千里光莖和葉的差異表達(dá)基因分析

謝 欣， 錢秋博言， 賀莉芳， 李 林， 楊春先， 左青青， 錢 剛，①

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000； 2. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系， 貴州 都勻 558003)

隨著高通量測序(high-throughput sequencing)技術(shù)的快速發(fā)展，用于數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling， DGE)研究的深度測序技術(shù)不但廣泛用于有參考基因組序列的物種分析，而且能夠直觀顯示基因組的功能元件和剪切方式，確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下表達(dá)水平的變化，以及對所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類[1]，從而實現(xiàn)對無參考基因組序列的物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[2-3]。由于轉(zhuǎn)錄組測序蘊含了大量的基因表達(dá)信息和數(shù)據(jù)量，能夠更加精確地定量分析特異基因的表達(dá)水平和等位基因轉(zhuǎn)錄本的特異表達(dá)，目前轉(zhuǎn)錄組測序已成為了解控制數(shù)量性狀的基因組大規(guī)模表達(dá)情況的重要手段[4]。近年來，國內(nèi)外研究者對部分經(jīng)濟(jì)作物和模式植物[5-8]進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序研究，但在中醫(yī)藥領(lǐng)域研究中卻處于起步階段。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham. ex D. Don)隸屬于菊科(Asteraceae)千里光屬(SenecioLinn.)，為重要的傳統(tǒng)抗菌中草藥，主要用于治療風(fēng)熱感冒、目赤腫痛、泄瀉痢疾及皮膚濕疹瘡癤等[4，9]，具有良好的開發(fā)和利用前景。目前，關(guān)于千里光的研究主要集中在化學(xué)組分和藥理學(xué)作用機(jī)制等[9]方面，而關(guān)于其功能基因組學(xué)的研究卻極其匱乏。相關(guān)研究表明：千里光不同品種的抗菌性差異顯著[4]，其不同部位的藥效也有明顯差異[10]，因此，探明千里光不同器官的功能基因差異表達(dá)對于了解其藥用成分積累和主要藥理作用等具有重要意義。

鑒于此，作者采用高通量測序技術(shù)對千里光強(qiáng)抗菌性植株SC-32莖和葉的cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出差異表達(dá)基因，并對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，以期揭示千里光莖和葉的差異表達(dá)基因，為采用比較基因組學(xué)(comparative genetics)方法篩選菊科近緣藥用植物莖和葉器官分化基因及其功能驗證提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以移植到遵義醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室中藥材種質(zhì)資源大棚內(nèi)的野生千里光(來自貴州省遵義市板山地區(qū))強(qiáng)抗菌性植株SC-32為實驗材料，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室錢剛教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA文庫構(gòu)建 取千里光1年生植株從上到下第7枚葉以上部位的莖和葉樣品各3份，每份0.1 g，置于液氮中充分研磨；采用Trizol試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取總RNA；用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop 2000微量分光光度計(美國NanoDrop公司)檢測提取的總RNA的純度、濃度和完整性。

取檢測合格的總RNA約1 μg，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；加入5× fragmentation buffer，隨機(jī)打斷mRNA；以mRNA為模板，采用GeneRacer試劑盒(美國Invitrogen公司)構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析 使用Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺(美國Illumina公司)對cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。利用Trinity軟件將Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺得到的raw data按順序拼接成contig，利用TGICL軟件進(jìn)一步處理得到unigenes。利用FASTQC軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除只含有測序接頭序列的reads、含N比例大于10%的reads以及低質(zhì)量reads(Q≤10的堿基數(shù)占整條read堿基數(shù)的50%以上)，從而獲得高質(zhì)量clean data；使用SOAPaligner/SOAP2軟件將clean reads比對到青蒿(ArtemisiacarvifoliaBuch.-Ham. ex Roxb.)的參考基因組中，每個clean read最多錯配5個堿基，統(tǒng)計clean reads在參考基因組中的覆蓋度；采用FPKM(fragment per kilobase of exon model per million mapped fragment)法計算基因表達(dá)量，并以FC≥2且FDR<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)(FC為差異倍數(shù)，F(xiàn)DR為錯誤發(fā)現(xiàn)率)，利用DEGseq軟件[11]篩選差異表達(dá)基因；利用BLAST軟件(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將unigenes序列比對到NCBI的Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(E值小于1×10-5)數(shù)據(jù)庫中，利用Blast2GO軟件根據(jù)Nr注釋信息進(jìn)行GO注釋，并利用WEGO軟件[12]對全部unigenes進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

