色譜分析發(fā)展簡(jiǎn)史及其給我們的啟示

劉虎威, 傅若農(nóng)

(1. 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 北京 100871; 2. 北京理工大學(xué), 北京 100081)

1 色譜分析方法的出現(xiàn)[1]

文獻(xiàn)記載,有些科學(xué)家在19世紀(jì)下半葉就觀察到了吸附現(xiàn)象[2,3],如1850年龍格(F. F. Lunge)觀察到將一滴染料混合物溶液滴到吸墨紙上時(shí)會(huì)擴(kuò)散成一層層的圓形環(huán);申拜恩(C. F. Schoenbein)在1861年注意到,如果把一滴無機(jī)鹽混合溶液滴在一張濾紙上,那么各種鹽分會(huì)以不同速度向四周擴(kuò)散;德伊(D. T. Day)在1897年、克利特卡(S. K. Kritka)在1900年初發(fā)現(xiàn)把石油簡(jiǎn)單地通過碳酸鈣的細(xì)粉柱,就會(huì)分離為不同餾分。這些工作可以說是平面色譜或者柱色譜的萌芽,但直到20世紀(jì)初,人們只是利用吸附現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單的分離,今天看來,其原理基本都屬于前沿色譜或頂替色譜。進(jìn)入20世紀(jì)后,人類社會(huì)的發(fā)展對(duì)科學(xué)技術(shù)提出了更高的要求,科學(xué)家需要在分子層面上實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物的分離分析,乃至分離制備。完成這一歷史貢獻(xiàn)的是俄國(guó)的植物學(xué)家米哈伊5西蒙諾維奇5茨維特(Michael Semenovich Tswett)(見圖1)。正是這位杰出的科學(xué)家在20世紀(jì)初系統(tǒng)地研究了色譜分離現(xiàn)象,并認(rèn)識(shí)到這種分離方法的重要性。

圖 1 (從左到右) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)Fig. 1 (From left to right) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)

關(guān)于茨維特的生平及色譜的早期發(fā)現(xiàn)過程有不同的版本,但大同小異。不過,有些中文版本(包括網(wǎng)上資料)存在某些不符合事實(shí)的表述。20世紀(jì)90年代初,蘇聯(lián)著名色譜學(xué)者K. I. Sakodynskii教授(見圖1)和美國(guó)耶魯大學(xué)L. S. Ettre教授(見圖1)對(duì)色譜發(fā)現(xiàn)的歷史進(jìn)行過深入研究,我們?cè)谶@里僅根據(jù)他們的嚴(yán)肅考證[4,5]來簡(jiǎn)述色譜的初期發(fā)展歷程。

茨維特1872年5月14日生于意大利的阿斯蒂(Asti),他父親是俄國(guó)外交官,當(dāng)時(shí)在瑞士工作,母親是意大利人,在茨維特出生后便去世。茨維特13歲前生活在瑞士洛桑,后隨其父到日內(nèi)瓦,1891年從日內(nèi)瓦學(xué)院(College of Geneva)畢業(yè)后進(jìn)入日內(nèi)瓦大學(xué)(University of Geneva)學(xué)習(xí),并于1893年獲得物理與數(shù)學(xué)系的學(xué)士學(xué)位。而后轉(zhuǎn)學(xué)植物學(xué),1896年獲得細(xì)胞生理學(xué)博士學(xué)位。隨后回國(guó)與其父團(tuán)聚于克里米亞半島,1896年底遷居到圣彼得堡,開始在俄羅斯帝國(guó)科學(xué)院(the Imperial Russian Academy of Sciences)的植物實(shí)驗(yàn)室工作。由于俄羅斯不承認(rèn)他的瑞士學(xué)位,茨維特必須在俄羅斯再次攻讀(在職)博士學(xué)位。隨后他謀得一個(gè)植物學(xué)私人教職,工作于P. Lesgaft的生物實(shí)驗(yàn)室。1900年其父在雅爾塔去世。茨維特于1901年通過題目為“葉綠素的物理化學(xué)研究”的學(xué)位論文答辯,獲得喀山大學(xué)(University of Kazan)的碩士學(xué)位。1901年10月他在圣彼得堡召開的第11屆俄國(guó)自然科學(xué)家與醫(yī)生協(xié)會(huì)大會(huì)上發(fā)表了“葉綠素生理學(xué)研究的方法和任務(wù)”的報(bào)告,并于年底作為實(shí)驗(yàn)助理進(jìn)入波蘭華沙大學(xué)工作。

