大氣壓冷等離子體對(duì)大鼠凝血功能的影響

張克英 ，陳啟亮 ，芮剛 ，武霄錚 ，郭玲 ，張俊平 ，劉志強(qiáng) ，李和平 ，丁桂榮

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系輻射防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室，陜西西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院三大隊(duì)二中隊(duì)，陜西西安710032；3.中國(guó)人民解放軍78506部隊(duì)，四川成都610000；4.華北理工大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，河北唐山063210；5.清華大學(xué)工程物理系，北京100084；6.特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710032

前言

等離子體通常是一種離子化的氣體狀物質(zhì)，被認(rèn)為是獨(dú)立于固、液、氣之外的物質(zhì)第四態(tài)，按照粒子的溫度可將等離子體分為兩大類(lèi)，熱平衡等離子體（或熱等離子體）和非熱平衡等離子體（或冷等離子體）［1］。其中，熱等離子體具有較高的能量密度，粒子溫度可達(dá)10 000-20 000 K的數(shù)量級(jí)，故被廣泛用于銅、鋁、鈦、鎳等金屬材料的高溫熔煉［2］，非金屬材料的熱熔化和納米材料的制備等；而冷等離子體則被用于材料表面改性、清潔活化、高效滅菌和加速化學(xué)反應(yīng)等。

出血作為最常見(jiàn)的創(chuàng)傷表現(xiàn)形式，是創(chuàng)傷早期患者死亡的主要原因之一［3］。內(nèi)臟出血、腔道出血等隱匿性出血，目前多采用介入手術(shù)栓塞血管、出血點(diǎn)套扎等方式，手術(shù)難度較大。既往研究顯示，熱等離子體可以通過(guò)熱效應(yīng)使蛋白變性和血液干燥從而達(dá)到凝血的目的［4］，但熱等離子體在發(fā)揮凝血作用的同時(shí)可引發(fā)出血部位的灼痛感，甚至造成周?chē)M織的燒傷和傷口的延遲愈合［5］。據(jù)報(bào)道，大氣壓冷等離子體（Cold Atmospheric Plasma,CAP）可以加速血液凝固并促進(jìn)傷口愈合，且不會(huì)對(duì)周?chē)M織造成損傷，該研究結(jié)果為出血性疾病治療提供了新的方法和思路［6-7］。本研究從體外血滴實(shí)驗(yàn)不同參數(shù)CAP對(duì)凝血效果的影響以及動(dòng)物出血模型兩個(gè)方面展開(kāi)CAP促凝血現(xiàn)象的驗(yàn)證，并通過(guò)抗凝血滴對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量（250±20）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=11）和CAP處理組（n=11）。動(dòng)物飼養(yǎng)在22～24℃的恒溫環(huán)境中，濕度保持在40%～70%，保證12 h/d的光照并避免噪音，飼養(yǎng)期間所有動(dòng)物可自由攝取水和食物。所有實(shí)驗(yàn)均獲得第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 CAP裝置

本實(shí)驗(yàn)采用的CAP裝置由清華大學(xué)工程物理系研制，該裝置以氦氣作為氣體源，采用介質(zhì)阻擋放電方式產(chǎn)生CAP射流，其中含有OH、N2、He、O、NO、N2+等活性離子。

1.3 血滴實(shí)驗(yàn)

大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.45 mg/kg）腹腔注射麻醉，在距大鼠尾部末端約2 mm處剪斷其尾巴，然后立即用無(wú)菌離心管收集血液并吸取100μL血液滴于載玻片中央。將制備好的血滴玻片隨機(jī)分為Control組（n=3）和CAP處理組（n=3）。CAP處理組立即采用不同作用距離（1、2、3 cm），不同放電電壓（3.33、6.73、8.03 kV）和不同作用時(shí)間（30、60、120 s）的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時(shí)采集血滴圖片，分析血滴凝固效果。

1.4 出血模型實(shí)驗(yàn)

1.4.1 尾部出血模型將大鼠按照上述方法麻醉，在距大鼠尾部末端約5 mm處剪斷尾巴建立此出血模型［8］，之后立即采用正常血滴實(shí)驗(yàn)篩選的CAP最佳凝血參數(shù)（放電電壓8.03 kV、照射時(shí)間120 s、照射距離1 cm）處理出血部位，通過(guò)記錄出血時(shí)間和出血量（濾紙吸收血液后濕重-濾紙干重）評(píng)價(jià)CAP的凝血效果［9］。Control組暴露于空氣中不做任何處理。

1.4.2 腳趾出血模型在距大鼠左前足最外側(cè)腳趾末端約1 mm處剪斷腳趾建立此出血模型。之后，采用與尾部出血模型相同的CAP參數(shù)研究其對(duì)大鼠腳趾出血的干預(yù)效果。

