李進(jìn) 張培培 姚尚辰 胡昌勤

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)容易誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，從而嚴(yán)重影響藥物的安全性[1-4]。隨著生產(chǎn)工藝水平的提高，藥品生產(chǎn)過(guò)程控制日益嚴(yán)格，源于發(fā)酵工藝的外源性雜質(zhì)，如殘留蛋白、核酸 、多糖及其與抗生素的結(jié)合產(chǎn)物等[5]，現(xiàn)在已得到有效控制，但是內(nèi)源性的聚合物雜質(zhì)可在藥品原料與制劑生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)過(guò)程中產(chǎn)生，目前仍是影響藥物安全性的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。為保證藥品的安全性，對(duì)抗生素藥物中的聚合物雜質(zhì)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制。

隨著色譜分離技術(shù)的發(fā)展，聚合物的質(zhì)控手段在不斷進(jìn)步，目前已報(bào)道的方法主要包括葡聚糖凝膠G10色譜法(Sephadex G10)、高效凝膠色譜法(HPSEC)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、毛細(xì)管電泳法(HPCE)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、柱切換技術(shù)、離子交換法等[6]。聚合物質(zhì)控的理念逐漸由控制聚合物的總量向精準(zhǔn)控制指針性聚合物雜質(zhì)的方向發(fā)展[7]。在中國(guó)藥典2015年版二部中，一共收錄了26種頭孢菌素類抗生素。其中12種采用葡聚糖G-10系統(tǒng)控制聚合物雜質(zhì)；部分品種采用高效凝膠色譜法控制聚合物雜質(zhì)，包括頭孢米諾、頭孢地嗪。

頭孢拉定為第一代半合成頭孢菌素，國(guó)家基本藥物，具有耐酸、耐酶、吸收好、血藥濃度高等優(yōu)點(diǎn)，臨床主要用于治療呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮膚軟組織感染等。中國(guó)藥典中頭孢拉定的聚合物的質(zhì)控方法為葡聚糖凝膠G10色譜法[8]，美國(guó)藥典41版[9]未收載該品種，歐洲藥典(EP)9.0版[10]中未設(shè)定頭孢拉定聚合物控制項(xiàng)。

傳統(tǒng)葡聚糖凝膠G-10系統(tǒng)存在柱效較低、操作不方便、分離時(shí)間長(zhǎng)、分離度差等不足，少數(shù)頭孢菌素類抗生素采用了高效凝膠色譜法控制聚合物雜質(zhì)的總量。國(guó)外藥典雖然未設(shè)定專門的聚合物檢查項(xiàng)，但是在部分具體品種的有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下，如阿莫西林、頭孢噻肟鈉等采用RP-HPLC方法控制其中的二聚體、三聚體等，但是該類方法能否檢出更高聚合態(tài)的聚合物雜質(zhì)缺乏方法專屬性研究。在前期研究中，已對(duì)青霉素類抗感染藥物聚合物雜質(zhì)做過(guò)研究工作，證明采用中國(guó)藥典2015年版的RP-HPLC有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法可對(duì)指針性聚合物雜質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)控制[11-12]。本文首先采用高效凝膠色譜法(HPSEC)和柱切換-LC/MS法對(duì)頭孢拉定聚合物進(jìn)行分離及初步定性分析；然后以EP9.0頭孢拉定有關(guān)物質(zhì)分析方法為基礎(chǔ)，優(yōu)化建立了頭孢拉定的聚合物分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，進(jìn)而為頭孢菌素類抗生素聚合物的精準(zhǔn)控制提供了可借鑒的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

二維色譜系統(tǒng)為Summit 100型，包括P680型雙三元低壓梯度泵、ACI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器、Tcc-100型柱溫箱及PDA-100型二極管陣列檢測(cè)器組成，工作站為Chromeleon 6.8版(美國(guó)Dionex公司)；柱切換LC-MS系統(tǒng)由資生堂HPLC色譜系統(tǒng)(包括Nano Space S1-2二元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、切換閥和PDA檢測(cè)器 )和Qtrap 3200型MS/MS質(zhì)譜儀(美國(guó)ABsciex公司)組成，工作站為Analyst 1.6版；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-215V。