1903年茨維特成為華沙大學(xué)的助理教授并在波蘭其他大學(xué)講授植物學(xué)課程。是年3月,他在華沙自然科學(xué)家協(xié)會(huì)的生物學(xué)會(huì)議上作了關(guān)于“新吸附現(xiàn)象”的報(bào)告,第一次公布了他的色譜研究結(jié)果。1906年3月他給德國(guó)的植物學(xué)刊物“the Berichte der Deutschen Botanischen Geselschaft (德國(guó)植物學(xué)報(bào)告)”投了兩篇關(guān)于色譜的重要學(xué)術(shù)論文,1907年5月在柏林舉行的一次德國(guó)植物學(xué)會(huì)會(huì)議上,他系統(tǒng)介紹了色譜技術(shù),并展示了分離得到的純色素。是年8月他受聘為華沙獸醫(yī)研究所的講師,后與波蘭女子Helena A. Trusevich結(jié)婚。1908年10月成為華沙工學(xué)院(Polytechnic Institute of Warsaw)化學(xué)與采礦系的資深講師,這期間他完成了俄羅斯博士學(xué)位論文“動(dòng)物和植物界的葉綠素”,并于1910年在華沙出版(30年后此書對(duì)Kuhn的研究工作起了重要作用), 1910年11月在華沙大學(xué)通過了博士學(xué)位論文答辯。這期間他于1909年底的第12屆俄國(guó)自然科學(xué)家與醫(yī)生協(xié)會(huì)大會(huì)上宣讀了題為“分析色素混合物的物理新方法及其在葉綠素研究中的應(yīng)用”的報(bào)告,全面闡述了色譜分離方法。

1911年底,茨維特在莫斯科參加了普通和應(yīng)用化學(xué)Mendelew大會(huì),作了題為“葉綠素化學(xué)的現(xiàn)狀”的報(bào)告,同年還獲得俄羅斯帝國(guó)科學(xué)院的M. N. Akhmatov獎(jiǎng)。1914年位于西西伯利亞的托木斯克大學(xué)(University of Tomsk)聘請(qǐng)他為植物學(xué)教授,但被他以氣候不適的理由拒絕。1915年夏他偕妻子離開華沙去俄羅斯敖德薩,期間德國(guó)軍隊(duì)占領(lǐng)了波蘭,他無法返回華沙,便暫居莫斯科。此時(shí)波蘭一些高校遷徙到莫斯科,他便加盟華沙工學(xué)院。1916年8月他在遷移到諾夫哥羅德的華沙工學(xué)院繼續(xù)教學(xué)工作,后因健康原因在高加索山區(qū)休養(yǎng)。1917年3月愛沙尼亞塔爾圖大學(xué)(University of Tartu)聘請(qǐng)他為植物學(xué)教授和植物園主任,他隨即于9月到塔爾圖開始其教學(xué)和科研工作。1918年8月德國(guó)軍隊(duì)進(jìn)犯塔爾圖后,他隨俄國(guó)教授們遷徙到沃羅涅什,1919年6月26日因喉部慢性感染而病故于沃羅涅什,終年47歲。其妻子則于1922年病逝于黑海東岸的格列博夫卡。二戰(zhàn)期間茨維特的墳?zāi)贡粴?直到1992年人們才在1919年埋葬他的地方(Okata-Alekseevsky寺院)立了一塊墓碑。值得一提的是,1918年有幾位著名科學(xué)家曾推薦茨維特作為諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)候選人[6],但最后沒有頒給他。而到1919年這位色譜之父就辭世了,這令后來的很多色譜學(xué)者為之感嘆(事實(shí)上,1919年沒有頒發(fā)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))。

圖 2 (a)1906年和(b)1908年茨維特發(fā)表的色譜裝置和 色譜圖示意Fig. 2 (a) Illustration of the chromatographic device published by Tswett in 1906 and (b) a chromatogram in 1908

