T淋巴細(xì)胞對(duì)高脂飲食引起的腸道炎癥的影響①

余 璐 劉世博 董莉君 王 輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

肥胖是一種多因素的、在全球范圍內(nèi)流行的疾病，與多種慢性疾病相關(guān)[1，2]。肥胖及由它引起的各種代謝疾病，包括2型糖尿病、腦血管病(CVD)和癌癥等，已成為21世紀(jì)威脅人類健康的重要因素，因此肥胖及相關(guān)的代謝綜合征已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

造成肥胖的因素很多，其中比較重要的便是飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂飲食可誘導(dǎo)肥胖發(fā)生。而近年來(lái)的許多研究表明，高脂飲食可以改變?nèi)梭w腸道功能與菌群的群落結(jié)構(gòu)，而腸道菌群可以影響人體脂代謝平衡，與肥胖的產(chǎn)生密切相關(guān)[3-6]。我們的研究提示高脂飲食會(huì)促進(jìn)小鼠腸道菌群的變化、腸壁變薄以及通透性增加，比如淋巴細(xì)胞可能從腸道中漏出，然后通過(guò)微循環(huán)遷移至脂肪組織[7]。同時(shí)高脂飲食條件下，小鼠腸道內(nèi)特別是中段小腸內(nèi)發(fā)生一些與脂代謝、細(xì)胞周期及炎癥免疫有關(guān)的分子改變，在尚未出現(xiàn)血清TNF-α升高的時(shí)候，腸道組織中特別是小腸組織中TNF-α已經(jīng)出現(xiàn)升高，腸道炎癥成為肥胖早期的信號(hào)。T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中處于核心地位，參與各種免疫應(yīng)答，肥胖可以引起T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的各種免疫反應(yīng)，那么T細(xì)胞對(duì)高脂飲食引起的腸道炎癥過(guò)程中發(fā)揮什么樣的作用呢？目前尚缺乏清晰答案。因此本研究通過(guò)使用T細(xì)胞缺失的小鼠模型，來(lái)探究T細(xì)胞對(duì)肥胖引起的腸道炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡、質(zhì)量約20 g的C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華公司；CD3ε基因敲除的小鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院梁銀明教授饋贈(zèng)。兩種小鼠各12只，均隨機(jī)分成兩組，每組6只，一組喂食正常飼料，一組喂食高脂飼料，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)別環(huán)境，8周大小開(kāi)始高脂喂養(yǎng)小鼠，每7 d稱量一次小鼠體重，監(jiān)測(cè)生活狀態(tài)。

1.1.2試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green購(gòu)自TaKaRa試劑公司。蘇木素染色液、伊紅染色液購(gòu)于碧云天試劑公司。引物合成于華大基因公司。

1.2方法

1.2.1樣本取材與處理 在實(shí)驗(yàn)后期，用苯巴比妥霧化吸入法麻醉小鼠，通過(guò)摘除眼球的方式取血，接著分離小鼠皮下脂肪、附睪脂肪、腸系膜脂肪以及腸道，分離出的皮下脂肪、附睪脂肪、腸系膜脂肪稱量后，分別取3/5組織于新EP管中，標(biāo)記清楚，立刻放于-80℃冰箱保存，各剩余2/5部分放于包埋框中，置于4%多聚甲醛中，浸泡48 h后，放于脫水機(jī)中進(jìn)行脫水。從胃以下取下整個(gè)腸道組織后，用滅菌過(guò)的PBS進(jìn)行沖洗，分出十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸部分，沖洗干凈后分別取3/5組織于新EP管中，標(biāo)記清楚，立刻放于-80℃冰箱保存，各剩余2/5部分放于包埋框中，置于4%多聚甲醛中，浸泡24 h后放于脫水機(jī)中，脫水后的組織取出后石蠟包埋。

1.2.2組織學(xué)分析和免疫組化 脂肪及腸道組織用4%多聚甲醛固定，脫水浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋、切片、攤片、烤片，然后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(H&E)以及進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)觀察。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 各種組織的總RNA的抽提使用TaKaRa試劑公司的Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，并嚴(yán)格按照配套說(shuō)明書進(jìn)行操作?；虻霓D(zhuǎn)錄本使用Applied Biosystems公司的7500 Fast real-time PCR system進(jìn)行擴(kuò)增，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt。所用引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in real-time PCR

