一個毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)鑒定及表達模式分析

潘飛翔，湯定欽，周明兵,2

1 浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300

2 浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江農(nóng)林大學，浙江 杭州 311300

轉(zhuǎn)座子廣泛存在于真核生物基因組中，是基因組的主要組成成分。轉(zhuǎn)座子主要包括DNA轉(zhuǎn)座子和RNA轉(zhuǎn)座子，RNA轉(zhuǎn)座子又稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。長末端重復(fù)序列 (Long terminal repeat，LTR) 轉(zhuǎn)座子屬于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的一個大類，包含有Ty1-Copia、Ty3-Gypsy、Bel/Pao、Retroviridae、Caulimoviridae、LARD (Large retrotransposons derivatives) 和TRIM (Terminal-repeat retrotransposons in miniature) 7類[1]。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子兩種。自主轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)完整，具有自主轉(zhuǎn)座功能；而非自主轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)不完整，無法在單獨存在時轉(zhuǎn)座，只有在自主轉(zhuǎn)座子的協(xié)助下才能發(fā)生轉(zhuǎn)座。植物LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的長度通常在2–18 kb之間，兩端各有一個長度約100–5 000 bp正向重復(fù)的長末端重復(fù)序列(LTRs)，結(jié)構(gòu)通常為5′-TG…CA-3′。在5′和3′末端兩側(cè)通常具有4–6 bp的末端靶位點重復(fù)序列(Target site duplications，TSDs)[2]。LTRs不編碼蛋白質(zhì)，但包含轉(zhuǎn)錄的起始信號、終止信號和一些順式作用元件，而編碼區(qū)有1–3個開放閱讀框(ORF) 編碼轉(zhuǎn)座所需的酶類，主要包括2個與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因，即GAG (種屬特異抗原) 基因和POL (聚合酶) 基因。GAG基因編碼的蛋白質(zhì)(Retrotransposon gag protein，GAG) 參與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNA的成熟與包裝，使反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RNA整合到基因組。POL基因是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子復(fù)制和轉(zhuǎn)座所必需的基因，包括編碼蛋白酶基因(Pepsin-like aspartate proteases，AP)、整合酶基因(Integrase，INT)、反轉(zhuǎn)錄酶基因(Reverse transcriptases，RT) 和RNA酶基因 (Ribonuclease H，RH)[3-4]。

大量LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定存在于真核生物基因組內(nèi)，在受到逆境和甲基化水平的改變而激活轉(zhuǎn)座。短期鐵過量會導(dǎo)致日本晴幼苗內(nèi)部分LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達上調(diào)[5]，熱處理可以激活粟酒裂殖酵母中一類LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1[6]和擬南芥中的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子ONSEN[7]，激光輻射誘導(dǎo)水稻多個位點發(fā)生MITE類轉(zhuǎn)座子mPing轉(zhuǎn)座[8]，一些非生物因素 (如機械作用、水楊酸 (SA)、茉莉酮酸 (JA) 等) 可刺激Tto1轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座[9]，而活躍轉(zhuǎn)座子又被甲基化而沉默[10]。

LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組含量也非常豐富，其中Ty3-Gypsy類LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有24.6%，Ty1-Copia類LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有12.3%[11]，全部LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子占全部轉(zhuǎn)座子序列的一半以上，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入基因組的時間主要分布于200–500萬年前，晚于毛竹基因組四倍化的時間[12]。目前，本課題組已從毛竹基因組中克隆到6個全長的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 (Ph-LTR1、PHRE1、PHRE2、PHRE3、PHRE4和PHRE5)[13-14]，其中PHRE1、PHRE2和PHRE5能在逆境下轉(zhuǎn)錄激活，PHRE1和PHRE2還能在擬南芥異源轉(zhuǎn)座。

