鐘榮斌，李捷，易紹瓊，王帥，吳曉潔，靳海榮，王領(lǐng)會(huì)，王啟偉，郗永義，朱力，林艷麗，王友亮

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；

2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 胸外科，北京100853

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，空氣污染加重和女性吸煙人數(shù)的增多，導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)。雖然近年來在肺癌診斷、手術(shù)及藥物治療方面取得了極大的進(jìn)步，但肺癌患者的五年存活率僅為10%～15%[1]，主要原因是肺癌早期癥狀輕微，確診時(shí)往往已發(fā)展至中晚期，治療效果并不理想。但早期肺癌患者經(jīng)過手術(shù)切除治療后的五年存活率可達(dá)83%，因此早期診斷對(duì)治療肺癌至關(guān)重要。

目前肺癌的診斷方法主要包括組織活檢、支氣管內(nèi)鏡技術(shù)和影像學(xué)方法，然而這些具有侵入性的檢查方法在肺癌早期診斷方面收效甚微。液體活檢這一非侵入式的檢查方法在腫瘤早期診斷方面展現(xiàn)出巨大的潛力，而外泌體是液體活檢中的一個(gè)重要檢測(cè)對(duì)象。所有活細(xì)胞均能通過分泌胞外囊泡來進(jìn)行細(xì)胞間的信息傳遞[2]。外泌體是三大胞外囊泡中的一種，它是由細(xì)胞中內(nèi)出芽形成的多囊泡內(nèi)體與細(xì)胞膜融合后向細(xì)胞外分泌的具有脂質(zhì)雙層膜的微小囊泡，直徑為40～100 nm[3]。外泌體中包含的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)分子是其能在細(xì)胞間進(jìn)行信息交流和物質(zhì)交換的基礎(chǔ)[4]，腫瘤相關(guān)的外泌體可通過傳遞這些信號(hào)分子來改變細(xì)胞微環(huán)境，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖[5]、轉(zhuǎn)移[6]以及免疫耐受[7]。癌細(xì)胞旺盛的生命活動(dòng)使得其外泌體的分泌量通常高于正常細(xì)胞，外泌體所包含的蛋白質(zhì)也往往與腫瘤的大小以及分期呈正相關(guān)性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生早期，影像學(xué)方法還沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤實(shí)體的時(shí)候，血液中已經(jīng)存在來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體[9]。此時(shí)檢測(cè)外泌體內(nèi)的信號(hào)分子，可以在一定程度上反映腫瘤細(xì)胞的基因信息和增殖狀況，因此外泌體是實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷的一個(gè)非常理想的研究對(duì)象。分泌至細(xì)胞外微環(huán)境的外泌體即可進(jìn)入血液，隨后通過血液循環(huán)擴(kuò)散至多種其他體液中，如腦脊液、尿液、膽汁、唾液、腹腔積液及支氣管洗脫液[2]等。這些體液樣本在臨床上非常容易收集且可重復(fù)取樣，這使得外泌體在腫瘤早期體外篩查方面擁有良好的應(yīng)用前景。此外，外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)可以防止存在于其中的信號(hào)分子被體液中的相關(guān)酶類降解，從而提高了外泌體內(nèi)容物的穩(wěn)定性，使外泌體內(nèi)容物分子與游離在體液中的其他生物活性分子相比更具有成為一些疾病分子標(biāo)記物的潛能。

蛋白質(zhì)作為生命功能的承擔(dān)者具有一定的組織特異性，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)不僅是區(qū)分不同來源外泌體的關(guān)鍵所在，也是研究外泌體起源的的重要方法[10]。近年來，飛速發(fā)展的具有高通量、高靈敏度優(yōu)點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為深入研究外泌體蛋白質(zhì)提供了一個(gè)更廣闊的平臺(tái)，在全面詮釋外泌體蛋白質(zhì)的組成和功能方面發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)探究能否利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從肺癌患者與肺部良性結(jié)節(jié)病人血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并評(píng)估超速離心法與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)篩選用于肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及采集

本實(shí)驗(yàn)室與解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心胸外科合作，選取2017-06-15至2018-01-31入解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心胸外科接受治療的肺癌患者與肺部良性研究對(duì)象，獲得所有病人入院接受治療前的知情同意后，采集術(shù)前血液樣品。同時(shí)收集了病人詳細(xì)的臨床資料，包括性別、年齡、是否吸煙、吸煙量、吸煙年限、是否傳染性病毒感染和有無既往癌癥病史等信息。

采集病人術(shù)前靜脈血10 mL置于EDTA作為抗凝劑的血液收集管中，采血后2 h內(nèi)分離血漿，室溫400 r/min離心15 min，收集上層血漿-80℃保存。剔除有傳染性病毒感染和既往癌癥病史的病人血液樣品后，共收集肺腺癌血漿樣品59例、肺鱗癌血漿樣品28例、肺部良性結(jié)節(jié)病人血漿8例。隨機(jī)選取肺腺癌病人血漿15例、肺鱗癌病人血漿10例作為實(shí)驗(yàn)組，肺部良性結(jié)節(jié)病人血漿5例作為對(duì)照組，分析研究外泌體蛋白質(zhì)組。