采用Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺對構(gòu)建的千里光莖和葉的cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，在對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，將clean reads與青蒿參考基因組進(jìn)行比對。結(jié)果顯示：從千里光莖和葉的cDNA文庫中分別獲得26 147 016和26 996 119個clean reads，Q30值分別為95.17%和94.74%。在千里光莖和葉的cDNA文庫中，比對到青蒿參考基因組中的clean reads(mapped reads)分別有20 722 491和21 610 120個，所占比例分別為79.25%和80.05%。其中，比對到參考基因組惟一位置的clean reads(unique mapped reads)分別有2 674 440和2 516 239個，所占比例分別為12.91%和11.64%；而比對到參考基因組多個位置的clean reads (multimapped reads)分別有18 048 051和19 093 881個，所占比例分別為87.09%和88.36%。

2.2 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

差異表達(dá)基因篩選結(jié)果(圖1)表明：從千里光莖和葉中共篩選到10 991個差異表達(dá)基因，以莖中差異表達(dá)基因的表達(dá)量為準(zhǔn)，葉中上調(diào)的差異表達(dá)基因有5 542個，占莖和葉差異表達(dá)基因總數(shù)的50.42%，而葉中下調(diào)的差異表達(dá)基因有5 449個，占莖和葉差異表達(dá)基因總數(shù)的49.58%。在篩選差異表達(dá)基因過程中，還發(fā)現(xiàn)41 045個表達(dá)量無顯著差異的基因，并且，多數(shù)差異表達(dá)基因集中在-5≤log2(FC)≤5、-log10(FDR)≤25區(qū)域。

FDR： 錯誤發(fā)現(xiàn)率 False discovery rate； FC： 差異倍數(shù) Fold change. 紅點表示上調(diào)的差異表達(dá)基因 Red dots represent up-regulated differentially expressed genes； 綠點表示下調(diào)的差異表達(dá)基因 Green dots represent down-regulated differentially expressed genes； 橫向虛線以下及縱向虛線間的黑點表示表達(dá)量無顯著差異的基因 Black dots below horizontal dashed line and between vertical dashed lines represent genes without significant difference in expression level.

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

2.3.1 GO功能分類分析 采用BLAST軟件對千里光莖和葉中獲得的clean reads進(jìn)行比對，共有61 171個unigenes被注釋，其中差異表達(dá)基因有7 683個。GO功能分類結(jié)果表明：這些差異表達(dá)基因的功能被分成生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個大類，并被細(xì)分成53個亞類(表1)。在生物過程大類中，被注釋為代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞過程(cellular process)和單一生物過程(single-organism process)的全部unigenes和差異表達(dá)基因數(shù)量明顯高于其他生物過程；在細(xì)胞組分大類中，被注釋為細(xì)胞(cell)、細(xì)胞成分(cell part)、細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞膜(membrane)、細(xì)胞器成分(organelle part)和細(xì)胞膜成分(membrane part)的全部unigenes和差異表達(dá)基因數(shù)量亦較高；在分子功能大類中，被注釋為催化活性(catalytic activity)和結(jié)合(binding)的全部unigenes和差異表達(dá)基因數(shù)量也明顯高于其他分子功能。值得注意的是，全部unigenes和差異表達(dá)基因GO功能分類的富集趨勢并不完全相同。

根據(jù)千里光莖和葉中全部unigenes和差異表達(dá)基因的topGO前10位分類統(tǒng)計結(jié)果(表2)，被注釋為單生物細(xì)胞過程(single-organism cellular process，GO：0044763)、細(xì)胞代謝過程(cellular metabolic process，GO：0044237)以及大分子代謝過程(macromolecule metabolic process，GO：0043170)等10個功能的全部unigenes和差異基因數(shù)均較高，其中，被注釋為生物過程(biological process，GO：0008150)的全部unigenes和差異表達(dá)基因的數(shù)量最多。