為了在毛竹中開發(fā)更多的活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，應(yīng)用于竹子誘變育種，本研究利用公布的毛竹基因組數(shù)據(jù)庫，選取了一個結(jié)構(gòu)完整、新近插入的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為研究對象，命名為Ph-LTR2(Phyllostachys edulisLTR retrotransposon 2)，并對Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)及在毛竹基因組的分布進行了系統(tǒng)分析，通過實時熒光定量PCR詳細調(diào)查Ph-LTR2在不同非生物脅迫下的表達模式，揭示不同脅迫與Ph-LTR2轉(zhuǎn)座活性的關(guān)系，為開發(fā)基于Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子標簽奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛竹幼葉、成熟葉和根以及筍均取自同一株毛竹 (栽種于浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗培育基地翠竹園)。

毛竹Phyllostachys edulis種子來自廣西靈川縣，采自當年同一棵開花毛竹所結(jié)的種子，經(jīng)培育獲得毛竹實生苗。

1.2 方法

1.2.1 毛竹基因組DNA與RNA的提取

實驗中所有種子均采用同一棵毛竹當年所結(jié)的種子。將毛竹種子分成未處理種子、甲基化抑制劑處理種子、輻照處理種子3類。

未處理種子選擇飽滿以及大小相近的種子，用蒸餾水沖洗1遍，用70%酒精消毒種子表面30 s，再用蒸餾水沖洗3遍，無菌蒸餾水浸種24 h以恢復(fù)種子活力。置于滅菌的雙層濾紙上萌發(fā)，25 ℃并全程黑暗，保持水分充足，2–3周后將幼苗轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)。種子萌發(fā)所需的營養(yǎng)土配比為：珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶1。萌發(fā)溫度為25 ℃。當幼苗生長到4至5片葉時，全部轉(zhuǎn)移到直徑90 cm的花盆中繼續(xù)生長。

選擇5-氮雜胞苷作為甲基化抑制劑，濃度設(shè)置50、150、250 μmol/L，共3個梯度。用70%酒精消毒種子表面30 s，無菌水沖洗3遍，用不同濃度氮雜胞苷浸種24 h。置于雙層濾紙床上發(fā)芽。種子萌發(fā)環(huán)境25 ℃，黑暗處理，使用不同濃度的氮雜胞苷代替滅菌水浸潤種子，2–3周后將幼苗移入溫室繼續(xù)培養(yǎng)4個月，培養(yǎng)條件同未處理。每個梯度采5株作為重復(fù)。

輻照劑量設(shè)置30、50、70 GY，共3個梯度。輻射源為浙江省農(nóng)業(yè)科學院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心提供的137Cs-γ。種子輻照后同未處理種子一樣，萌發(fā)發(fā)芽。

選取萌發(fā)90 d、長勢一致且健康的未處理毛竹種子幼苗 (幼苗處于8葉1心期) 分成對照、高鹽處理、高溫脅迫處理及低溫脅迫處理4組。對照組培養(yǎng)條件不變，不做任何處理。將NaCl配置成0.1、0.2、0.3 mol/L的溶液對毛竹實生苗澆灌3 d[15]，后續(xù)處理同對照組。將高溫組與低溫組實生苗分別置于42 ℃與4 ℃培養(yǎng)箱，分別處理4 h與16 h[16]，后續(xù)處理同對照組。

取對照組、輻照組、甲基化抑制劑組、高鹽處理組、高溫脅迫處理組及低溫脅迫處理組的葉片液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以毛竹嫩葉為實驗材料，通過CTAB法提取毛竹基因組DNA，檢測濃度后-20 ℃儲存。取對照組、輻照組、甲基化抑制劑組、高鹽處理組、高溫脅迫處理組及低溫脅迫處理組實生苗葉片，與來自同一株野外毛竹的葉 (成熟葉)、筍以及根，通過Trizol法提取總RNA，利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲存。

1.2.2 Ph-LTR2的生物信息學分析

根據(jù)Zhou等建立的毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫[17]，選取了一個結(jié)構(gòu)完整、新近插入的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為研究對象，命名為Ph-LTR2(Phyllostachys edulisLTRretrotransposon2)。為了分析Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的序列特征，利用NetGene2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetGene2/)工具查找Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子序列的外顯子，然后通過DNAMAN軟件將其翻譯為氨基酸序列，通過NCBI上的blastp在線比對確認，對轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)進行鑒定。

