王俊婷，落繼先

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原030006

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將含有目的基因的片段或具有生物功能的重組基因?qū)爰?xì)胞并使其成功表達(dá)的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因功能的研究。常用的轉(zhuǎn)染方法包括病毒載體法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法[1]、基因顯微注射[2]和電擊轉(zhuǎn)染法[2-3]等。

一般情況下，貼壁細(xì)胞較易轉(zhuǎn)染，而懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染普遍存在轉(zhuǎn)染效率低[1,3-4]的問(wèn)題。轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞一般采用電擊轉(zhuǎn)染法，但通常會(huì)造成細(xì)胞活力差[5]。常用的轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體性價(jià)比高，可以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[1]，但其轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的效率較低，因此，脂質(zhì)體在懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用較少。

多聚賴氨酸能夠促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，被廣泛用于體外細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面處理[6]。用多聚賴氨酸處理過(guò)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)耳蝸螺旋神經(jīng)細(xì)胞[7]、胎鼠頜下腺細(xì)胞[8]、人表皮細(xì)胞[9]、背根神經(jīng)節(jié)[10]、骨髓基質(zhì)等細(xì)胞[6]，能夠顯著提高細(xì)胞的貼附性，并保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)[11]。

我們通過(guò)多聚賴氨酸包被細(xì)胞培養(yǎng)板，優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，檢測(cè)并鑒定過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）在懸浮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，建立了一套利用脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat（Clone E6-1）和CCRF-CEM（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）、ECL發(fā)光液（碧云天公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）；脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司）；siRNA［生工生物工程（上海）股份有限公司］；研究級(jí)倒置熒光相差顯微鏡（奧林巴斯公司）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（北京生原誠(chéng)業(yè)公司）；硝酸纖維素膜（索萊寶公司）；ABL1抗體（Santa Cruz公司）；超凈工作臺(tái)（上海博訊試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；多功能酶標(biāo)儀（MD公司）。

1.2 siRNA設(shè)計(jì)

針對(duì)人ABL1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成siRNA（5'-GGGUGUACCAUUACAGGAUTT-3'；5'-AUCCUGUAAUGGUACACCCTT-3'）。

1.3 PDL工作濃度的摸索

1.3.1 PDL包被細(xì)胞培養(yǎng)板以無(wú)菌PBS溶液稀釋PDL，設(shè)置0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL共5個(gè)濃度包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔300μL，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，于4℃過(guò)夜包被。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)取出過(guò)夜包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于超凈工作臺(tái)內(nèi)吸掉PDL溶液，吹風(fēng)數(shù)分鐘至完全干燥。每孔1.5×106Jurkat或CCRF-CEM細(xì)胞，重懸于500μL無(wú)雙抗完全培養(yǎng)基中，于恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20～24 h。

1.3.3 懸浮細(xì)胞貼壁情況統(tǒng)計(jì)從CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸除板內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗3次，于倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)分析不同濃度PDL包被下細(xì)胞相對(duì)貼壁率，確定最佳包被濃度。

1.3.4 PDL對(duì)細(xì)胞活性的影響用PBS或PDL于4℃過(guò)夜包被細(xì)胞板，加入細(xì)胞培養(yǎng)（同1.3.1），24 h后換液一次；次日，每孔加入10μL MTT，輕輕搖勻，放入培養(yǎng)箱孵育3～4 h；將板孔上清中的細(xì)胞離心，棄上清，對(duì)應(yīng)板孔與離心管中各加入100μL DMSO溶解沉淀，然后把EP管中的液體加回相應(yīng)孔中，搖勻，測(cè)定D570nm值。

1.4 轉(zhuǎn)染pWPXLd

用0.1 mg/mL的PDL過(guò)夜包被細(xì)胞培養(yǎng)板（同1.3.1），次日鋪Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞培養(yǎng)（同1.3.2），20～24 h后吸除板孔中的培養(yǎng)基，用PBS洗3次，用3μL脂質(zhì)體2000向24孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染1μg pWPXLd質(zhì)粒，6 h后換液，換液時(shí)把板孔中的液體1000 r/min離心5 min，用500μL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，加回相應(yīng)孔中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后用熒光顯微鏡于可見(jiàn)光及熒光下同時(shí)拍照，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.5 轉(zhuǎn)染siRNA

PDL過(guò)夜包被細(xì)胞培養(yǎng)板及鋪Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞培養(yǎng)（同1.4.1）。用5μL脂質(zhì)體2000向6孔板內(nèi)分別轉(zhuǎn)染200μmol siRNA和對(duì)照siRNA（NC），4～6 h后換液，板孔中的 液 體1000 r/min離心5 min，用2 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，加回相應(yīng)孔中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收細(xì)胞并裂解，采用Western印跡檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中相應(yīng)蛋白的表達(dá)量，選用ACTB為上樣量的內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 PDL最適濃度的確定