1.2 樣品與試劑

頭孢拉定原料(批號(hào)：130588-201202)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，其他化學(xué)試劑(分析純)，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，水為實(shí)驗(yàn)室自制雙蒸水。

1.3 高效凝膠排阻色譜(HPSEC)法

色譜柱TSK-gel G2000SWxl(填料：剛性、球形、親水硅膠；7.8mm×30cm，5μm)；流動(dòng)相：A相：磷酸鹽緩沖液(pH7.0)[0.01mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]，B相：乙腈，A:B=85:15，等度洗脫；流速：0.7mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：233nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。稀釋溶劑：水；樣品濃度：10.0mg/mL。用于HPSEC法分析聚合物雜質(zhì)。

1.4 RP-HPLC法

色譜柱：Agilent ZORBAXS-BC18(4.6mm×150mm，5μm)，PN:883975-902，SN：USCM040539, LN:B14172；流動(dòng)相：A相：2.72g/L磷酸氫二鉀溶液(用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值=3.0)；B相：甲醇，梯度洗脫0～2.5min，A相由99.5%降低至97.0%，2.5～11.0min降低A相至75%，11.0～13.0min降低A相為60%，13.0～16.0min維持A相為60%，16.0～19.0min降低A相至20%，19.0～30.0min維持A相為20%，30.0～30.1min升高A相至99.5%，30.1～35.0min維持A相為99.5%；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm。用于分析頭孢拉定原料及制劑中的指針性聚合物雜質(zhì)。

1.5 二維色譜(2D-HPLC)法

色譜系統(tǒng)I同“1.3”項(xiàng)高效凝膠色譜法；色譜系統(tǒng)II同“1.4”項(xiàng)RP-HPLC優(yōu)化法。切換閥的連接方式如圖1所示，切換程序：①將切換閥設(shè)為A位置，采用右泵，以TSK凝膠色譜系統(tǒng)(色譜系統(tǒng)I)對(duì)供試品進(jìn)行分離，同時(shí)采用色譜系統(tǒng)II對(duì)RP C18色譜柱進(jìn)行平衡。②當(dāng)采用色譜系統(tǒng)I分離的目標(biāo)雜質(zhì)出峰后，將切換閥設(shè)為B位置。③采用色譜系統(tǒng)II將柱后定量環(huán)中的目標(biāo)雜質(zhì)洗脫至第二根色譜柱中，并采用色譜系統(tǒng)II進(jìn)行分離分析。用于對(duì)HPSEC色譜系統(tǒng)分離的聚合物雜質(zhì)在RP-HPLC色譜系統(tǒng)中進(jìn)行定位。

1.6 柱切換-LC/MS-I法

色譜系統(tǒng)III：同“1.3”項(xiàng)色譜系統(tǒng)，進(jìn)樣體積增加至50μL，用于雜質(zhì)的分離。

色譜系統(tǒng)IV：色譜柱：KromasiL 100-5，C18(SN:E68355，4.6mm×250mm，5μm)。流動(dòng)相：A相：含有1%甲酸的水溶液；B相：含有1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫：0～(tR+5min)(tR為目標(biāo)雜質(zhì)在色譜系統(tǒng)III的保留時(shí)間)維持100%的A相(脫鹽處理)，(tR+5)～(tR+20)min 將A相降低至10%，(tR+20)～(tR+25)min維持A相為10%，(tR+25)min ～(tR+26)min升高A相至100%，(tR+26)～(tR+40)min，維持A相100%。柱溫：室溫；流速：0.5mL/min。切換閥：六通閥A和B；切換用定量環(huán)體積：500μL；用于對(duì)高效凝膠色譜系統(tǒng)分離的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行脫鹽處理、質(zhì)譜定性研究。

1.7 柱切換-LC/MS-II法

色譜系統(tǒng)V：同“1.4”項(xiàng)色譜系統(tǒng)，進(jìn)樣體積增加至50μL，用于雜質(zhì)的分離。

色譜系統(tǒng)VI：同色譜系統(tǒng)IV，其中tR為目標(biāo)雜質(zhì)在色譜系統(tǒng)V的保留時(shí)間。用于對(duì)RP-HPLC色譜系統(tǒng)分離的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行脫鹽處理、質(zhì)譜定性研究。