2.1高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型產(chǎn)生 我們將小鼠分成4組后，分別對(duì)野生型小鼠的一組和CD3ε基因敲除小鼠的一組進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)，構(gòu)建肥胖模型。本實(shí)驗(yàn)體重?cái)?shù)據(jù)是由每周測(cè)一次體重得到，取第2、4、6、8、10、12、14、16周的數(shù)據(jù)，繪制小鼠體重變化曲線，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠的體重第4周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的變化，到高脂喂養(yǎng)16周結(jié)束后，高脂飲食后的野生型小鼠質(zhì)量顯著高于正常飲食的野生型小鼠[(40±2.02)g vs (30±2.00)g]，高脂飲食后的CD3ε基因敲除小鼠質(zhì)量也高于正常飲食的CD3ε基因敲除小鼠[(33±0.50)g vs (29±1.10)g]，肥胖組小鼠體重增長(zhǎng)速率明顯高于對(duì)照組，存在顯著性差異(圖1B)。接著我們處死小鼠，解剖取出白色脂肪，分別稱量了4組小鼠的皮下脂肪(SAT)、附睪脂肪(EAT)、腸系膜脂肪(MAT)以及腎周脂肪(PAT)的重量，高脂飲食組明顯高于正常飲食組小鼠(圖1C)，且在整個(gè)體重的占比中，高脂飲食組也是明顯高于正常飲食組小鼠(圖1D)。這些證據(jù)表明，肥胖模型建立成功。

2.2高脂飲食導(dǎo)致野生型小鼠腸道組織發(fā)生炎癥 有文獻(xiàn)報(bào)道肥胖時(shí)，脂肪組織中出現(xiàn)炎癥，同時(shí)也會(huì)影響其他組織及器官[8]，同時(shí)我們之前做過(guò)研究，高脂飲食后腸道中會(huì)出現(xiàn)炎癥[7]，于是我們對(duì)各組小鼠腸道組織的相關(guān)炎性因子及腸道形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。我們采用qRT-PCR方法測(cè)定結(jié)腸組織炎癥因子mRNA的表達(dá)水平，在高脂飲食的野生組小鼠IL-1β、IL-5、IFN-γ、TNF-α基因的mRNA表達(dá)水平相比對(duì)照組均被顯著上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)IL-6的表達(dá)水平也出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象(P<0.05)(圖2A)，說(shuō)明高脂飲食能夠引發(fā)結(jié)腸炎癥。同時(shí)通過(guò)對(duì)結(jié)腸組織的病理學(xué)切片H&E染色可以看到高脂飲食組腸黏膜發(fā)生炎性改變(圖2B)，同時(shí)高脂飲食組結(jié)腸組織肌層厚度明顯變薄(圖2C)，說(shuō)明了高脂飲食可以誘發(fā)結(jié)腸組織炎癥，與之前的報(bào)道結(jié)果一致。

2.3T細(xì)胞缺失對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的結(jié)腸組織炎癥的作用 為了證實(shí)T細(xì)胞在高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥中起作用，我們采用了T細(xì)胞缺失的小鼠模型。T細(xì)胞根據(jù)其表達(dá)受體(TCR)類型的不同分為αβT(CD4+或CD8+SP) 細(xì)胞和γδT(CD4-CD8-DN)細(xì)胞[9，10]，眾所周知，CD3是T細(xì)胞的表面標(biāo)志性分子，不論是αβT細(xì)胞，還是γδT細(xì)胞，都表達(dá)ε，因此將CD3ε基因敲除后，T細(xì)胞是不存在的。于是分別取野生型與CD3ε基因敲除組小鼠的脾臟和血液進(jìn)行流式檢測(cè)，基因敲除組小鼠脾臟和血液中不含T細(xì)胞，說(shuō)明敲除成功(圖1A)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)炎性因子，高脂飲食的基因敲除組小鼠的促炎因子IL-1β、TNF-α(P<0.01)、IL-5、IFN-γ(P<0.05)、 IL-6的mRNA表達(dá)與高脂飲食的野生型組相比顯著降低(圖3A)，說(shuō)明T細(xì)胞缺失時(shí)對(duì)高脂飲食引起的炎癥反應(yīng)有一定抑制作用，同時(shí)HE染色圖可以更加直觀地觀察到腸道的變化(圖3B)，可以看到當(dāng)基因敲除組的小鼠高脂飲食后，與野生型小鼠高脂飲食后的結(jié)腸HE圖對(duì)比腸壁厚度增加(圖3C)，因此當(dāng)T細(xì)胞缺失時(shí)，由高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥逐漸恢復(fù)，T細(xì)胞缺失對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥有抑制的作用。

圖1 高脂飲食誘導(dǎo)肥胖發(fā)生Fig.1 High fat diet induced obesity

2.4T細(xì)胞在高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥過(guò)程中對(duì)免疫細(xì)胞有影響進(jìn)而影響炎癥 為了探究T細(xì)胞在高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥中如何發(fā)揮影響，對(duì)免疫細(xì)胞有什么影響，我們?nèi)⌒∈蠼Y(jié)腸部分進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，