1.2 材料

兔抗補(bǔ)體C4a一抗（Fitzgerald公司）；兔抗IgG二抗、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)P1103（北京普利萊基因技術(shù)公司）；超高速離心機(jī)（Optima L-100XP Ultracentrifuge）（Beckman公司）；液相色譜儀（EASY-nLC1000）、質(zhì)譜儀（Orbitrap Fusion Lu?mos）（Thermo公司）。

1.3 超高速離心法提取血漿外泌體

超高速離心法主要參照Théry等[11]建立的細(xì)胞培養(yǎng)上清及生物學(xué)體液外泌體分離方法中相應(yīng)的血漿外泌體提取方法。取凍融后的血漿樣品1 mL，加入等體積的PBS稀釋，4℃、2000 r/min離心30 min去除細(xì)胞，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃、12 000 r/min離心45 min去除細(xì)胞碎片，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至2 mL超高速離心管中，4℃、110 000 r/min離心2 h，棄上清，加入1 mL PBS重懸沉淀后移入新的超高速離心管中，再加入1 mL PBS補(bǔ)至2 mL，重懸液過0.22μm濾網(wǎng)后轉(zhuǎn)移至新的超高速離心管中，4℃、110 000 r/min離心70 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸沉淀后移入新的超高速離心管中，再加入1 mL PBS補(bǔ)至總體積2 mL，4℃、110 000 r/min離心70 min，棄上清，沉淀即為外泌體。

1.4 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)搜索

采用基于超濾輔助樣品制備（FASP）方法，在超濾管中消化提取的蛋白質(zhì)。加入8 mol/L尿素溶液（含10 mmol/L DTT），56℃還原樣品，室溫避光用20 mmol/L碘乙酰胺烷基化20 min，尿素洗滌2次，用50 mmol/L NH4HCO3洗 滌3次，加 入40μL胰蛋白酶，37℃孵育13 h。消化得到的肽離心后真空濃縮干燥，重懸于0.1%甲酸溶液中，并經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，在Uniport_sprot人蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中檢索，選取置信度高的肽段（大于95%）進(jìn)行查詢，每一個(gè)查詢至少有5個(gè)肽段匹配，且覆蓋率不低于整個(gè)蛋白質(zhì)序列的15%。

1.5 銀染和Western印跡驗(yàn)證蛋白質(zhì)譜結(jié)果

用Pierce IP裂解液裂解超速離心提取的外泌體，吹打混勻，3000 r/min離心5 min，獲得含有外泌體蛋白的上清。用Nano Drop 2000紫外分光度計(jì)對(duì)獲得的總蛋白定量，然后進(jìn)行SDSPAGE，分離膠濃度為10%。一部分凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色法初步定性提取的外泌體蛋白質(zhì)種類，但由于外泌體蛋白質(zhì)含量極低，考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)蛋白質(zhì)條帶顯色不明顯，因此采用靈敏度更高的銀鹽染色法（用乙醇、冰醋酸和水的混合液固定蛋白質(zhì)，0.1%硝酸銀溶液染色，2.5%碳酸鈉、0.02%甲醛水溶液溫育顯色）。另一部分進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，低溫濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用PBST溶液洗3次膜，用一抗（稀釋比例為1∶5000）于4℃搖床孵育過夜，用PBST洗3次膜，用二抗（稀釋比例為1∶8000）室溫孵育1 h，PBST洗3次膜，顯影。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析結(jié)果

質(zhì)譜定量分析共鑒定到血漿外泌體蛋白質(zhì)253個(gè)，并確定其中18個(gè)在肺癌病人血漿外泌體中表達(dá)上調(diào)（表1），8個(gè)在肺癌病人血漿外泌體中表達(dá)下調(diào)（表2）。外泌體差異表達(dá)的蛋白質(zhì)涉及參與受體、載體、免疫、糖酵解、基因調(diào)控、血管生成、細(xì)胞骨架等多種形式。這些蛋白質(zhì)有的與細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)功能及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，在不同的病理過程中差異表達(dá)，因此具有腫瘤分子標(biāo)記物的潛能。

