、3.623 copies/μL，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。兩個(gè)酶切孵育2 h與4 h后，ddPCR檢測(cè)結(jié)果孵育時(shí)間后，酶切混合物經(jīng)過(guò)ddPCR檢測(cè)所得值與質(zhì)粒理論值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.192、-0.403,P>0.05)。

2.2ddPCR檢測(cè)酶切與沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒 沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Log10轉(zhuǎn)換后均值分別為0.362、0、0.851、0.398、0.857、2.174 copies/μL，酶切的PUC57質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Log10轉(zhuǎn)換后均值分別為0.568、1.656、2.672、3.637、4.681、5.332 copies/μL，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。酶切組與沒(méi)有酶切組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.194,P<0.05)，酶切組與理論值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.2,P>0.05)。

圖1 酶切2 h與4 h的PUC57質(zhì)粒ddPCR檢測(cè)結(jié)果

2.3ddPCR檢測(cè)放置不同天數(shù)的酶切PUC57質(zhì)粒 選用酶切PUC57質(zhì)粒的101和103copies/μL的稀釋度，用ddPCR分別檢測(cè)剛酶切的、放置在2～8 ℃冷藏2周和4周的PUC57質(zhì)粒，每個(gè)稀釋度各檢測(cè)2次，剛酶切的PUC57質(zhì)粒的101稀釋度的檢測(cè)結(jié)果均值是47 copies/μL，103稀釋度的檢測(cè)結(jié)果均值是4 520 copies/μL。2周后的檢測(cè)結(jié)果分別是30和1 738 copies/μL。4周后的檢測(cè)結(jié)果分別是20和660 copies/μL。從檢測(cè)結(jié)果可以看出隨著酶切PUC57質(zhì)粒放置天數(shù)的增加，高低濃度的質(zhì)粒檢測(cè)值在逐漸降低。見(jiàn)圖3。

注：酶切與沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒分別用ddH2O稀釋成100、101、102、103、104、105copies/μL，每個(gè)稀釋度用ddPCR檢測(cè)3次；A為沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒組；B為酶切的PUC57質(zhì)粒組

圖2酶切與沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒ddPCR檢測(cè)結(jié)果

注：A為剛酶切檢測(cè)結(jié)果；B為酶切后放置2周檢測(cè)結(jié)果；C為酶切后放置4周檢測(cè)結(jié)果

圖3放置不同天數(shù)的酶切PUC57質(zhì)粒ddPCR檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

ddPCR由于它是不依賴(lài)于外部校準(zhǔn)曲線(xiàn)或參考，能敏感的和特異的檢測(cè)核酸，同時(shí)相比qPCR，它對(duì)PCR抑制劑低敏感[8]，已成為一種新的分子檢測(cè)技術(shù)[9-10]。這項(xiàng)技術(shù)是稀有事件檢測(cè)或拷貝數(shù)變異估計(jì)等需要精確定量應(yīng)用的理想工具[11]。因此，ddPCR的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在癌癥檢測(cè)，核酸定量上應(yīng)用越來(lái)越多[12-13]。ddPCR正在迅速取代qPCR作為獨(dú)立的DNA定量分析的一種有效方法[14]。本研究對(duì)HBV DNA的一段保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，同時(shí)對(duì)這段保守區(qū)域構(gòu)建質(zhì)粒，再利用ddPCR檢測(cè)含有HBV DNA目的基因的PUC57質(zhì)粒。

本文在用ddPCR檢測(cè)PUC57質(zhì)粒前先用ECORⅠ酶對(duì)構(gòu)建好的PUC57質(zhì)粒進(jìn)行酶切，在酶切過(guò)程中用了兩個(gè)孵育時(shí)間，一個(gè)是孵育2 h，另一個(gè)是孵育4 h。研究結(jié)果顯示，利用ddPCR分別檢測(cè)酶切2 h和4 h的PUC57質(zhì)粒，結(jié)果與質(zhì)粒理論值進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.192、-0.403,P>0.05)。說(shuō)明ECORⅠ酶在孵育2 h后就可以把PUC57質(zhì)粒完全切開(kāi)，能保證酶切后質(zhì)粒通過(guò)ddPCR的檢測(cè)結(jié)果和質(zhì)粒的理論值一致，從而也保證了接下去的ddPCR性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。所以沒(méi)必要擔(dān)心酶切時(shí)間不足，質(zhì)粒酶切不完全而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這與文獻(xiàn)報(bào)道的時(shí)間相符[15]。

本研究利用ddPCR對(duì)酶切和沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒ddPCR幾乎沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，而酶切的PUC57質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果很好，兩者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.194,P<0.05)。酶切的PUC57質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果與PUC57質(zhì)粒理論值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.2,P>0.05)。究其原因，可能沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒是環(huán)狀容易形成超螺旋結(jié)構(gòu)，在高溫變性時(shí)雙鏈DNA不容易打開(kāi)，在低溫退火時(shí)引物和探針不能結(jié)合到模板鏈上，從而影響了擴(kuò)增效率。另一方面，可能是ddPCR自身原因?qū)е?。伯?lè)QX200TM微滴式數(shù)字PCR是將20 μL的反應(yīng)體系通過(guò)微滴發(fā)生器產(chǎn)生20 000個(gè)油包水的微滴，每個(gè)微滴只有1 nL。沒(méi)有酶切的PUC57質(zhì)粒含有2 806 bp，體積相對(duì)比較大，可能不容易形成微滴，從而降低了檢測(cè)結(jié)果。而酶切過(guò)的PUC57質(zhì)粒只有95 bp的目的基因片段，體積小容易形成微滴，所以檢測(cè)結(jié)果與PUC57質(zhì)粒理論值相符。

同時(shí)，本研究還對(duì)放置了不同時(shí)間的酶切PUC57質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，放置了2周和4周的酶切PUC57質(zhì)粒相比剛剛酶切的PUC57質(zhì)粒，其檢測(cè)值在逐漸降低，說(shuō)明酶切的PUC57質(zhì)粒隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，可能線(xiàn)性DNA模板又還原成環(huán)狀的模板，從而降低了擴(kuò)增效率，該假設(shè)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。例如對(duì)放置了2周和4周的酶切PUC57質(zhì)粒進(jìn)行核酸電泳，看在2 806 bp位置有沒(méi)有條帶出現(xiàn)，如果有說(shuō)明線(xiàn)性DNA模板已還原成環(huán)狀的模板，如果沒(méi)有就要分析其他原因，如95 bp的線(xiàn)性DNA片段自身發(fā)生了降解，具體原因還有待進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

ddPCR是一種靈敏和準(zhǔn)確的新型核酸定量方法，特別是在檢測(cè)低拷貝載量。在科研工作中經(jīng)常會(huì)用ddPCR檢測(cè)質(zhì)粒，本研究得出的結(jié)論是利用ddPCR檢測(cè)含有目的基因的PUC57質(zhì)粒時(shí)要先進(jìn)行酶切再檢測(cè)，酶切時(shí)間只需2 h即可將質(zhì)粒酶切完全，同時(shí)酶切的PUC57質(zhì)粒不宜放置過(guò)久，要盡快檢測(cè)。