圖2 高脂飲食導(dǎo)致野生型小鼠腸道組織發(fā)生炎癥Fig.2 High fat diet causes inflammation in intestinal tissue of wild type mice

圖3 T細(xì)胞缺失對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的結(jié)腸組織炎癥有作用Fig.3 Absence of T cells has an effect on colonic tissue inflammation induced by high-fat diet

圖4 T細(xì)胞在高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥過(guò)程中對(duì)免疫細(xì)胞有影響進(jìn)而影響炎癥Fig.4 T cells affect immune cells in process of intestinal inflammation caused by high-fat diet and then affect inflammation

通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞F4/80的染色，也可以看到，當(dāng)野生型小鼠高脂飲食后，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多(圖4)，而T細(xì)胞缺失的小鼠高脂飲食后，巨噬細(xì)胞反而減少(圖4),說(shuō)明T細(xì)胞的缺失影響了腸道中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而也對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥有影響。

3 討論

肥胖是由不同炎癥因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種全身性的慢性低度炎癥狀態(tài)[11]。在肥胖個(gè)體的脂肪或血清中，能夠觀察到高水平的炎癥因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等。同時(shí)已有一些證據(jù)提示，肥胖會(huì)導(dǎo)致機(jī)體其他器官發(fā)生炎癥[12，13]。而長(zhǎng)期的高脂飲食會(huì)導(dǎo)致腸道中出現(xiàn)炎癥性細(xì)胞因子水平的增高，特別是腸道組織中IL-6、TNF-α出現(xiàn)升高，因此腸道炎癥成為肥胖早期的信號(hào)，最終導(dǎo)致代謝炎癥的發(fā)生[14，15]。

本研究使用T淋巴細(xì)胞缺失的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)CD3ε基因敲除小鼠和野生型小鼠高脂飲食后發(fā)現(xiàn)，高脂飲食使野生型小鼠相關(guān)炎性因子，如IL-1β、IL-5、TNF-α、IL-6、IFN-γ表達(dá)上調(diào)，當(dāng)T淋巴細(xì)胞缺失后(CD3ε基因敲除)，高脂飲食組基因敲除小鼠相關(guān)炎性因子，相比野生型小鼠明顯下調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道IFN-γ、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子在炎性反應(yīng)時(shí)會(huì)明顯升高[16，17]，我們的發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)道結(jié)果一致，說(shuō)明肥胖引起了腸道炎癥的發(fā)生。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食后野生型小鼠腸黏膜炎性發(fā)生改變，免疫組化結(jié)果提示結(jié)腸組織巨噬細(xì)胞增多，符合腸道炎癥改變，與炎性因子的表達(dá)也是一致的。當(dāng)T淋巴細(xì)胞缺失后，小鼠結(jié)腸組織腸壁變厚，免疫組化結(jié)果顯示結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，當(dāng)T淋巴細(xì)胞缺失后，小鼠結(jié)腸組織腸壁變厚，免疫組化結(jié)果顯示結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，可能是由于T淋巴細(xì)胞的缺乏，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞分泌的促炎因子減少，從而使腸道炎癥減弱。說(shuō)明T淋巴細(xì)胞在肥胖導(dǎo)致的炎癥發(fā)生中起到了重要作用。

眾多臨床研究證實(shí)肥胖會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥，而通過(guò)免疫細(xì)胞來(lái)探究腸道炎癥與肥胖之間關(guān)系的報(bào)道仍舊很少，而我們的研究從免疫細(xì)胞的角度探究了免疫細(xì)胞與肥胖導(dǎo)致的炎癥的關(guān)系。總的來(lái)說(shuō)，我們的研究通過(guò)采用了全身缺失T淋巴細(xì)胞的小鼠模型，揭示了T淋巴細(xì)胞對(duì)高脂飲食引起的腸道炎癥有減緩的作用，并初步探究T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)改變巨噬細(xì)胞的數(shù)量發(fā)揮功能。然而，在高脂飲食誘導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生的過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞究竟是如何招募或活化免疫細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用的？而高脂飲食后形成肥胖以及高脂飲食過(guò)程中發(fā)生腸道炎癥這兩個(gè)過(guò)程，是腸道炎癥發(fā)生進(jìn)而產(chǎn)生肥胖，還是肥胖誘導(dǎo)了腸道炎癥的發(fā)生，機(jī)制仍舊是未知的，這些問(wèn)題都需要我們進(jìn)一步研究。