李菌芳， 王一旻， 袁干軍， 李國(guó)華， 許雪杰， 宋曉媛

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045)

迷迭香(RosmarinusofficinalisLinn.)隸屬于唇形科(Lamiaceae)迷迭香屬(RosmarinusLinn.)，為常綠灌木，原產(chǎn)于沿地中海國(guó)家，現(xiàn)廣泛種植于世界各地。該植物主要含有萜酚類、酚酸類、黃酮類和三萜酸類成分[1-2]，其中，迷迭香葉中含有的熊果酸等三萜酸類成分具有顯著的抗炎、抗菌和抗腫瘤等活性[1，3-5]，但目前不同研究者從迷迭香葉中分離的三萜酸類成分存在差異，如：Altinier等[2]確定迷迭香葉中具有抗炎活性的三萜酸類成分為熊果酸、齊墩果酸、Δ20(30)-烯-熊果酸和Δ20(30)-烯-熊果酸甲酯；Martínez等[5]確定迷迭香葉中具有鎮(zhèn)痛活性的三萜酸類成分為熊果酸、齊墩果酸和Δ20(30)-烯-熊果酸；還有研究者[3，6]報(bào)道迷迭香葉含有熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸。

作者所在課題組發(fā)現(xiàn)迷迭香葉中鼠尾草酸具有顯著的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)活性[7]，鑒于新型抗多重耐藥菌(MDROs)藥物研發(fā)的迫切性，為進(jìn)一步明確迷迭香葉中三萜酸類成分及其抑菌活性，作者對(duì)迷迭香葉乙醇提取物中的三萜酸類成分進(jìn)行了分離和鑒定，并以MRSA和大腸桿菌(Escherichiacoli)為指示菌，對(duì)各成分的抑菌活性進(jìn)行分析，以期為迷迭香葉的藥效研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)等提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試迷迭香鮮葉采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)迷迭香種植基地，60 ℃鼓風(fēng)干燥后粉碎成粗粉2.7 kg，備用。

主要儀器：Waters 2695高效液相色譜儀和Waters 1525EF半制備液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；AB Sciex TripleTOFTM5600高分辨率質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)。

主要試劑：熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸對(duì)照品購(gòu)自海南舒普生物科技有限公司；萬(wàn)古霉素(純度大于98%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；左氧氟沙星(純度97%)購(gòu)自美國(guó)Ark Pharm公司；MHA固體培養(yǎng)基和MHB液體培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；甲醇和乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純； MRSA ATCC33592菌株由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，MRSA HK01、MRSA HK02、MRSA HK03和E.coliS002菌株由海南省人民醫(yī)院提供，其中，MRSA為革蘭氏陽(yáng)性菌株，E.coliS002為革蘭氏陰性菌株。

1.2 方法

1.2.1 供試溶液制備和HPLC分析

1.2.1.1 樣品溶液制備 稱取樣品粉末1.0 g，分別用30和20 mL無(wú)水乙醇超聲提取2次，每次15 min，過濾，合并濾液，45 ℃減壓濃縮；殘?jiān)? 000 μL甲醇超聲溶解，0.45 μm有機(jī)相濾頭壓濾，濾液為樣品溶液。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱量熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸對(duì)照品3.6、1.8和3.6 mg，分別用甲醇溶解并定容至100 mL，再取1.0 mL用甲醇定容至100 mL，得到熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸的對(duì)照品溶液，濃度分別為0.36、0.18和0.36 μg·mL-1。

1.2.1.3 HPLC分析 分別將上述樣品溶液和對(duì)照品溶液組合成以下供試溶液：a)V(熊果酸)∶V(齊墩果酸)=1∶1混合液；b) 白樺脂酸溶液；c)V(樣品)∶V(熊果酸)∶V(齊墩果酸)=1∶1∶1混合液；d)V(樣品)∶V(白樺脂酸)=1∶1混合液；e)樣品溶液。對(duì)各供試溶液進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：SinoChrom ODS-BP反相色譜柱(4.5 mm×25 mm， 5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸銨水溶液)=67∶12∶21的混合液，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)溫度25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 單體制備及鑒定 稱取樣品粉末1 000 g，分別用8 000和6 400 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流提取2.0和1.5 h，過濾，合并濾液，45 ℃減壓濃縮，干燥；然后依次用1 500和1 200 mL三氯甲烷回流提取2次，抽濾，合并濾液，40 ℃減壓濃縮至約100 mL。濃縮液用硅膠柱層析進(jìn)行分離，先用3倍柱體積的三氯甲烷洗脫，然后用V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合溶劑洗脫，分段收集洗脫液；洗脫液重復(fù)硅膠柱層析，并結(jié)合反相C18半制備液相色譜，對(duì)各色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行單體制備，獲得化合物1、2、3和4，質(zhì)量分別為203、121、75和328 mg。測(cè)定化合物1的NMR、HR-ESIMS(陰離子模式)和UV譜等，測(cè)定旋光度等理化常數(shù)，并參考文獻(xiàn)[2，8]的波譜數(shù)據(jù)對(duì)化合物1進(jìn)行鑒定；根據(jù)各化合物的HPLC色譜峰保留時(shí)間、對(duì)稱性和峰高，并參考文獻(xiàn)[4，6]對(duì)化合物2、3和4進(jìn)行鑒定。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定 用MHA固體培養(yǎng)基分別對(duì)MRSA和E.coliS002菌株進(jìn)行活化，然后接種于20 mL MHB液體培養(yǎng)基中，并于37 ℃條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，稀釋成1×106CFU·mL-1菌懸液，供試。