1.8 質(zhì)譜條件(“1.6”和“1.7”項(xiàng)的質(zhì)譜方法)

+EMS和+EPI掃描范圍：m/z200～1700；氣簾氣：20L/min；離子源電壓：+5000V；離子源溫度：400.00℃；氣路1：65L/min；氣路2：60L/min；碰撞氣強(qiáng)度：強(qiáng)；解簇電壓：+70.0V；入口電壓：+10.0V；碰撞室入口電壓：+10.00V；碰撞能：+10.00V：碰撞室出口電壓：+0.00V。

1.9 溶液配制

頭孢拉定強(qiáng)制降解物：取頭孢拉定供試品約500mg，置于玻璃試管中，加2mL氯仿，再加0.4mL三乙胺，振搖3min后，密封保存。室溫靜置24h，待完全溶解后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃水浴中蒸干溶劑，密封避光保存，作為頭孢拉定強(qiáng)制降解物。

圖1 2D-HPLC中10孔切換閥示意圖Fig.1 Schemes of the 10-hole switching valve in 2D-HPLC

頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液：稱取上述頭孢拉定強(qiáng)制降解物適量，加水溶解并定量稀釋成約含有10mg/mL的溶液，搖勻備用，作為頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液，備用。

方法學(xué)驗(yàn)證用溶液：精密稱取頭孢拉定強(qiáng)制降解物適量，加水溶解并定量稀釋成濃度約為5mg/mL的溶液，作為方法學(xué)驗(yàn)證溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效凝膠色譜法(HPSEC)分析頭孢拉定聚合物

本研究首先參照中國(guó)藥典2015年版二部中頭孢地嗪有關(guān)物質(zhì)II的方法[13]，建立了TSK G2000 SWxL高效凝膠排阻色譜法(HPSEC)，對(duì)頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液進(jìn)行初步分離。結(jié)果顯示，在頭孢拉定主峰前檢出若干個(gè)弱保留值雜質(zhì)HPSEC-1～5等；其中HPSEC-1、2、3未能完全分離，參見(jiàn)圖2b；故在中國(guó)藥典方法基礎(chǔ)上，改變流動(dòng)相中強(qiáng)溶劑的比例，對(duì)HPSEC法進(jìn)行方法優(yōu)化，結(jié)果如圖2a、c和d所示。當(dāng)流動(dòng)相A:B=85:15時(shí)，弱保留值雜質(zhì)HPSEC-1與HPSEC-2、HPSEC-3達(dá)到基線分離，但是各弱保留值雜質(zhì)色譜峰拖尾嚴(yán)重，部分色譜峰還存在肩峰，分離效果較差。

2.2 柱切換-LC/MSn法鑒別頭孢拉定聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

以頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液為供試品，采用“1.3”項(xiàng)的優(yōu)化后高效凝膠色譜法，在頭孢拉定主峰前分離得到弱保留值雜質(zhì)HPSEC-1～5，其中包括聚合物雜質(zhì)和小分子雜質(zhì)，然后采用柱切換-LC/MS-I法(參見(jiàn)“1.6”項(xiàng))法鑒別各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.2.1 弱保留值雜質(zhì)HPSEC-1

柱切換-LC/MS結(jié)果表明HPSEC-1中包含多種小分子雜質(zhì)，不是聚合物雜質(zhì)。

2.2.2 弱保留值雜質(zhì)HPSEC-2和3

圖2 HPSEC法分析頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of cefradine stress degradation solution by HPSEC

