陳芳，王蘭，張左兵

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原030006

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）家族是一個由具有保守的叉頭狀螺旋（forkhead，F(xiàn)KH）DNA結(jié)合域蛋白組成的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。FOXP3是目前在免疫調(diào)控領(lǐng)域研究最為熱門的FOX家族成員。在哺乳動物中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg細(xì)胞）的發(fā)育和功能由編碼FOXP3蛋白的基因控制，大量研究表明，foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵分子，在誘導(dǎo)和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性作用[2-4]。foxp3缺陷型小鼠模型發(fā)展為一種致死性自身免疫綜合征，其特征在于外周T細(xì)胞增殖增加，大量炎癥細(xì)胞浸潤在多個器官中，并引起炎癥細(xì)胞因子的大量增加，導(dǎo)致在出生后1個月內(nèi)死亡[5-6]。其中一種Scurfy小鼠模型，因在foxp3基因中自發(fā)產(chǎn)生的移碼突變，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)缺乏C端叉頭結(jié)構(gòu)域[5]。這些發(fā)現(xiàn)表明了FOXP3在免疫抑制功能中的關(guān)鍵作用。人類罕見的自身免疫性疾病免疫調(diào)節(jié)異常、多發(fā)性內(nèi)分泌疾病和腸病、X-聯(lián)（IPEX）綜合征[5]患者中foxp3基因發(fā)生突變，可見FOXP3在預(yù)防自身免疫性疾病中的重要作用，但FOXP3在非哺乳動物脊椎動物免疫耐受性的控制中的研究尚不夠深入。近年來，已相繼從不同硬骨魚類分離克隆了foxp3的cDNA序列[7-11]，其中包括斑馬魚foxp3的cDNA序列[12-13]。由于斑馬魚在演化過程中出現(xiàn)了染色體加倍事件，因此斑馬魚基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個foxp3同源基因，即foxp3a和foxp3b[12-13]。Jia等制備了尼羅羅非魚FOXP3蛋白，并研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚FOXP3蛋白細(xì)胞表達模式相對保守，且主要定位于淋巴樣細(xì)胞，如外周血單個核細(xì)胞（PBMC）、胸腺、脾、頭腎、腎、腸、鰓等，在PBMC中主要定位于一些（不是所有）淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核[14]。斑馬魚foxp3a基因在斑馬魚胸腺和腎臟中高表達，但FOXP3A蛋白表達模式及其功能有待于進一步研究。本研究中，我們選擇在胸腺和腎臟中富集程度較高的FOXP3A制備多克隆抗體[12]。在早期克隆得到的斑馬魚foxp3a基因cDNA序列基礎(chǔ)上，構(gòu)建pET-32a-s-foxp3a原核表達系統(tǒng)，對斑馬魚foxp3a密碼子進行優(yōu)化，融合表達重組蛋白，并制備了兔源多克隆抗體，為斑馬魚FOXP3蛋白生物學(xué)功能的研究提供了手段，為深入研究斑馬魚免疫耐受性的控制機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康家兔購自太原科鑫畜牧養(yǎng)殖場。斑馬魚成魚（AB系）飼養(yǎng)于本實驗室斑馬魚養(yǎng)殖水循環(huán)系統(tǒng)中，每日喂食2次，養(yǎng)殖系統(tǒng)為上海海圣斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，水循環(huán)系統(tǒng)溫度維持在（28±0.5）℃，按14 h/10 h晝夜節(jié)律條件飼養(yǎng)。

克隆宿主大腸桿菌DH5α、表達宿主大腸桿菌Trans BL21（DE3）購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a為本實驗室保存；pMD19-T（Sim?ple）載體和T4DNA連接酶購于TaKaRa公司；2×Easy-TaqDNA聚合酶購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購于NEB有限公司（北京）；Ni-NTA His-Bind Resin購于Novagen公司；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、96孔板及EL-TMB顯色試劑盒購于生工生物工程股份有限公司（上海）；SDS-PAGE組 分Tris-HCl（pH8.8、pH6.8）、30%丙烯酰胺購于北京索萊寶科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 foxp3a表達序列擴增