由上可知,茨維特于1901年(甚至更早一些)在試驗(yàn)中觀察到了色譜現(xiàn)象,這在其碩士學(xué)位論文中有所描述,并在俄國(guó)國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議上做了有關(guān)報(bào)告[7]。當(dāng)時(shí),茨維特在一根玻璃管的底部塞上一團(tuán)棉花,在管中填入粉末狀吸附劑,例如碳酸鈣等,然后把該吸附管與吸濾瓶連接,把有色植物葉子的石油醚萃取液傾注到管內(nèi)的吸附劑上面,然后用純石油醚洗脫,植物葉中的幾種色素就在管內(nèi)形成不同種顏色的色帶(見圖2)。此時(shí),茨維特對(duì)吸附分離的認(rèn)識(shí)仍然沒有超出前人的認(rèn)識(shí),只是觀察得更為仔細(xì)和系統(tǒng),這可以認(rèn)為是現(xiàn)代色譜的萌芽。1903年在華沙國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議上用俄文發(fā)表的分離葉綠素的研究結(jié)果[8]更詳細(xì)地描述了實(shí)驗(yàn)裝置和分離過程,他采用了109種有機(jī)和無機(jī)吸附劑來分離葉綠素等色素,并討論了吸附材料和淋洗過程對(duì)吸附分離的影響。在這篇論文中,茨維特第一次認(rèn)識(shí)到一種新的色譜類型,即洗脫色譜,并且用光譜方法檢測(cè)了分離后的物質(zhì)。盡管由于人們至今不知道的原因,登載該論文的俄文會(huì)議錄直到1905年出版,且在此論文中沒有出現(xiàn)“色譜”這個(gè)詞匯,但K. I. Sakodynskii堅(jiān)持認(rèn)為,1903年3月8-21日應(yīng)該作為色譜分析方法的誕生日。

1906年茨維特在德文刊物上正式發(fā)表兩篇有關(guān)液-固色譜的學(xué)術(shù)論文[9,10],文中第一次提出了“Chromatographie”,英譯名為Chromatography,即“色譜法”的概念(中文也曾譯作“層析法”或“色層法”)。這個(gè)詞是由希臘語中“顏色”(chroma)和“書寫”(graphein)這兩個(gè)詞根組成的,因此,有人在英語中將色譜稱作“color writing”[11]。茨維特實(shí)驗(yàn)方法中的玻璃管就是“色譜柱”,碳酸鈣就是“固定相”,純凈的石油醚就是“流動(dòng)相”。圖2是茨維特分別于1906年和1908年發(fā)表的色譜分離裝置和色譜圖。由于20世紀(jì)初世界的科學(xué)中心在德國(guó),只有用德文發(fā)表的論文才可能被大部分科學(xué)家所閱讀。因此,當(dāng)時(shí)西方很多頂級(jí)學(xué)者正是通過這兩篇文章了解了色譜,故他們認(rèn)為色譜的出現(xiàn)應(yīng)該是1906年的事情。這也就導(dǎo)致了色譜發(fā)現(xiàn)年份的不同說法,即1901年說、1903年說和1906年說;也因?yàn)槿绱?進(jìn)入21世紀(jì)后人們用了5年多的時(shí)間來紀(jì)念色譜發(fā)現(xiàn)100周年。波蘭化學(xué)會(huì)的分析化學(xué)家于1994年9月在華沙大學(xué)生物學(xué)樓的墻上掛了一塊紀(jì)念牌,上面用波蘭語寫著銘文為(譯作中文) “M. S. Tswett博士于1901-1908年在此建筑內(nèi)發(fā)現(xiàn)了色譜”。

2 色譜分析方法的發(fā)展[12]