弱保留值雜質(zhì)HPSEC-2和3的TIC圖、+EMS圖及+EPI@m/z699.4[M+H]+的二級(jí)質(zhì)譜如圖3a所示。+EMS圖均顯示m/z699.5、m/z721.3的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰，推測(cè)其分子量為698.2，是頭孢拉定分子量的2倍，提示其為頭孢拉定二聚體，形成機(jī)理推測(cè)為一分子頭孢拉定7位側(cè)鏈的氨基，與另一分子頭孢拉定母核四元內(nèi)酰胺環(huán)的羰基反應(yīng)，形成酰胺鍵從而聚合形成二聚體。HPSEC-1和HPSEC-2的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖基本一致，提示二者互為同分異構(gòu)體。異構(gòu)化的反應(yīng)機(jī)理推測(cè)為頭孢拉定在堿性條件下發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)時(shí)6位和7位的手性碳構(gòu)型發(fā)生改變，從而發(fā)生異構(gòu)化，形成頭孢拉定異構(gòu)體，理論上存在4種異構(gòu)體。頭孢拉定二聚體及其異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖4a。質(zhì)譜分析結(jié)果證明弱保留值雜質(zhì)HPSEC-2和HPSEC-3為頭孢拉定二聚體。

2.2.3 弱保留值雜質(zhì)HPSEC-4

弱保留值雜質(zhì)HPSEC-4的TIC圖、+EMS圖及+EPI@m/z1048.6[M+H]+的二級(jí)質(zhì)譜如圖3b所示。+EMS圖存在m/z1048.6、m/z1070.4的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰，提示其分子量為1047.6，為頭孢拉定分子量的3倍，推測(cè)為頭孢拉定三聚體，理論上也應(yīng)存在多種異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4b。

2.2.4 弱保留值雜質(zhì)HPSEC-5

弱保留值雜質(zhì)HPSEC-5的TIC圖、+EMS質(zhì)譜數(shù)據(jù)如圖3c所示。+EMS圖顯示m/z 1397.8的準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H]+峰，提示其分子量為1396.8，為頭孢拉定分子量的4倍，推測(cè)為頭孢拉定四聚體，理論上推測(cè)也存在多種異構(gòu)體。化學(xué)結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖4c。

2.3 RP-HPLC法分析頭孢拉定的聚合物雜質(zhì)

高效凝膠色譜法分析頭孢拉定聚合物雜質(zhì)的方法專屬性較差，因此我們嘗試建立了RP-HPLC法，并采用二維色譜法和柱切換-LC/MS法對(duì)RP-HPLC的專屬性進(jìn)行研究。

2.3.1 建立RP-HPLC法分離聚合物雜質(zhì)

在EP9.0頭孢拉定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)增大有機(jī)相的比例，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間的方法，優(yōu)化建立了聚合物分析的RP-HPLC法，具體方法參見(jiàn)“1.4”項(xiàng)，RP-HPLC法分析頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液的典型色譜圖如圖5所示。

2.3.2 二維色譜法驗(yàn)證RP-HPLC法分離聚合物雜質(zhì)的專屬性

圖3 HPSEC-2～5的+EMS(1)與+EPI(2)質(zhì)譜圖Fig.3 +EMS(1)and +EPI(2)mass spectra of impurities HPSEC-2～5

圖4 強(qiáng)制降解溶液中聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structures of polymer impurities in stress degradation solution

圖5 頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液的典型RP-HPLC圖Fig.5 Typical chromatograms of cefradine stress degradation solution by RP-HPLC

圖6 雜質(zhì)HPSEC-2～5與強(qiáng)制降解溶液的典型二維色譜圖Fig.6 Typical two-dimensional chromatograms of impurityHPSEC-2～5 and stress degradation solution

為了考察RP-HPLC法分離聚合物雜質(zhì)的專屬性，本文采用二維色譜法(“1.5”項(xiàng))，將高效凝膠色譜法分離的聚合物雜質(zhì)HPSEC-2～4，轉(zhuǎn)移至RPHPLC系統(tǒng)中進(jìn)行分析，歸屬各種聚合物雜質(zhì)的出峰位置，如圖6所示。結(jié)果顯示頭孢拉定二聚體、三聚體、四聚體在RP-HPLC系統(tǒng)中的出峰時(shí)間均為20.0～22.0min，其中HPSEC-2色譜峰在反相系統(tǒng)中分離為3個(gè)色譜峰，HPSEC-3和HPSEC-4在反相系統(tǒng)中均分離為多重色譜峰，這與前期推斷頭孢拉定聚合物存在多種異構(gòu)體的結(jié)論相吻合。因此，頭孢拉定強(qiáng)制降解物的RP-HPLC典型圖譜中20.0～22.0min的一組色譜峰可以初步歸屬為頭孢拉定聚合物雜質(zhì)，聚合物雜質(zhì)出峰集中，且不受其他降解的小分子雜質(zhì)干擾，初步說(shuō)明建立的RP-HPLC分析頭孢拉定聚合物雜質(zhì)的專屬性較好。