以本實驗室RACE擴增得到的斑馬魚foxp3a基因序列為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物（表1），并擴增foxp3a基因序列，引物的5'端和3'端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點（下劃線標(biāo)出）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，64℃30 s，72℃1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸7 min；瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進行菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含目的條帶的菌液送生工公司測序。

1.3 foxp3a表達序列優(yōu)化

根據(jù)大腸桿菌稀有密碼子選擇需要進行優(yōu)化的位點3個，分別記為1、2、3號突變位點。這3個突變位點將目的基因片段分成4個區(qū)域，即1～4號區(qū)域，并且設(shè)計突變引物。將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。以所提質(zhì)粒為模板，通過橋連PCR技術(shù)，先分別用對應(yīng)的引物擴增1～4號區(qū)域。第1輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 22μL，正、反向引物各1μL，模板1μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱2 min；5個循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touch?down-1℃/循環(huán)）30 s，72℃30 s］；30個循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶。再以第1輪擴增后得到的1號、2號區(qū)域混合物為模板，以1號區(qū)域的正向引物及2號區(qū)域的反向引物進行第2輪擴增；同時以第1輪擴增后得到的3號、4號區(qū)域混合物為模板，以3號區(qū)域的正向引物及4號區(qū)域的反向引物進行第2輪擴增。

第2輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 21μL，正、反向引物各1μL，模板［1（3）號區(qū)域］1μL，模板［2（4）號區(qū)域］1μL。反應(yīng) 程序：94℃2 min；5個循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touchdown-1℃/循環(huán)）30 s，72℃40 s］；30個循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃40 s）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶；最后用帶有酶切位點的特異性引物擴增目的基因。

第3輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 21μL，正、反向引物各1μL，模板（1～2號區(qū)域）1μL，模板（3～4號區(qū)域）1μL。反應(yīng) 程序：94℃2 min；5個循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touchdown-1℃/循環(huán)）30 s，72℃1 min］；30個循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃1 min）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶。

1.4 foxp3a原核表達載體的構(gòu)建

回收PCR產(chǎn)物，將目的基因片段與pET-32a載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切（37℃，過夜），瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收目的片段，用T4DNA連接酶于4℃過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，送生工公司測序驗證。構(gòu)建成斑馬魚foxp3a原核表達載體pET32a-sfoxp3a。

1.5 誘導(dǎo)pET-32a-foxp3a的原核表達

將重組載體pET-32a-s-foxp3a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），涂于含氨芐青霉素（1 mg/mL）的平板，挑取單克隆于5 mL LB培養(yǎng)液中，200 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為1.0時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，150 r/min、16℃誘導(dǎo)表達10 h，離心收集菌體，1×PBS緩沖溶液重懸菌體，在冰浴條件下超聲波破碎（超聲時間2 s，間歇時間3 s，總時間2 h），10 000 r/min離心收集上清和沉淀，同時以誘導(dǎo)前菌液以及空載體菌液超聲波破碎離心所得上清和沉淀作為對照，行10% SDSPAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色90 min，常溫過夜脫色，鑒定蛋白的表達。

1.6 包涵體融合蛋白的純化、多克隆抗體的制備及效價測定

超聲波破碎離心后的沉淀即為包涵體。每次用20 mL包涵體洗滌液（1% Triton X-100，5 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl）將包涵體清洗3次，4℃離心，棄上清，用20 mL包涵體溶解液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素，5%甘油）重懸沉淀，4℃靜置過夜溶解包涵體蛋白，12 000 r/min、4℃離心，取上清過0.45μm濾膜，用Ni-NTA His-Bind親和層析柱純化斑馬魚FOXP3A融合蛋白，選用10、20、50、100、250 mmol/L咪唑濃度洗脫，收集蛋白，SDS-PAGE檢測。將純化的蛋白按500μg（1 mL）與1 mL弗氏完全佐劑混合乳化，乳化液對2只健康家兔（雌、雄各1只）于背部皮下多點注射進行基礎(chǔ)免疫，14 d后用上述蛋白500μg（1 mL）與1 mL弗氏不完全佐劑乳化，對雌、雄2只家兔進行首次加強免疫，加強免疫共3次，間隔為7 d，最后一次加強免疫3 d后心臟取血并分離抗血清，分裝，-80℃保存。