茨維特發(fā)現(xiàn)的色譜在科學(xué)上有重大意義,但并沒有立即得到當(dāng)時(shí)化學(xué)界的重視。原因是多方面的:第一,茨維特是植物學(xué)家,他的研究工作主要在植物學(xué)界交流,其他領(lǐng)域的科學(xué)家不容易了解到;第二,他的工作開始以俄文發(fā)表,而當(dāng)時(shí)科學(xué)的中心在德國(guó),德文被認(rèn)為是國(guó)際科學(xué)語言(正如今天科學(xué)的中心在美國(guó),英文是國(guó)際科學(xué)語言),這就使得國(guó)際科學(xué)家沒有及時(shí)了解到色譜這一技術(shù);第三,當(dāng)時(shí)的茨維特不是一位著名的科學(xué)家,所以難以獲得科學(xué)界知名人物的關(guān)注和支持,即使當(dāng)時(shí)的植物學(xué)界也有一些著名的科學(xué)家對(duì)茨維特的色譜方法持否定態(tài)度;第四,當(dāng)時(shí)的科學(xué)技術(shù)及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展對(duì)分析分離(separation,即分子水平的分離)還沒有迫切的需求,一般的制備分離(即isolation,主要是蒸餾和萃取方法)就能滿足要求了。因此,盡管在茨維特之后也有一些科學(xué)家使用了色譜方法進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)的分離,但并沒有引起科學(xué)界的廣泛注意。

直到1931年,著名的奧地利裔德國(guó)化學(xué)家R. Kuhn及其合作者E. Lederer使用了茨維特的液-固色譜法,用碳酸鈣吸附劑填充的玻璃管(內(nèi)徑1 cm,長(zhǎng)度15cm)對(duì)來自蛋黃的30 mg葉黃素樣品經(jīng)過3次分離,得到了3種胡蘿卜素異構(gòu)體,即α-胡蘿卜素(mp 188 ℃)、β-胡蘿卜素(mp 184 ℃)、γ-胡蘿卜素(mp 178 ℃),從而證明蛋黃葉黃素是氧化胡蘿卜素的混合物,同時(shí)也證明了茨維特的方法可以實(shí)現(xiàn)快速有效的分離(有關(guān)Kuhn等人的這部分研究工作,文獻(xiàn)[13]有詳細(xì)而有趣的描述,有興趣者可以參閱)。有必要指出,Kuhn生于維也納,1922年在維也納大學(xué)獲得化學(xué)博士學(xué)位,其導(dǎo)師為1915年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主R. Willst?tter教授(此人當(dāng)年對(duì)茨維特的色譜方法是持否定態(tài)度的,他將茨維特1910年出版的書給了其學(xué)生Kuhn, Kuhn又交給其學(xué)生Lederer,他們從書中學(xué)到了色譜技術(shù))。1925年Kuhn受聘于慕尼黑大學(xué),1938年因?yàn)槠湓诤}卜素和維生素方面的研究而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(頒獎(jiǎng)時(shí)間為1939年,當(dāng)時(shí)德國(guó)政府要求其棄獎(jiǎng),但他還是在二戰(zhàn)之后領(lǐng)了獎(jiǎng))[13]。如此著名的化學(xué)家采用了色譜方法,得到了極其重要的研究結(jié)果,很快就為科學(xué)界所熟知,從而使色譜獲得了“重生”,進(jìn)入了飛快的發(fā)展階段。有人做過統(tǒng)計(jì)[11],迄今為止的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主中有超過12位科學(xué)家的獲獎(jiǎng)工作是與色譜分不開的。

就在Lederer和Kuhn的上述工作之后,Kuhn實(shí)驗(yàn)室的H. Brockman[14]和A. Winterstein[15]也采用色譜方法很快獲得了重要成果。瑞士的P. Karrer等[16]和匈牙利的L. Zechmeiister等[17]著名學(xué)者也發(fā)表了色譜應(yīng)用的論文,這些都對(duì)色譜的發(fā)展起了重要的推動(dòng)作用。1937年Springer出版社就出版了第一本德文色譜專論[18], 1938年出現(xiàn)了新的色譜類型----薄層色譜(TLC)[19]。