1.4.3 股靜脈出血模型將大鼠仰臥位固定于無(wú)菌操作臺(tái)上，剔除大鼠左側(cè)腹股溝毛發(fā)，碘伏消毒皮膚后暴露并分離股靜脈，用6號(hào)針頭45°穿刺股靜脈，建立股靜脈出血模型［10］。采用與尾部出血模型相同的方式觀(guān)察CAP對(duì)大鼠股靜脈出血的干預(yù)效果。

1.5 抗凝血滴實(shí)驗(yàn)

將大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.45 mg/kg）腹腔注射麻醉，之后做“U型”皮膚切口，剪斷肋骨并充分暴露心臟，利用無(wú)菌注射器于左心室抽取6 mL血液，并用枸櫞酸鈉對(duì)抽取的血液作抗凝處理。吸取抗凝血100μL滴于載玻片中央，采用放電電壓8.03 kV、處理時(shí)間120 s和作用距離為1 cm的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時(shí)采集血滴圖片，并分析血滴凝固效果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，出血時(shí)間、出血量采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05認(rèn)為結(jié)果有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CAP促進(jìn)血滴凝固的距離效應(yīng)

不同CAP作用距離結(jié)果顯示，Control組血滴表面形態(tài)未發(fā)生明顯變化（圖1a）。與對(duì)照組相比，當(dāng)放電電壓為8.03 kV，處理時(shí)間為120 s，作用距離為1 cm時(shí)，CAP處理組血滴表面變得干燥且有殼樣物形成，其表面可見(jiàn)酒窩樣凹陷（圖1b）；當(dāng)放電電壓和處理時(shí)間不變，作用距離增加至2 cm時(shí)，CAP組血滴表面干燥程度顯著降低，凹陷數(shù)量明顯減少（圖1c）；當(dāng)作用距離增加至3 cm時(shí)，可見(jiàn)CAP組僅血滴周?chē)休p度凝固，血滴表面未見(jiàn)明顯凹陷（圖1d）。上述結(jié)果提示，CAP具有明顯促進(jìn)血滴凝固的作用，并且與CAP作用距離呈負(fù)相關(guān)。

圖1 CAP促進(jìn)正常血滴凝固的距離效應(yīng)Fig.1 Effect of treatment distance of cold atmospheric plasma(CAP)on blood coagulation

2.2 CAP促進(jìn)血滴凝固的時(shí)間效應(yīng)

Control組血滴暴露于空氣中5 min后其表面形態(tài)幾乎沒(méi)有變化，中央?yún)^(qū)依然光滑透亮（圖2a）。與對(duì)照組相比，當(dāng)放電電壓為8.03 kV，作用距離為1 cm，處理時(shí)間為30 s時(shí)，CAP處理組的血滴表面變得干燥，可見(jiàn)細(xì)小的殼樣物與酒窩樣凹陷（圖2b）；當(dāng)放電電壓和作用距離不變，作用時(shí)間延長(zhǎng)至60 s時(shí)，CAP處理組的血滴表面干燥程度顯著增加，血滴表面凹陷數(shù)量明顯增多、凹陷面積明顯增大（圖2c）；當(dāng)放電電壓和作用距離不變，作用時(shí)間增加至120 s時(shí)，可見(jiàn)CAP組血滴表面大部分區(qū)域變成殼樣物，凹陷數(shù)量進(jìn)一步增多（圖2d）。上述結(jié)果提示，CAP具有明顯的促進(jìn)血滴凝固作用，并且隨著CAP作用時(shí)間呈正相關(guān)。

圖2 CAP促進(jìn)血滴凝固的時(shí)間效應(yīng)Fig.2 Effects of treatment duration of CAP on blood coagulation

2.3 CAP促進(jìn)血滴凝固的電壓效應(yīng)

Control組血滴暴露于空氣中5 min后血滴形態(tài)幾乎沒(méi)有變化，中央?yún)^(qū)光滑透亮（圖3a）。與Control組相比，當(dāng)CAP處理時(shí)間為120 s，作用距離為1 cm，放電電壓為3.33 kV時(shí)，CAP組血滴邊緣變得干燥且有凹陷形成，血滴中央依然光滑透亮（圖3b）；當(dāng)CAP作用時(shí)間和作用距離不變，放電電壓增加為6.73 kV時(shí)，CAP組血滴大部分區(qū)域變得干燥形成殼樣物，血滴表面出現(xiàn)許較多細(xì)小凹陷，血滴中央仍可見(jiàn)小范圍光滑透亮區(qū)（圖3c）；當(dāng)作用時(shí)間和作用距離保持不變，放電電壓增加為8.03 kV時(shí)，CAP組血滴表面殼樣物范圍增大，表面凹陷增多（圖3d）。上述結(jié)果提示，CAP可顯著促進(jìn)血滴凝固，并且與CAP放電電壓呈正相關(guān)。