參照CLIS 2012標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法[9]，以萬(wàn)古霉素為陽(yáng)性對(duì)照，在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板上測(cè)定4個(gè)化合物對(duì)MRSA ATCC33592、MRSA HK01、MRSA HK02和MRSA HK03菌株的最低抑菌濃度(MIC)；以左氧氟沙星為陽(yáng)性對(duì)照，同法測(cè)定4個(gè)化合物對(duì)E.coliS002菌株的MIC值。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 化合物鑒定結(jié)果

化合物2、3和4：化合物2、3和4對(duì)應(yīng)的HPLC色譜峰保留時(shí)間分別為10.12、11.30和11.88 min，根據(jù)對(duì)照品的色譜峰的保留時(shí)間、對(duì)稱性和峰高(圖1)，并結(jié)合文獻(xiàn)[4，6]，鑒定化合物2、3和4分別為白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸。

a： 熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品 Reference substances of ursolic and oleanolic acids； b： 白樺脂酸對(duì)照品 Reference substance of betulinic acid； c： 樣品及熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品 Sample and reference substances of ursolic and oleanolic acids； d： 樣品和白樺脂酸對(duì)照品 Sample and reference substance of betulinic acid； e： 樣品 Sample. 1： Δ20(30)-烯-熊果酸 Δ20(30)-ene-ursolic acid； 2： 白樺脂酸 Betulinic acid； 3： 齊墩果酸 Oleanolic acid； 4： 熊果酸 Ursolic acid.

2.2 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

以MRSA ATCC33592、MRSA HK01、MRSA HK02、MRSA HK03和E.coliS002為指示菌株，以萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星為陽(yáng)性對(duì)照藥，測(cè)定4個(gè)化合物的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果(表1)表明：熊果酸對(duì)MRSA菌株的抑菌活性最強(qiáng)，MIC值為8.000～128.000 μg·mL-1；Δ20(30)-烯-熊果酸和齊墩果酸對(duì)MRSA菌株的抑菌活性依次減弱；白樺脂酸未顯示出對(duì)MRSA的抑菌活性。此外，4個(gè)化合物對(duì)不同MRSA菌株的MIC值存在差異，對(duì)MRSA HK02菌株的MIC值最小。4個(gè)化合物均未顯示出對(duì)E.coliS002菌株的抑菌活性。說明熊果酸、Δ20(30)-烯-熊果酸和齊墩果酸是迷迭香葉中抑制MRSA的主要三萜酸類成分。

表1迷迭香葉中4個(gè)三萜酸類化合物的最低抑菌濃度

Table1TheminimuminhibitoryconcentrationsoffourtriterpeneacidscompoundsinleavesofRosmarinusofficinalisLinn.

化合物1)Compound1)對(duì)不同菌株的最低抑菌濃度/(μg·mL-1)2) Minimum inhibitory concentration to different strains2)MRSA ATCC33592MRSA HK01MRSA HK02MRSA HK03E. coli S0021512.000128.00032.000>512.000>512.0002>512.000>512.000>512.000>512.000>512.0003>512.000512.00064.000>512.000>512.0004128.00064.0008.000128.000>512.000CK11.0001.0001.0000.500NDCK2NDNDNDND0.016

1)1： Δ20(30)-烯-熊果酸 Δ20(30)-ene-ursolic acid； 2： 白樺脂酸Betulinic acid； 3： 齊墩果酸Oleanolic acid； 4： 熊果酸Ursolic acid； CK1： 萬(wàn)古霉素Vancomycin； CK2： 左氧氟沙星Levofloxacin.

2)MRSA： 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 Methicillin-resistantStaphylococcusaureus. ND： 未測(cè)定 Not determined.

3 討論和結(jié)論

近年來，對(duì)迷迭香葉成分的藥理作用研究擴(kuò)展至抗氧化、抗阿爾茨海默病和抗腫瘤等方面，其藥用價(jià)值更加明確，但不同研究者獲得的迷迭香葉三萜酸類成分卻存在差異[3，5-6]，可能與研究方法及供試材料的產(chǎn)地、品種和生長(zhǎng)狀況的差異有關(guān)。作者參照前人研究結(jié)果，依據(jù)HPLC色譜峰定位、理化性質(zhì)和詳細(xì)的波譜數(shù)據(jù)等，從迷迭香葉乙醇提取物中分離鑒定出Δ20(30)-烯-熊果酸、白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸。

迷迭香葉中上述4個(gè)三萜酸類化合物對(duì)革蘭氏陰性菌(E.coliS002菌株)均未顯示出抑菌活性；熊果酸、Δ20(30)-烯-熊果酸和齊墩果酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(MRSA菌株)均具有一定的抑菌活性，其中熊果酸的抑菌活性最強(qiáng)，這與Fontanay等[4]的研究結(jié)果類似，僅對(duì)不同菌株的MIC值有一定差異，原因是后者使用的金黃色葡萄球菌大多為敏感菌株，而本研究使用的是耐藥菌株。由于4個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，尤其是Δ20(30)-烯-熊果酸、齊墩果酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)極為相似，而其抑菌活性卻存在較大差異，因此，有關(guān)迷迭香葉抗MRSA的作用機(jī)制和三萜酸類成分的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。