以上討論的是液-固吸附色譜的早期發(fā)展,氣-固色譜又如何呢?事實(shí)上,1904年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主W. Ramsay在1905年就利用活性炭的吸附性質(zhì)成功分離了復(fù)雜的氣體混合物[20],這應(yīng)該是氣-固色譜的萌芽。20世紀(jì)40年代初,有3組科學(xué)家同時(shí)研究氣體吸附色譜。首先是G. Hesse在1941-1942年采用裝有淀粉的玻璃管分離了氮?dú)庵械匿搴偷鈁21],后來又用硅膠填充柱和二氧化碳流動(dòng)相分離了一些脂類化合物以及共沸物和順反異構(gòu)體[22];很可惜,他的有關(guān)研究因二戰(zhàn)而中斷了。再就是G. Damkǒhler和H. Theile分離了載氣流中的甲醇-乙醇混合物以及環(huán)己烷和苯的混合物,他們還將甘油涂在吸附劑上以降低吸附活性(這應(yīng)該是最早的氣-液色譜嘗試)[23]。第三組科學(xué)家是E. Cremer及其學(xué)生A. Kunte等人,他們研究了乙炔加氫的動(dòng)力學(xué)并分析了乙炔和乙烯的混合物。Cremer的學(xué)生F. Prior則采用Kuhn在1947年開發(fā)的簡(jiǎn)單色譜裝置,用炭黑作為固定相分離了空氣中的二氧化碳[24]。Cremer的另一個(gè)學(xué)生Microchem則分離了氮?dú)?、乙烯和乙?采用的是熱導(dǎo)檢測(cè)器[25]。Cremer和她的學(xué)生在二戰(zhàn)期間還設(shè)計(jì)制造出第一臺(tái)氣-固色譜儀?；谶@些史實(shí),Sakodynskii教授[26]認(rèn)為,氣-固色譜的發(fā)明人應(yīng)該是G. Hesse和E. Cremer。有趣的是,Cremer的第一篇?dú)?固色譜論文于1944年投送給Naturwissenschaften雜志,經(jīng)修改后該雜志于1945年2月錄用了這一論文。然而,正當(dāng)出版社準(zhǔn)備以特刊付印時(shí),印刷工廠在空襲中被炸毀,所以這篇文章就葬身于廢墟之中,直到31年后的1976年才作為歷史文件而發(fā)表。

瑞典科學(xué)家A. W. K. Tiselius(見圖3)對(duì)色譜的發(fā)展也做出了重要貢獻(xiàn),他和S. Claesson在20世紀(jì)40年代初對(duì)色譜方法進(jìn)行了分類[27,28],這種分類法一直沿用至今。Tiselius最為人知的是其電泳研究成果,他因發(fā)明了分離蛋白質(zhì)的電泳裝置而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)然,電泳一直是色譜的姐妹技術(shù),一般也包含在色譜的范疇。其實(shí),Tiselius實(shí)驗(yàn)室還有一個(gè)重要貢獻(xiàn),即發(fā)明了液相色譜(LC)的梯度洗脫方法。

圖 3 (從左至右)A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)Fig. 3 (From left to right) A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)

分配色譜的發(fā)明要?dú)w功于英國(guó)的化學(xué)家A. J. P. Martin和R. L. M. Synge(見圖3)。Martin生于倫敦,1932年從劍橋大學(xué)畢業(yè)后進(jìn)入物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,此后他發(fā)展了采用氯仿-水的液-液多步萃取系統(tǒng)以分離維生素E。研究中他想到將對(duì)流中的兩種液體之一固定下來,而讓另一種流動(dòng),這就把萃取和色譜聯(lián)系了起來。1936年獲博士學(xué)位后,Martin和Synge一起用對(duì)流分配的方法分離氨基酸。他們把用水飽和的硅膠裝填在30 cm長(zhǎng)的柱管中,用氯仿做流動(dòng)相,將乙酰氨基酸加到柱上,同時(shí)加入甲基橙來監(jiān)控氨基酸在柱管中的移動(dòng)。他們得到的分離效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于當(dāng)時(shí)任何復(fù)雜的裝置,這就是1940年分配色譜的發(fā)明[29]。很有趣的是,多年后Martin回憶當(dāng)年的研究工作時(shí),寫到[13]“這一工作比科學(xué)更神奇,我們當(dāng)時(shí)根本不理解我們做的是什么”。為了從理論上解釋色譜分離過程,他們發(fā)展了色譜的塔板理論。此后,Martin和Condsen又發(fā)展了二維紙色譜[30]。