在Gypsy Database (http://www.gydb.org/index.php/Main_Page) 下載Ty3-gypsy各個家族的代表性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列 (Del亞家族的Del、Retrosat2、Peabody和Tma，CRM亞家族的CRM和Beetle1，Reina亞家族的Reina、lfg7、Gimli和Gloin，REM1亞家族的REM1，Ty1-Copia家族的Olco1)，與Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的RT氨基酸序列比對，利用MEGA6軟件中Neighbor-Joining方法構(gòu)建進化樹，分析其所在的轉(zhuǎn)座子家族。根據(jù)Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子序列在BambooGDB數(shù)據(jù)庫(http://www.bamboogdb.org/index.jsp) 中搜索Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組的分布。利用PlantCARE在線軟件分析了LTR序列中順式作用元件的組成。

在反轉(zhuǎn)錄過程中，單一模板合成LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端的LTR，所以在整合至基因組時，DNA序列是相同的。如果已知宿主的DNA替換速率，就可通過計算同一轉(zhuǎn)座子兩端LTR序列的分化度來估算轉(zhuǎn)座子的插入時間[18]。比對Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子兩端LTR序列的同源性，求得分化度K，用公式T= K/2r (r代表LTR序列的平均替換率，約為1.3×10–8bp/年[19]) 計算插入時間。

1.2.3 Ph-LTR2的基因序列克隆與cDNA序列克隆

以提取的毛竹基因組DNA為模板擴增Ph-LTR2的基因序列 (引物見表1)，PCR擴增反應(yīng)體系：DNA，1.0 μL；10×LA PCR緩沖液，5.0 μL；dNTPs，6.0 μL；Ph-LTR2-F，2.0 μL；Ph-LTR2-R，2.0 μL；LATaq，0.5 μL；ddH2O補充至50 μL。擴增參數(shù)：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 40 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用SIMGEN公司的凝膠DNA回收試劑盒回收，連接到pMD18-T載體，熱擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中，菌檢后-80 ℃保存。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primers

以毛竹筍cDNA為模板擴增Ph-LTR2的cDNA序列 (引物見表1)，PCR擴增反應(yīng)體系：cDNA，1.0 μL；10×LA PCR緩沖液，5.0 μL；dNTPs，6.0 μL；Ph-LTR2C-F，2.0 μL；Ph-LTR2C-R，2.0 μL；LATaq，0.5 μL；dd H2O 補充至50 μL。擴增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用SIMGEN公司的凝膠DNA回收試劑盒回收，經(jīng)杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH檢測

采用熒光定量PCR (qRT-PCR) 方法檢測Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH的表達水平。內(nèi)參基因選取參考文獻中的ACT2-2，命名為PheACT2[20]。分別在Ph-LTR2的RT序列、RH序列和INT序列設(shè)計引物 (表1)，根據(jù)不同引物在不同樣品中的值，按照2–ΔCt法 (無對照) 計算出Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH在不同部位的相對表達量[20]，按照2–ΔΔCt法 (有對照) 計算出不同處理下Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH的相對表達量。每個處理3組重復(fù)，每個重復(fù)3個樣本，最終結(jié)果的平均值繪成柱形圖，在SPSS軟件上采用LSD法分析各相對表達量與CK的顯著性差異，極顯著結(jié)果 (誤差水平小于1%) 在柱形圖上用星號表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子序列克隆與cDNA序列檢測

提取的毛竹基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；用紫外分光光度計測定濃度為1 000 ng/μL左右，OD260/OD280值在1.8–2.0之間。DNA質(zhì)量和純度都符合實驗要求，可用于后續(xù)實驗。

以毛竹基因組DNA為模板，通過PCR擴增Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子。Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子全長6 000 bp左右 (圖1的泳道3)。PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳確認條帶后割膠回收目的片段。

圖1 pMD18-Ph-LTR2菌落PCR電泳圖Fig.1 Colony PCR of pMD18-Ph-LTR2 in E. coil.M:marker; lane 1–2: negative control; lane 3: positive control; lane 4–7: positive colony.

將膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，菌落PCR (圖1) 驗證后將獲得的陽性克隆送往Invitrogen公司測序，測序驗證成功的質(zhì)粒命名為pMD18-Ph-LTR2，同時保存pMD18-Ph-LTR2的大腸桿菌菌液。

為驗證該轉(zhuǎn)座子是否能夠轉(zhuǎn)錄，以毛竹筍cDNA為模板，通過PCR擴增Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的cDNA序列。Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子ORF長度約為5 000 bp(圖2)。PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與基因組預(yù)測一致。

2.2 基因的序列分析

2.2.1 Ph-LTR2的結(jié)構(gòu)特征

Ph-LTR2全長6 030 bp，右端LTR長度為478 bp，左端LTR長度為489 bp，開放閱讀框含有轉(zhuǎn)座所需6種酶的編碼序列，結(jié)構(gòu)順序依次為5′-GAG-PR-RT-RH-INT-CHR-3′，根 據(jù) 結(jié) 構(gòu) 屬 于Ty3-Gypsy家族成員。

圖2 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子cDNA的PCR擴增電泳圖Fig.2 The PCR result of Ph-LTR2 transposon cDNA.M:marker; lane 1–4: the PCR result from the same P.edulis shoots cDNA.

Ph-LTR2全長序列如圖3所示，包括左端 LTR(L-LTR)、6種酶和右端LTR (LTR-R) 的序列及結(jié)構(gòu)。核苷酸序列編碼區(qū)含有4 971 bp的開放閱讀框，共編碼1 659個氨基酸。其中211–391位為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子GAG蛋白核心區(qū)，其編碼的蛋白主要負責反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNA的成熟和包裝，其保守性較差；第553–642位為PR蛋白酶核心區(qū)，水解酶存在于很多反轉(zhuǎn)錄病毒、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件中，參與反轉(zhuǎn)錄完成后，負責將多聚蛋白前體切割為功能性多肽；第780–934位為RT核心區(qū)，編碼反轉(zhuǎn)錄酶，能夠催化單鏈RNA或DNA合成DNA，是轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的必要條件；第1 049–1 163位為LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中Ty3-Gypsy家族RH核心區(qū)，編碼核糖核酸酶H，這是一種廣泛分布于原核生物和真核生物的水解酶，負責原始RNA模板的水解，RNA模板是病毒生命周期中逆轉(zhuǎn)錄過程后產(chǎn)生的RNA/DNA雜交體的一部分；第1 311–1 421位為INT結(jié)構(gòu)域，負責編碼整合酶，催化反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入宿主基因組；第1 608–1 651位為染色質(zhì)組織修飾域 (Chromatin organization modifier，CHR)，對染色質(zhì)的重構(gòu)及基因的表達起到重要作用。PBS序列為5′-TGTGTGGTATCAGAGCAAAC AGCAGATCC-3′，PPT的序列為5′-CAGAGTCGA TTTTCCAAATAGGGGGGATAT-3′。

Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的5′ LTR序列與3′ LTR序列非常相似 (圖4)，只有其中7個核苷酸序列不一致。LTR序列富含多種順式作用元件，包括：3個核心啟動元件TATA-box，3個啟動元件CAAT-box，1個與生長素相關(guān)的調(diào)控元件TGA，1個與脫落酸相關(guān)的調(diào)控元件ABRE，1個茉莉酸甲酯調(diào)控元件CGTGCA-motif，1個干旱反應(yīng)元件MBS(MYB binding site，MBS)，以上所有順式作用元件均已在圖4標出。

圖3 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of the Ph-LTR2.

圖4 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子LTR序列比對示意圖Fig.4 The alignment of LTR sequences of Ph-LTR2.