表1千里光莖和葉中全部unigenes和差異表達(dá)基因的GO功能分類

Table1GOfunctionclassificationofallunigenesanddifferentiallyexpressedgenesinstemandleafofSenecioscandensBuch.-Ham.exD.Don

GO功能分類GO function classificationN1N2GO功能分類GO function classificationN1N2生物過程 Biological process 大分子復(fù)合物Macromolecular complex7 497808 代謝過程Metabolic process45 6595 958 細(xì)胞外區(qū)域Extracellular region1 947450 細(xì)胞過程Cellular process40 0084 937 細(xì)胞連接Cell junction1 780150 單一生物過程Single-organism process34 7304 690 共質(zhì)體Symplast1 778150 應(yīng)激反應(yīng)Response to stimulus14 6441 840 膜封閉的管腔Membrane-enclosed lumen1 61178 生物調(diào)節(jié)Biological regulation12 8491 639 類核Nucleoid8630 定位Localization11 1701 284 細(xì)胞外區(qū)域成分Extracellular region part432 細(xì)胞成分組織或生物合成Cellular component organization or biogenesis8 9701 338 病毒Virion185 發(fā)育過程Developmental process7 401889 病毒成分Virion part185 多細(xì)胞生物過程Multi-cellular organism process7 115833 細(xì)胞外基質(zhì)Extracellular matrix153 信號Signaling4 422449 細(xì)胞外基質(zhì)成分Extracellular matrix part50 生殖過程Reproductive process3 917375分子功能Molecular function 多生物過程Multi-organism process3 158431 催化活性Catalytic activity37 1274 832 生長Growth1 384176 結(jié)合Binding32 7523 741 免疫系統(tǒng)過程Immune system process1 266172 運轉(zhuǎn)活性Transporter activity5 210565 繁殖Reproduction85953 結(jié)構(gòu)分子活性Structural molecule activity1 388172 生物附著Biological adhesion44750 分子傳感器活性Molecular transducer activity1 34792 節(jié)律過程Rhythmic process20521 電子載體活性Electron carrier activity1 187211 生物相Biological phase1716 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity745115 運動Locomotion43 1 受體活性Receptor activity72338 細(xì)胞殺傷Cell killing2 0 抗氧化活性Antioxidant activity611112細(xì)胞組分Cellular component 酶調(diào)節(jié)活性Enzyme regulator activity51665 細(xì)胞Cell30 0593 699 鳥苷酸核苷酸交換因子活性Guanyl-nu-cleotide exchange factor activity1287 細(xì)胞成分Cell part30 0593 699 蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性Protein bind-ing transcription factor activity10714 細(xì)胞器Organelle22 5182 878 營養(yǎng)庫活性Nutrient reservoir activity2710 細(xì)胞膜Membrane18 4982 542 金屬伴侶活性Metallochaperone activity100 細(xì)胞器成分Organelle part11 7401 743 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性Translation regulator activity70 細(xì)胞膜成分Membrane part9 5011 176 蛋白質(zhì)標(biāo)記Protein tag20

1)N1： 全部unigenes數(shù)量 Number of all unigenes； N2： 差異表達(dá)基因數(shù)量 Number of differentially expressed genes.

表2千里光莖和葉中全部unigenes和差異表達(dá)基因的topGO前10位分類統(tǒng)計結(jié)果

Table2StatisticalresultofthetoptenoftopGOofallunigenesanddifferentiallyexpressedgenesinstemandleafofSenecioscandensBuch.-Ham.exD.Don

編號IDGO功能分類GO function classificationN1N2GO:0044763單生物細(xì)胞過程Single-organism cellular process26 3393 481GO:0044237細(xì)胞代謝過程Cellular metabolic process32 2424 095GO:0044710單一生物代謝過程Single-organism metabolic process23 0143 388GO:0044699單一生物過程Single-organism process33 2594 465GO:0009987細(xì)胞過程Cellular process38 7614 885GO:0044238初級代謝過程Primary metabolic process31 8603 922GO:0043170大分子代謝過程Macromolecule metabolic process21 6762 453GO:0071704有機(jī)物代謝過程Organic substance metabolic process33 4994 308GO:0008152代謝過程Metabolic process39 7935 335GO:0008150生物過程Biological process49 4176 436

1)N1： 全部unigenes數(shù)量 Number of all unigenes； N2： 差異表達(dá)基因數(shù)量 Number of differentially expressed genes.