在Martin的第一篇色譜論文[29]中,作者就預(yù)言氣體也可以作為分配色譜的流動(dòng)相,但當(dāng)時(shí)無人對(duì)此感興趣。直到十年之后Martin和A. T. James一起實(shí)現(xiàn)了自己的預(yù)言。他們采用涂敷了苯基甲基硅油(含10%的硬脂酸)的Celite顆粒裝填在40 cm的柱管中,成功分離了甲胺以及其他有機(jī)酸,從而發(fā)明了氣-液分配色譜[31]。這一成果發(fā)表于1952年,非常巧合的是,Martin和Synge分享了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)然,獲獎(jiǎng)理由是他們?cè)?941年前后對(duì)分配色譜的貢獻(xiàn),而不是1950年氣-液色譜的發(fā)明。

此后,氣相色譜(GC)進(jìn)入了快速發(fā)展期,在高速發(fā)展的石油化工行業(yè)迅速得到了應(yīng)用。1957年英國(guó)人M. J. E. Golay[32]開創(chuàng)了開管柱(open tubular column)GC,習(xí)慣上稱為毛細(xì)管(capillary)GC,這是GC發(fā)展史上具有里程碑意義的技術(shù)創(chuàng)新。1979年彈性石英毛細(xì)管柱的出現(xiàn)使毛細(xì)管柱GC迅速普及,今天市場(chǎng)上85%以上的GC柱是這種柱型。可以說,20世紀(jì)50-70年代色譜領(lǐng)域GC的發(fā)展由于其強(qiáng)大的分離能力而獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷,而LC的發(fā)展則相對(duì)緩慢一些。原因之一是GC、特別是毛細(xì)管柱GC技術(shù)滿足了這個(gè)時(shí)期石油化工發(fā)展對(duì)分析檢測(cè)的需求,也為日益受到重視的環(huán)境保護(hù)檢測(cè)提供了技術(shù)支持;二是當(dāng)時(shí)工業(yè)的發(fā)展對(duì)LC的要求相對(duì)不那么迫切;三是LC的發(fā)展受到技術(shù)上的限制,盡管理論研究表明,細(xì)內(nèi)徑色譜柱和小顆粒填料是提高LC分離效率的關(guān)鍵,但小顆粒填料的制備技術(shù)尚未成熟,同時(shí),填料粒徑減小所導(dǎo)致的高壓也是當(dāng)時(shí)儀器所難以承受的。

在理論方面,1956年荷蘭學(xué)者J. J. Van Deemter等[33]在Martin等人的塔板理論的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論,美國(guó)猶他大學(xué)的J. C. Giddings教授總結(jié)和擴(kuò)展了前人的色譜理論,從1955年開始研究色譜的分子動(dòng)力學(xué)理論[34], 1965年出版了專著《Dynamics of Chromatography》[35],該書至今仍然被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是色譜的經(jīng)典,這為色譜的進(jìn)一步發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。他于1991年出版的著作《Unified Separation Science》[36]更是推動(dòng)了整個(gè)分離科學(xué)的發(fā)展。Giddings對(duì)分離科學(xué)的發(fā)展還有兩項(xiàng)重要的貢獻(xiàn),一是發(fā)明的類似洗脫色譜的場(chǎng)流分級(jí)(field-flow fractionation, FFF)技術(shù)[37],二是從1965年開始作為執(zhí)行編輯出版Elsevier的定期系列綜述《Advances in Chromatograph》直到1993年。1996年他因癌癥而逝世,享年66歲,被學(xué)界認(rèn)為是分離科學(xué)領(lǐng)域的重大損失。