表1 表達序列擴增及基因優(yōu)化PCR引物列表

1.7抗斑馬魚S-FOXP3A-His多克隆抗血清效價測定

用間接ELISA法測定抗斑馬魚S-FOXP3AHis融合蛋白效價。將S-FOXP3A-His融合蛋白用包被液（2.94 g NaHCO3和1.59 g Na2CO3用雙蒸水定容至500μL，調(diào)節(jié)pH9.6，高壓蒸汽滅菌）稀釋至1μg/mL，100μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜，棄去包被液，經(jīng)PBST洗滌、封閉緩沖液（10%小牛血清/PBS）封閉，再次洗滌后加入待檢物（斑馬魚FOXP3A-His多克隆抗體以及用PBS稀釋至不同濃度的免疫前血清），100μL/孔，孵育1 h后再次洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，100μL/孔，孵育1 h，1%小牛血清/PBS稀釋抗體，顯色后終止，用酶標(biāo)儀檢測D450nm值。S/N值＞2.1時判為陽性（S為測定血清的D450nm值，N為陰性對照血清的D450nm值）。

2 結(jié)果

2.1 foxp3a基因優(yōu)化及原核表達載體的構(gòu)建

以成年斑馬魚腎臟、脾臟、肝臟、鰓、腸、胸腺及周圍組織混合cDNA為模板進行PCR擴增，在foxp3a預(yù)期大小894 bp附近有單一的目的條帶。將得到的基因序列片段與pMD19-T載體連接，構(gòu)建了重組克隆載體pMD19-T-simple-foxp3a。用含酶切位點的引物及突變引物進行定點突變，3輪PCR結(jié)束后獲得與foxp3a預(yù)期大小909 bp一致的目的條帶（圖1A），將得到的基因序列片段與經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后的pET-32a載體連接，構(gòu)建重組原核表達載體pET-32a-foxp3a。通過BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切驗證，在909 bp附近有單一目的條帶（圖1B）。送生工公司測序驗證，除靶位點有預(yù)期突變外，在第540位堿基處有一個同義突變（A突變?yōu)镚），該突變后的密碼子UCG也是大腸桿菌所偏好的絲氨酸對應(yīng)的密碼子。因此，成功構(gòu)建了密碼子優(yōu)化后的重組原核表達載體pET-32a-s-foxp3a。

2.2 融合蛋白的表達與純化

通過摸索不同的誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)了FOXP3A融合蛋白的表達。FOXP3A融合蛋白缺失了叉頭結(jié)構(gòu) 域FOXP3的N端（S-FOXP3）（圖2），SDSPAGE結(jié)果顯示（圖3），重組菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，在包涵體中檢測到與預(yù)期大?。ㄏ鄬Ψ肿淤|(zhì)量51.7×103）一致的目的條帶，即FOXP3A融合蛋白。在對照實驗中，未誘導(dǎo)的重組菌包涵體中未檢測到相應(yīng)大小的FOXP3A。因此，可確定獲得了包涵體FOXP3A融合蛋白。進一步用親和純化方法，通過梯度咪唑濃度洗脫，對FOXP3A融合蛋白進行分離、純化。結(jié)果顯示，250 mmol/mL咪唑濃度洗脫時檢測到大量目的蛋白。電泳條帶的灰度分析表明，250 mmol/mL咪唑濃度洗脫液洗脫收集的蛋白純度在80%以上，達到了后續(xù)免疫實驗的要求。