通過公式T=K/2r推導(dǎo)插入時間。Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子兩端LTR同源性為96.41%，計算得出插入時間均約為61.92萬年。

根據(jù)Ph-LTR2的結(jié)構(gòu)可以推測Ph-LTR2屬于Ty3-Gypsy家族，在Gypsy Database下載其他Ty3-Gypsy各亞家族代表序列，根據(jù)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)可知Ph-LTR2屬于Ty3-Gypsy的Reina亞家族 (圖5)。

2.2.2 Ph-LTR2在基因組的分布

通過Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子序列在毛竹數(shù)據(jù)庫的比對，共鑒定5個拷貝，以它們在scaffold的位置命名。分別為：PH01001192_35073-40113、PH01007203_7355-11931、PH01000426_369740-375716、PH01001071_150832-145883和PH01001876_177292-170516。其中PH01001876_177292-170516缺失部分右側(cè)LTR序列，PH01001192_35073-40113缺失GAG基因區(qū)，PH01007203_7355-11931缺失INT基因區(qū)，除PH01001876_177292-170516外所有拷貝均缺失全部或部分左右LTR序列 (圖6)。PH01000426_369740-375716和Ph-LTR2完全一致，是同一個拷貝。

2.3 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH的表達模式分析

在Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子6個結(jié)構(gòu)域中，選取了INT、RT和RH檢測它們的表達模式。比對INT、RT和RH在野生毛竹不同部位中的相對表達量，INT在根中相對表達量最高，葉片中略低于根，筍的相對表達量最低；RH在根里相對表達豐度最高，其次是葉，筍中表達最低；而RT在葉片中表達豐度最高，其次才是根，筍中表達同樣最低 (圖7)。三個結(jié)構(gòu)域在不同組織相對表達量差異極顯著。

圖5 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子進化樹Fig.5 Ph-LTR2 phylogenetic tree.

圖6 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子在基因組中的各拷貝序列比對圖Fig.6 The copy sequence alignment of Ph-LTR2 in P.edulis genome.

圖7 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH在不同部位相對表達量Fig.7 Relative expression level of INT, RT and RH of Ph-LTR2 in bamboo shoots, leaves and roots.Statistical significance was calculated using LSD t-test (*P<0.001).

在輻照處理過程中，INT、RT和RH的相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在30 GY處理的時候大幅上升，50 GY輻照下開始下降，70 GY時INT、RT和RH的相對表達量繼續(xù)下降，但幅度不大。其中RT的變化幅度最大，在30 GY的表達量上調(diào)最為明顯，漲幅達到了44倍，隨著輻射劑量增加，相對表達量下降的也最大，50 GY時下降為原來的3.03%，70 GY時降為30GY的2.18%；INT變化程度略小于RT，30 GY輻射處理組相對表達量上升明顯，漲幅為31倍，50 GY和70 GY的相對表達量相近，下降到30 GY時的9.82%和9.20%，幅度小于RT；RH表達水平變化不大，其他結(jié)構(gòu)域漲幅最大的30 GY只有對照組的1.3倍，50 GY和70 GY相對30 GY的下降程度也不大，只下降了22.96%和20.16%(圖8A)。

圖8 不同處理Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH相對表達量Fig.8 Relative expression level of INT, RT and RH of Ph-LTR2 in treatment bamboo seedlings.(A) Radiation treatment.(B) Methylation inhibitor treatment.(C) Different temperature stress.(D) Different concentrations of salt solution.Statistical significance was calculated using LSD t-test (*P<0.001).

在甲基化抑制劑處理組中，INT、RT和RH的相對表達量大致呈現(xiàn)上升趨勢，50 μmol/L濃度時相對表達量上升，150 μmol/L濃度時相對表達量較50 μmol/L濃度略微下降，在250 μmol/L的濃度處理下達到最高值。其中RT的相對表達量漲幅最大，尤其是250 μmol/L時遠高于其他結(jié)構(gòu)域，相對于對照組漲了8.3倍，差異極顯著；INT在50 μmol/L和150 μmol/L時與RT的相對表達量相近，250 μmol/L時上升，但程度低于RT，相對CK只漲了4.9倍，差異極顯著；RH在3個濃度的甲基化抑制劑處理中略微上升，150 μmol/L上升最少，50 μmol/L和250 μmol/L上升幅度相近，略大于150 μmol/L，但相對于其他兩個結(jié)構(gòu)域來說，上升的幅度非常低，3個濃度相對于對照組分別上升了1.6倍、1.2倍和1.6倍，差異均不顯著 (圖8B)。