在LC方面,1956年E. Stahl[38]系統(tǒng)地研究了硅膠的規(guī)格、性能、薄層厚度等對(duì)分離效果的影響,并研制出薄層色譜板涂布器,從而使TLC得到了廣泛應(yīng)用。柱色譜從茨維特的經(jīng)典LC到現(xiàn)代高效液相色譜(HPLC)則是20世紀(jì)60年代后半期的事情。GC難以直接分離高沸點(diǎn)強(qiáng)極性的化合物,雖然有些被分析物可以經(jīng)過衍生化處理或裂解后用GC分析,但增加了方法的復(fù)雜性,而經(jīng)典LC采用玻璃管裝填直徑為100 μm左右的填料,流動(dòng)相主要依靠重力驅(qū)動(dòng)通過色譜柱,一般需要幾個(gè)小時(shí)甚至幾天完成一次分離,時(shí)間長(zhǎng),分析效率低。從塔板理論到速率理論都證明,由于氣相分子擴(kuò)散系數(shù)比液相大4～5個(gè)數(shù)量級(jí),故要實(shí)現(xiàn)LC的高效分離,就需要小粒度填料和細(xì)內(nèi)徑色譜柱。另一方面,傳統(tǒng)的氣-固吸附色譜難以分離強(qiáng)極性混合物,而制藥工業(yè)的發(fā)展以及生命科學(xué)的發(fā)展卻非常需要能夠分離水溶液中極性化合物甚至生物大分子的方法。為此,20世紀(jì)60年代有一批科學(xué)家專注于研究提高LC分離效率和拓展應(yīng)用范圍的問題,從而發(fā)展了粒度在40 μm以下的填料,并采用高壓輸液泵迫使流動(dòng)相通過色譜柱,這就是HPLC,或者稱為現(xiàn)代LC[39]。

對(duì)HPLC發(fā)展有重要貢獻(xiàn)的首先是耶魯大學(xué)的Cs. Horváth教授團(tuán)隊(duì)。Horváth(1930-2004)出生在匈牙利,畢業(yè)于布達(dá)佩斯工學(xué)院(Budapest Institute of Technology)的化工專業(yè)。1956年匈牙利政治動(dòng)亂中他到了西德,開始在一家公司工作。此后于1961年進(jìn)入J. W. Goethe University攻讀博士學(xué)位。1963年進(jìn)入哈佛醫(yī)學(xué)院(Harvard Medical School)做博士后,開始GC方面的研究,開發(fā)了載體涂漬開管柱(SCOT)。而后他受聘于耶魯大學(xué),于60年代中期開發(fā)了粒徑為30～40 μm的色譜填料,并設(shè)計(jì)制造了世界上首臺(tái)HPLC儀器[40]。他也是最早使用反相HPLC的科學(xué)家,深入研究了反相HPLC的保留機(jī)理。還使用頂替色譜進(jìn)行制備分離,后來在毛細(xì)管電泳(CE)和毛細(xì)管電色譜(CEC)方面也有建樹,對(duì)生命分析化學(xué)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。

杜邦公司的研究團(tuán)隊(duì)在小顆粒填料方面做了開創(chuàng)性的工作,如P. Hamilton[41]在1960年就用小粒徑的離子交換樹脂很好地分離了氨基酸,J. Kirkland等人在60年代中期開發(fā)了粒徑為30～40 μm的硅膠填料Zipax[42],并且涂覆了β,β′-氧二丙腈作為液-液色譜固定相。這種固定相穩(wěn)定性差,固定液流失嚴(yán)重,柱壽命也就一兩天,且不能進(jìn)行梯度洗脫。這迫使他們轉(zhuǎn)向高分子材料,先后開發(fā)了Zipax SCX、Zipax SAX和Zipax HCP 3種很受市場(chǎng)歡迎的填料。Zipax SCX很適合藥物分析,但當(dāng)時(shí)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)還不認(rèn)可HPLC方法。Zipax SAX后來成為第一個(gè)被FDA認(rèn)可的填料,Zipax HCP則適合于分離所有疏水性化合物。在此期間,Kirkland基于硅化學(xué)方法開發(fā)了鍵合相[43],獲得了專利授權(quán)的Zipax Permaphase鍵合固定相,其中Permaphase ODS (C18)成為HPLC的經(jīng)典填料,流行至今。從20世紀(jì)60年代后期到70年代早期,其他實(shí)驗(yàn)室也開發(fā)了類似的填料,如Waters公司的Corasil I和Corasil II、Merck公司的Perisorb等,都對(duì)HPLC的發(fā)展起了重要作用。然而,此時(shí)的填料比表面很低(1～10 m2/g),導(dǎo)致對(duì)很多物質(zhì)的保留作用太弱而不能分離。后來Kirkland團(tuán)隊(duì)又開發(fā)了著名的Zorbax全多孔硅膠填料,最早的粒徑為7 μm,孔徑6 nm(60 ?),比表面積達(dá)到300 m2/g,色譜性能大為提高。因此可以說,HPLC的發(fā)展史很大程度上就是填料技術(shù)的進(jìn)化史,表1列出了不同年代的填料粒徑變化情況。