2.3.3 柱切換-LC/MS法驗(yàn)證RP-HPLC法分離聚合物雜質(zhì)的專屬性

為了確認(rèn)RP-HPLC法分析聚合物雜質(zhì)的專屬性，本文采用柱切換-LC/MSn-II法，將RP-HPLC色譜系統(tǒng)中20.0～22.0min區(qū)間的3個(gè)主要雜質(zhì)峰Imp-1～3分別進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖7所示。+EMS質(zhì)譜圖顯示3者均存在m/z699、m/z721、m/z737的準(zhǔn)分子離子峰，分別為 [M+H]+、[M+Na]+、[M+k]+峰，推測(cè)其分子量均為698，與頭孢拉定二聚體的分子量一致，證明這3個(gè)主要色譜峰均為頭孢拉定二聚體，三者互為同分異構(gòu)體，與二維色譜法的分析結(jié)果相一致。

2.3.4 RP-HPLC法分離聚合物雜質(zhì)的方法學(xué)驗(yàn)證

為了保證建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、耐用，本研究對(duì)RP-HPLC法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

(1)專屬性實(shí)驗(yàn)：參見(jiàn)“2.3.2”和“2.3.3”項(xiàng)。

(2)檢測(cè)限與定量限：精密量取方法學(xué)驗(yàn)證溶液5μL，用水進(jìn)行倍比稀釋，得到不同濃度的系列溶液，注入液相色譜儀。以基線噪音的10倍為指標(biāo)，得到方法的最低定量限；以基線噪音的3倍為指標(biāo)，得到方法的最低檢測(cè)限。結(jié)果表明，最低定量限為500μg；最低檢測(cè)限為150μg。

圖7 強(qiáng)制降解溶液在RP-HPLC系統(tǒng)中3個(gè)雜質(zhì)主峰的典型+EMS(1)和+EPI(2)質(zhì)譜圖Fig.7 Typical +EMS (1)and +EPI (2)mass spectrograms of 3 impurity peaks in stress degradation solution separated by RP-HPLC

(3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密量取方法學(xué)驗(yàn)證溶液5μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣3針，計(jì)算3個(gè)二聚體雜質(zhì)的峰面積之和，經(jīng)計(jì)算，3次重復(fù)進(jìn)樣的RSD為0.12%。

(4)耐用性實(shí)驗(yàn)：精密量取方法學(xué)驗(yàn)證溶液5μL，注入液相色譜儀，考察在不同柱溫、流動(dòng)相pH值、和不同色譜柱條件下，聚合物雜質(zhì)的分離情況。如圖8所示。結(jié)果表明當(dāng)柱溫、流動(dòng)相pH值、色譜柱型號(hào)發(fā)生輕微改變時(shí)，RP-HPLC法均可有效分離樣品中的頭孢拉定聚合物雜質(zhì)，頭孢拉定聚合物雜質(zhì)的保留時(shí)間維持在20.0～22.0min范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本文綜合運(yùn)用高效凝膠色譜法(HPSEC)、二維色譜法(2D-HPLC)、柱切換-LC/MSn法等現(xiàn)代色譜分析技術(shù)，證明了基于TSK2000 SWxL型高效凝膠柱系統(tǒng)的HPSEC法分析頭孢拉定原料及制劑的聚合物雜質(zhì)的方法專屬性差，新建立的RP-HPLC法分析頭孢拉定聚合物雜質(zhì)靈敏度高、耐用性好、專屬性強(qiáng)，適用于頭孢拉定原料及制劑的聚合物質(zhì)控；頭孢拉定強(qiáng)制降解溶液可作為頭孢拉定聚合物分析的系統(tǒng)適用性溶液。

圖8 RP-HPLC法的方法學(xué)驗(yàn)證典型色譜圖Fig.8 Typical RP-HPLC chromatograms for method validations