圖1 foxp3a密碼子優(yōu)化定點突變PCR擴增及pET-32a-foxp3a重組載體的酶切鑒定

2.3 FOXP3A融合蛋白多克隆抗體的制備

用純化的FOXP3A融合蛋白免疫家兔，收集血清，制備斑馬魚FOXP3A蛋白的多克隆抗血清，ELISA法測定結(jié)果顯示雌兔和雄兔抗S-FOXP3AHis的效價均高于1.6×105（圖4）。

3 討論

Treg細(xì)胞是抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的特化細(xì)胞亞群。體外功能研究已經(jīng)證實Treg細(xì)胞存在多種抑制機制，而且人類[5]和小鼠Treg細(xì)胞缺陷型的研究已經(jīng)清楚地表明了這些細(xì)胞在預(yù)防自身免疫中的重要作用。Hori等的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3特異性表達于Treg細(xì)胞上，并在該細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用[15]，而且在其他一些魚類，如河豚[10]、大馬哈魚[11]、尼羅羅非魚[9]和兩棲類[16]中也發(fā)現(xiàn)了編碼FOXP3直系同源基因，這表明FOXP3也可能在非哺乳動物脊椎動物定義Treg樣細(xì)胞。斑馬魚基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個foxp3同源基因foxp3a和foxp3b，對foxp3的研究大部分處于mRNA水平。本研究制備了斑馬魚FOXP3A多克隆抗體，為在蛋白水平更好地探討FOXP3A的功能，深入研究轉(zhuǎn)錄因子FOXP3A在Treg細(xì)胞中的發(fā)育和功能提供了基礎(chǔ)。

圖2 FOXP3A功能結(jié)構(gòu)域圖解

圖3 FOXP3A融合蛋白的表達及純化

圖4 間接ELISA檢驗抗S-FOXP3A-His血清效價

在斑馬魚FOXP3A蛋白多克隆抗體的制備過程中，首先擴增斑馬魚foxp3a基因開放讀框片段，用軟件翻譯產(chǎn)生氨基酸序列，通過BLAST進行氨基酸多序列比對，比較來自斑馬魚的FOXP3A和FOXP1A、FOXP1B、FOXP2及FOXP4的氨基酸序列，F(xiàn)OXP3A的N端片段顯示出對FOXP3A的高度特異性。FOXP家族的特征性叉頭結(jié)構(gòu)域C端顯示出與其他FOXP家族成員超過80%的相似性。因此，將叉頭結(jié)構(gòu)域缺失的FOXP3A的N端片段用作抗原。同時，在分析所選擇的這段基因序列時，發(fā)現(xiàn)其含有大腸桿菌稀有密碼子，在前期預(yù)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)若直接采用斑馬魚foxp3a天然核苷酸序列在大腸桿菌中表達，其表達水平較低。故在本研究中，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在不改變氨基酸組成的情況下，將斑馬魚foxp3a基因中稀有密碼子更換為大腸桿菌宿主使用頻率較高的密碼子。采用重疊PCR的方式，設(shè)計了4對引物，通過3輪PCR，合成了909 bp的目的片段。其次，在表達載體選擇上，pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆表達融合蛋白最強大的系統(tǒng)之一，本實驗選擇了其中的原核表達載體pET-32a，T7為啟動子，可使目的基因得到高效轉(zhuǎn)錄與翻譯，同時該載體含有6個連續(xù)的組氨酸標(biāo)記，以蛋白酶缺陷型大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌進行誘導(dǎo)表達，表達的重組蛋白可利用His標(biāo)簽進行親和層析純化。本研究制備的斑馬魚SFOXP3A-His融合蛋白以包涵體形式表達，雖然不具有生物活性，但包涵體的形成能夠防止蛋白酶對表達的目的蛋白的降解作用，而且包涵體形式的目的蛋白有利于分離純化。間接ELISA法檢測其特異性多抗血清效價在1.6×105以上，說明表達的重組蛋白具有很好的免疫原性，能刺激家兔產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，為下一步制備其單克隆抗體打下了良好的實驗基礎(chǔ)。