在低溫處理組中，INT、RT和RH的相對表達量均升高，其中INT升高的幅度最大，相對于對照組上升了9.9倍，差異極顯著，RT其次，但升高幅度不大，只有1.6倍，差異不顯著，RH變化近似于RT，只上升1.2倍，同樣差異不顯著(圖8C)。而高溫處理組中，INT、RT和RH的相對表達量均大幅升高，上升幅度高于低溫處理組，INT升高的幅度最大，上升達11倍，差異極顯著，但相較于低溫處理結(jié)果變化不大，RT上升幅度雖然次于INT，上升達5倍，差異極顯著，但與低溫處理組相比，上升的幅度明顯，RH相較其他兩個結(jié)構(gòu)域依舊變化不大，但也可以明顯看出有所上調(diào)，漲幅達3倍，差異極顯著 (圖8C)。

在高鹽處理組中，INT、RT和RH的相對表達量基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在0.1 mol/L處理組中，INT、RT和RH的相對表達量達到最高值，分別達到對照組的62倍、5倍和52倍，在0.2 mol/L和0.3 mol/L處理組中持續(xù)下降，INT分別下降了36%和57%，RT下降了45%和75%，RH分別下降了62%和68%。其中INT與RH相對表達量變化相近，遠遠大于RT (圖8D)。

3 討論

本研究通過生物信息學技術(shù)和分子生物學手段鑒定一個典型的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ph-LTR2，該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)座所需的6種酶和高度相似LTR的序列，是一個結(jié)構(gòu)完整的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，且在毛竹筍cDNA中檢測到其表達，說明其具有表達活性。Ph-LTR2的LTR序列中富含順式調(diào)控元件，可能會在一些外界脅迫下激活轉(zhuǎn)座，可以作為毛竹基因標簽開發(fā)的候選轉(zhuǎn)座子。

3.1 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子是一個結(jié)構(gòu)完整、富含順式調(diào)控元件的轉(zhuǎn)座子

毛竹Ph-LTR2反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有完整的LTR序列及轉(zhuǎn)座必需的所有結(jié)構(gòu)域，包括左端 LTR、6個酶 (GAG、PR、RT、RH、INT、CHR) 和右端LTR，結(jié)構(gòu)完整，同時經(jīng)過實驗檢測，Ph-LTR2具有轉(zhuǎn)錄活性，這些都表明其可能具備轉(zhuǎn)座能力。

在植物基因組中，有報道過幾百萬年內(nèi)插入的LTR轉(zhuǎn)座子還存在活性，如小麥中的Wis_116F02-1、水稻中的Mtr6和Mtr76[21-23]。Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子5′LTR長478 bp，3′ LTR長489 bp，存在7個堿基突變，LTR序列同源為96.41%，插入時間約為61.92萬年。相較于插入時間為幾百萬年的活性LTR轉(zhuǎn)座子來說，Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子還屬于非常年輕的轉(zhuǎn)座子，可能依然具有活性。

Ph-LTR2的LTR序列中富含順式調(diào)控元件，包括：3個核心啟動元件TATA-box，3個啟動元件CAAT-box，1個茉莉酸甲酯調(diào)控元件CGTGCA-motif，1個與生長素相關(guān)的調(diào)控元件TGA，1個干旱反應(yīng)元件MBS，1個與脫落酸相關(guān)的調(diào)控元件ABRE。而茉莉酸甲酯、脫落酸、生長素調(diào)控元件和干旱反應(yīng)元件與外界環(huán)境變化有著重大關(guān)聯(lián)，因此可能會在一些外界脅迫下激活轉(zhuǎn)座。