用不同濃度的PDL包被細(xì)胞培養(yǎng)板，統(tǒng)計(jì)分析各濃度下2種細(xì)胞的相對(duì)貼壁率（圖1）。0.01 mg/mL PDL顯著促進(jìn)Jurkat細(xì)胞貼壁，且這種作用隨PDL濃度的增大而提高，PDL濃度達(dá)到0.1 mg/mL后繼續(xù)增加至0.5 mg/mL，促進(jìn)懸浮細(xì)胞貼壁的作用并沒(méi)有隨濃度變化而顯著增加，在CCRF-CEM細(xì)胞中顯示了一致的結(jié)果，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.1 mg/mL PDL包被細(xì)胞培養(yǎng)板。

2.2 PDL對(duì)細(xì)胞活性的影響

為了排除PDL對(duì)細(xì)胞活力的影響，將Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞分別與0.1 mg/mL PDL或等體積的PBS作用，用MTT法檢測(cè)0.1 mg/mL PDL對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，0.1 mg/mL PDL不影響Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞的活性（圖2）。

2.3 2種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

為了研究PDL引起的懸浮細(xì)胞貼壁后是否對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有幫助，將含有綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達(dá)載體pWPXLd轉(zhuǎn)染Jurkat或CCRFCEM細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察，視野范圍內(nèi)GFP的表達(dá)率均在90%以上（圖3），表明pWPXLd質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Jurkat或CCRF-CEM細(xì)胞。

2.4 siRNA轉(zhuǎn)染及干擾效率檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述方法是否對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染有效，設(shè)計(jì)合成了ABL1的siRNA，將細(xì)胞按上述方法貼壁處理后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA，48 h后收取轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并裂解，Western印跡（圖4）結(jié)果表明，與對(duì)照轉(zhuǎn)染組及正常細(xì)胞相比，siRNA組能顯著干擾Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞內(nèi)ABL1的表達(dá)。表明上述方法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染同樣有效。

圖1 不同濃度PDL處理后Jurkat細(xì)胞（A）和CCRF-CEM細(xì)胞（B）貼壁情況統(tǒng)計(jì)

3 討論

圖2 0.1 mg/mL PDL對(duì)Jurkat細(xì)胞（A）和CCRF-CEM細(xì)胞（B）活力沒(méi)有影響

圖3 轉(zhuǎn)染pWPXLd的Jurkat細(xì)胞（A）和CCRF-CEM細(xì)胞（B）轉(zhuǎn)染效率的鑒定

圖4 Jurkat細(xì)胞（A）和CCRF-CEM細(xì)胞（B）中ABL1干擾效率鑒定

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，近年來(lái)有較多提高懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法，如改變細(xì)胞鋪板密度、限制懸浮細(xì)胞分裂[1]、纖連蛋白預(yù)處理細(xì)胞[2]，也有人嘗試改變電擊轉(zhuǎn)染條件，如控制電壓、電容、細(xì)胞狀態(tài)和緩沖液血清濃度等[5]，甚至有電擊法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的聯(lián)合使用[2]，但大都存在細(xì)胞活力差和轉(zhuǎn)染效率很難大幅度提高等問(wèn)題。急性T淋巴細(xì)胞白血病是一種常見(jiàn)的惡性血液腫瘤疾病[12]。Jurkat[13]和CCRF-CRM[13-14]細(xì)胞均為急性T淋巴白血病細(xì)胞系，在T淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞信號(hào)[1]和病毒感染的相關(guān)研究中也被廣泛應(yīng)用[15]，但這2種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，使得相關(guān)研究在一定程度上受阻。

有研究表明，明膠、纖連蛋白、殼聚糖均能促進(jìn)細(xì)胞黏附。與本研究用到的多聚賴氨酸相比，明膠的作用較弱[16]，纖連蛋白處理對(duì)材料要求較高[17]，殼聚糖需要與多聚賴氨酸聯(lián)合使用才能達(dá)到較好效果[18]。此外，聚乙醇酸、多聚乳酸[19]、層黏連蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β[20]雖然也能促進(jìn)細(xì)胞貼壁，但因處理方法繁瑣或技術(shù)要求高而應(yīng)用較少。我們采用多聚賴氨酸包被細(xì)胞培養(yǎng)板，促進(jìn)懸浮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，然后再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Jurkat和CCRF-CEM，該方法適用于質(zhì)粒及小干擾RNA的轉(zhuǎn)染，為白血病的相關(guān)研究提供了技術(shù)手段。