2.4 CAP對(duì)大鼠不同部位出血的凝血效果

與Control組相比，CAP組大鼠尾部、腳趾、股靜脈的出血時(shí)間和出血量均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。上述結(jié)果提示，CAP可以加速動(dòng)物不同部位出血的凝血過(guò)程。

2.5 CAP對(duì)抗凝血滴的凝固作用

在觀(guān)察時(shí)間內(nèi)，Control組血滴形態(tài)幾乎沒(méi)有變化（圖5a）。與Control組相比，CAP組血滴表面變得干燥、血滴表面酒窩樣凹陷明顯增多（圖5b）。上述結(jié)果提示，CAP可以明顯促進(jìn)枸櫞酸鈉抗凝血滴的凝固。

圖3 CAP促進(jìn)血滴凝固的電壓效應(yīng)Fig.3 Effect of discharge voltages of CAP on blood coagulation

圖4 CAP對(duì)大鼠不同部位出血的凝血效果Fig.4 Coagulation effect of CAP in rat models with different bleeding sites

圖5 CAP對(duì)抗凝血滴的凝固作用Fig.5 Effect of CAP on anticoagulant blood

3 討論

本論文研究所采用的CAP射流是外加電場(chǎng)電離稀有氣體后產(chǎn)生的含有大量帶電粒子、活性自由基、激發(fā)態(tài)中性粒子及光子等的第四類(lèi)物質(zhì)狀態(tài)，其中的活性成分具有誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡［11］、調(diào)節(jié)細(xì)胞聚集粘附與增殖［12］、加速化學(xué)反應(yīng)［13］等功能。既往實(shí)驗(yàn)室研究顯示，CAP可以促進(jìn)血液樣本快速凝固，其機(jī)制可能與CAP中的氧自由基加速凝血化學(xué)反應(yīng)有關(guān)［14］。另?yè)?jù)報(bào)道，與傳統(tǒng)電凝止血相比，低溫等離子體對(duì)腺樣體肥大手術(shù)中的出血具有良好止血效果［6］。Fridman等[5]也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，即CAP可以顯著促進(jìn)脾臟切口的血液凝固，且不產(chǎn)生明顯的組織損傷。

本研究為了篩選和探討常壓冷等離子體對(duì)血液凝固的影響并篩選其最佳參數(shù)，初步探討其作用機(jī)制，首先觀(guān)察了CAP對(duì)血滴凝固的影響。結(jié)果顯示，CAP可以明顯促進(jìn)血滴凝固，主要表現(xiàn)為血滴表面殼樣物和酒窩樣凹陷形成以及干燥程度增加［15］。并且，CAP促凝血作用與CAP的處理時(shí)間、作用距離和放電電壓密切相關(guān)，該結(jié)果與Kuo等［15］的研究結(jié)果一致。進(jìn)而，筆者采用血滴實(shí)驗(yàn)篩選確定的CAP最佳凝血參數(shù)，觀(guān)察CAP對(duì)大鼠不同部位出血的促凝效果，發(fā)現(xiàn)與Control組相比CAP組大鼠尾部、腳趾和股靜脈的出血時(shí)間明顯縮短，出血量明顯降低，提示CAP對(duì)體外血滴具有明顯的促凝作用，對(duì)動(dòng)物不同部位出血也具有明顯的凝血作用，該結(jié)果與Fridman［5］和 Kalghatgi［7］的研究結(jié)果一致。

隨后筆者利用CAP處理枸櫞酸鈉抗凝的血滴，結(jié)果顯示，CAP可以明顯促進(jìn)抗凝血滴凝固。已有研究表明，枸櫞酸根離子可與血中的Ca2+相結(jié)合，形成不易離解的可溶性絡(luò)合物，通過(guò)降低血液中Ca2+濃度，抑制凝血。既往認(rèn)為，等離子體可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)提高血液中Ca2+濃度，進(jìn)而促進(jìn)血液凝固［16］。然而，最新研究顯示，等離子體處理血液后，其pH值與Ca2+濃度均無(wú)顯著變化，提示CAP促進(jìn)血液凝固，特別是枸櫞酸鈉抗凝血液凝固可能不是通過(guò)增加Ca2+濃度發(fā)揮作用［7］。考慮到Ca2+參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凝血酶原激活物形成和凝血酶形成過(guò)程，但不參與纖維蛋白形成，筆者認(rèn)為，CAP可能主要是通過(guò)促進(jìn)纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化而加速凝血過(guò)程。該推測(cè)與既往報(bào)道一致，即Kalghatgi等［7］利用等離子體處理人工合成的纖維蛋白原溶液后，溶液逐漸渾濁，提示等離子體可以啟動(dòng)纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化。

綜上所述，我們認(rèn)為CAP可以加速血液凝固并增強(qiáng)其凝血效果，該過(guò)程可能與CAP促進(jìn)纖維蛋白原向?yàn)槔w維蛋白轉(zhuǎn)化有關(guān)。