3.2 Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子能夠響應(yīng)外界環(huán)境變化，改變INT、RT和RH的表達模式

1) 細胞DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性關(guān)系

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性與DNA甲基化密切相關(guān)。DNA甲基化是生物體應(yīng)對轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的一種手段，通過全基因甲基化分析，轉(zhuǎn)座子序列更容易被甲基化[24-25]。轉(zhuǎn)座子在植物內(nèi)會被甲基化而沉默[10,26]，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或染色質(zhì)重塑子DDM1缺失突變體中，一些轉(zhuǎn)座子被去甲基化而解除阻遏被激活[27-28]。甲基化水平在植物不同部位與不同時期也不同，一些生長發(fā)育旺盛的部位DNA甲基化程度高，而這些部位的部分轉(zhuǎn)座子活性往往受到抑制，如種子[29]、花藥[30]和莖尖[31]。

本研究的結(jié)果顯示甲基化抑制劑對Ph-LTR2反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活性有促進作用。甲基化抑制劑在一定程度上可以降低DNA的甲基化[32]，因此降低基因組的DNA的甲基化水平可能可以激活Ph-LTR2反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座行為。同時也發(fā)現(xiàn)筍期的Ph-LTR2反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活性被明顯抑制，這可能和筍期這個時期的甲基化水平變化有關(guān)。

2) 逆境與轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系

逆境脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)甲基化水平、內(nèi)源激素水平與離子濃度等各類生理生化水平的改變，這些改變會導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子活性的改變[5,10,33]。逆境脅迫過程中的生理生化水平改變的是一個整體，因此雖然部分實驗與調(diào)控元件關(guān)聯(lián)度不大，但是無法確定這些脅迫會不會以間接的途徑影響轉(zhuǎn)座子的活性，所以所有的逆境脅迫實驗都是必要的。

輻射作為一種現(xiàn)今常用的育種手段，其對轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座具有一定影響。有研究顯示，γ射線會激活水稻mPing等內(nèi)源轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，以及導(dǎo)致DNA甲基化變異[34]，本實驗結(jié)果顯示低劑量的輻射會上調(diào)Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的活性。而隨著劑量增加Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的活性隨之下降，推測其原因是高劑量的輻射對植物體的傷害太大，對植物造成的破壞已經(jīng)超過植物本身應(yīng)對能力[35]。

低溫和高溫脅迫都是植物常見的脅迫，這些脅迫會使植物生理發(fā)生變化[36-39]。實驗結(jié)果顯示Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子INT、RT和RH的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(圖8C) ，Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子的LTR區(qū)域含有豐富的順式調(diào)控元件，不適宜植物生長的溫度可能導(dǎo)致毛竹的一些轉(zhuǎn)錄因子表達增強，如抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF1、DREB1、MYB和WRKY表達量上升[40]，這些轉(zhuǎn)錄因子有一定幾率與Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子順式調(diào)控元件結(jié)合，調(diào)控Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄水平。

植物在鹽脅迫下，體內(nèi)一氧化氮和茉莉酸積累[41]，甲基化水平也會降低[42]，這有一定概率是Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子在不同濃度鹽脅迫下INT、RT和RH均有不同程度升高的原因 (圖8D)，這些變化在某種程度上導(dǎo)致Ph-LTR2轉(zhuǎn)座子活性的改變。

4 結(jié)論

本研究通過對Ph-LTR2的結(jié)構(gòu)、進化及不同脅迫下的表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)Ph-LTR2的活性具有組織特異性，且會被甲基化抑制劑激活，證明Ph-LTR2在植物體中會因甲基化而沉默，同時在高鹽、高溫、低溫和輻射脅迫下活性均有上升，證明脅迫會促進Ph-LTR2轉(zhuǎn)座，這可能與這些脅迫會導(dǎo)致甲基化水平改變有關(guān)。而數(shù)量眾多的順式作用元件也從另一個角度證明Ph-LTR2是一個對外界環(huán)境變化敏感的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。