2.2 銀染和Western印跡驗(yàn)證結(jié)果

采用超速離心法提取上述入選病人血漿中的外泌體，裂解后獲取外泌體蛋白質(zhì)并通過紫外分光光度計(jì)定量，取250 ng外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE。一部分凝膠固定后用硝酸銀溶液染色（圖1），顯色后發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品中均出現(xiàn)多種大小不一的條帶，證實(shí)了外泌體蛋白提取的多樣性，也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)譜的分析結(jié)果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜的準(zhǔn)確性，挑選質(zhì)譜分析結(jié)果中肺癌病人血漿外泌體樣本高表達(dá)的蛋白C4a，該蛋白是與免疫相關(guān)的補(bǔ)體蛋白，參與多種生理病理過程。用抗C4a抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該蛋白在外泌體的表達(dá)（圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有樣品均在相對(duì)分子質(zhì)量190×103左右出現(xiàn)一條特異性條帶，說明成功提取了外泌體中的補(bǔ)體蛋白C4a，且該蛋白在肺腺癌病人與肺鱗癌病人血漿外泌體中的表達(dá)明顯高于良性病人，該蛋白有望成為外泌體中肺癌早期診斷的有效分子。結(jié)合質(zhì)譜定量分析與銀染、Western印跡結(jié)果，說明我們已初步構(gòu)建了血漿外泌體蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)平臺(tái)，為肺癌早期診斷奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

表1 肺癌病人血漿外泌體中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)

表2 肺癌病人血漿外泌體中表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)

3 討論

圖1 銀染驗(yàn)證提取的外泌體蛋白質(zhì)

本研究檢測(cè)到血漿外泌體蛋白質(zhì)在肺癌患者與良性結(jié)節(jié)病人中存在差異，說明超速離心法提取樣品與質(zhì)譜法聯(lián)用分析外泌體蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性是篩選肺癌潛在分子標(biāo)志物的有效方法。盡管只用單個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)來判斷腫瘤發(fā)生的可能性很小，但新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還在不斷發(fā)展，腫瘤分子的復(fù)雜性正在層層剖析中。血漿外泌體蛋白質(zhì)組的分析補(bǔ)充了腫瘤細(xì)胞的組織學(xué)研究，為篩選更敏感的可臨床應(yīng)用的診斷、預(yù)后及分型的腫瘤分子標(biāo)志物做出貢獻(xiàn)。目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)在腫瘤診斷方面具有極大的價(jià)值。Melo等[12]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出胰腺癌外泌體中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)GPC1，特異性與靈敏度極高，可以作為胰腺癌體外篩查和早期診斷的分子標(biāo)志物。Vardaki等[13]發(fā)現(xiàn)外泌體中的蛋白質(zhì)periostin可以很好地將乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者區(qū)分開來，peri?ostin將是一個(gè)重要的乳腺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。

圖2 Western印跡驗(yàn)證提取的外泌體蛋白C4a

本實(shí)驗(yàn)共篩選到26個(gè)血漿外泌體差異表達(dá)的蛋白，結(jié)合研究背景，我們從中篩選出補(bǔ)體蛋白C4a（P0C0L4）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（P02786）和S100-A9（P06702）3個(gè)蛋白質(zhì)。補(bǔ)體蛋白C4a與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，它能夠參與形成攻擊外來抗原的膜相關(guān)復(fù)合物，也是激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑的重要組成部分。最近的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體激活在腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)中可能發(fā)揮的作用，腫瘤細(xì)胞在對(duì)抗補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用時(shí)會(huì)持續(xù)釋放補(bǔ)體片段導(dǎo)致血漿中更高水平的補(bǔ)體成分[14]。這與本研究中檢測(cè)到的肺癌患者血漿外泌體樣本中C4a的表達(dá)情況一致，表明該補(bǔ)體蛋白可能作為診斷肺癌的生物標(biāo)志物。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是調(diào)控鐵平衡和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要蛋白質(zhì)，它在各類正常細(xì)胞中均低水平表達(dá)，而腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)水平顯著增高[15]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平升高可能是因?yàn)殍F是參與DNA合成的重要輔助因子，腫瘤細(xì)胞迅速分裂增加了對(duì)鐵的大量需求。小分子肽S100鈣結(jié)合蛋白A9（S100-A9）是S100蛋白家族成員，也是一類天然免疫分子。研究表明S100-A9在多種腫瘤中具有較高表達(dá)水平，可能為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供了微環(huán)境[16]。綜上，本研究通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者和肺部良性結(jié)節(jié)病人血漿外泌體蛋白質(zhì)組定量分析，鑒定出在非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體中的18個(gè)高表達(dá)蛋白質(zhì)和8個(gè)低表達(dá)蛋白質(zhì)，共26個(gè)與肺部良性結(jié)節(jié)病人血漿外泌體表達(dá)存在差異的蛋白質(zhì)分子。盡管這26個(gè)蛋白質(zhì)分子在非小細(xì)胞腺癌和鱗癌中的表達(dá)相近，即無法用于區(qū)分非小細(xì)胞肺癌的表型，但它們?cè)趨^(qū)分非小細(xì)胞肺癌和肺部良性結(jié)節(jié)方面可能具有潛在的診斷價(jià)值，為肺癌的早期診斷提供了新的候選分子。

基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，極大地促進(jìn)了人們對(duì)外泌體的了解，為篩選外泌體來源的分子標(biāo)志提供了新的視野。然而外泌體蛋白質(zhì)組信息僅是擁有龐大生物學(xué)信息的外泌體中的一部分，把外泌體蛋白質(zhì)組、基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)合才能更好更全面地解讀外泌體信息。