圖中數(shù)據(jù)為差異表達(dá)基因數(shù)量 Data in the diagram indicate number of differentially expressed genes. A： 細(xì)胞過程 Cellular process； B： 環(huán)境信息處理 Environmental information processing； C： 遺傳信息處理 Genetic information processing； D： 代謝 Metabolism； E： 生物體系 Organism system.

總體來看，這些差異表達(dá)基因與信號傳導(dǎo)途徑、次生代謝過程、細(xì)胞組分合成和酶催化活性等功能密切相關(guān)。

2.3.2 KEGG代謝通路分析 千里光莖和葉中差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析結(jié)果(圖2)表明：共有4 527個差異表達(dá)基因，涉及50個代謝通路，且大部分代謝通路屬于代謝途徑。其中，碳代謝途徑的差異表達(dá)基因數(shù)量最多(352)，占該通路差異表達(dá)基因總數(shù)的7.78%；其次為氨基酸生物合成途徑，共有322個差異表達(dá)基因，占該通路差異表達(dá)基因總數(shù)的7.11%；淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達(dá)基因數(shù)量也較多(211)，占該通路差異表達(dá)基因總數(shù)的4.66%；而檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))途徑的差異表達(dá)基因數(shù)量最少(33)，占該通路差異表達(dá)基因總數(shù)的0.73%。

3 討論和結(jié)論

由于藥用植物各部位的藥用成分含量和種類不同[13]，因此，研究藥用植物各器官基因的轉(zhuǎn)錄水平既利于闡明植物的器官分化基因，也利于深入分析藥用成分積累的次生代謝途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[14-16]。本研究從千里光莖和葉的cDNA文庫中分別獲得26 147 016和26 996 119個clean reads，Q30值分別為95.17%和94.74%，說明其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果良好。千里光的莖中含有大量的木質(zhì)素，木質(zhì)素對維持較高的硬度及承托全株重量具有重要作用[17]，而葉是植物合成及儲存營養(yǎng)物質(zhì)(如淀粉和蔗糖等)的主要場所[18]。本研究從千里光莖和葉中共篩選到10 991個差異表達(dá)基因，以莖中差異表達(dá)基因的表達(dá)量為準(zhǔn)，葉中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因分別有5 542和5 449個；莖和葉中共有7 683個差異表達(dá)基因被GO功能注釋成生物過程、細(xì)胞組成和分子功能3個大類53個亞類，且這些差異表達(dá)基因與信號傳導(dǎo)途徑、次生代謝過程、細(xì)胞組分合成和酶催化活性等密切相關(guān)。

KEGG代謝通路分析結(jié)果顯示：千里光莖和葉中有4 527個差異表達(dá)基因，共涉及50個代謝通路，大部分差異表達(dá)基因參與碳代謝、氨基酸生物合成及淀粉和蔗糖代謝，說明這些差異表達(dá)基因與細(xì)胞組分合成和體內(nèi)的生物合成等密切相關(guān)，其中，參與碳代謝和氨基酸合成的差異表達(dá)基因較多，據(jù)此推測千里光莖和葉的器官分化需要積累大量的多糖和蛋白質(zhì)。千里光還含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，包括生物堿類、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油類和萜類等[9]，其中，類黃酮是千里光的主要抗菌成分之一[19]，而供試植株SC-32具有強(qiáng)抗菌性[4]，本研究發(fā)現(xiàn)參與類黃酮合成的差異表達(dá)基因有44個，說明這些差異表達(dá)基因主要參與千里光體內(nèi)類黃酮的合成。據(jù)此認(rèn)為，參與千里光莖和葉中類黃酮合成的差異表達(dá)基因可能在佐證類黃酮是千里光重要抗菌成分及千里光抗菌數(shù)量性狀等方面具有重要作用。

綜上所述，千里光莖和葉的差異表達(dá)基因具有器官特異性，其莖和葉的分化和形成與多糖和蛋白質(zhì)積累密切相關(guān)。