表 1 HPLC填料粒徑的發(fā)展變化Table 1 Development of particle size for HPLC

由表1可見,填料粒徑的減小直接導(dǎo)致柱壓力的升高,這對(duì)儀器的耐壓性能提出了更高要求。1960年中期Kirkland團(tuán)隊(duì)采用裝配氣動(dòng)放大泵的820型儀器,通過硅橡膠隔墊密封的注射器進(jìn)樣。由于壓力高,幾次進(jìn)樣后就會(huì)漏液,一般幾個(gè)小時(shí)就要更換密封墊。后來,他們開發(fā)了數(shù)字混合梯度裝置和帶樣品環(huán)的進(jìn)樣閥,使得HPLC儀器性能大為提高。Waters公司在商品化的HPLC儀器方面起了非常重要的作用。此外,對(duì)HPLC發(fā)展有重要貢獻(xiàn)還有L. R. Snyder、I. Halász和B. Karger等人,這里不再一一介紹?？傊?HPLC的出現(xiàn)是一批科學(xué)家在60年代后期到70年代初期共同研究的結(jié)果。

20世紀(jì)70年代后期色譜的發(fā)展進(jìn)入了GC和HPLC并駕齊驅(qū)的時(shí)代,GC越來越趨于成熟,色譜-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)、特別是基于毛細(xì)管柱的GC-MS技術(shù)得到了普遍應(yīng)用;HPLC的發(fā)展也加快了速度。因?yàn)樵谧匀唤缫阎幕衔镏屑s15%可以用GC直接分析,而其余85%基本都可以用LC分析,所以,HPLC的發(fā)展越來越受到重視,特別是生命科學(xué)和生物制藥的快速發(fā)展,更使HPLC成為不可或缺的分離分析方法。到20世紀(jì)90年代后期,J. W. Jorgenson等[44-46]致力于開發(fā)粒徑小于2 μm的HPLC填料,他們稱之為超高壓LC,即UPLC。近幾年他們又在研發(fā)1.1 μm的UPLC填料[47,48]。需要指出,2004年Waters公司推出了基于亞2 μm填料色譜柱的超高效LC儀器,并將UPLC注冊(cè)為專利產(chǎn)品名稱。隨后其他公司也相繼推出商品化的超高效LC儀器,名稱有超高效液相色譜(UHPLC)或超高流速液相色譜(UFLC)等。也有人對(duì)HPLC、UPLC和UHPLC作了重新定義[49],我們將在其他文章中詳細(xì)討論。

隨著HPLC的飛速發(fā)展,LC-MS技術(shù)也取得了突破。獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的電噴霧技術(shù)逐步成為L(zhǎng)C-MS/MS的標(biāo)配接口。同時(shí),又出現(xiàn)了一些新的分離分析技術(shù)。主要是20世紀(jì)80年代初由Jorgenson等[50,51]在Hjertén等[52,53]的工作基礎(chǔ)上發(fā)展起來的毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE),由S. Terabe等[54]發(fā)展的膠束電動(dòng)色譜(MEKC),以及90年代出現(xiàn)的集HPLC和CZE優(yōu)點(diǎn)的毛細(xì)管電色譜(CEC)[55],構(gòu)成了較為完整的CE分離模式。到90年代后期,基于整體材料的HPLC和CEC受到廣泛重視[56],隨后又出現(xiàn)了芯片技術(shù)的快速發(fā)展,開始叫作微全分析系統(tǒng)(μTAS)[57]或者芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)[58],后來統(tǒng)稱為微流控學(xué)(microfludics)[59],現(xiàn)在發(fā)展成為微納流控(micro/nano-fludics)技術(shù)[60]。另一方面,超臨界流體色譜(SFC)經(jīng)歷了20世紀(jì)90年代的較快發(fā)展和隨后十來年的相對(duì)停滯,近幾年又有了新的進(jìn)展,從樣品制備中的超臨界流體萃取,到生物分析、食品分析和藥物分析的SFC,以及制備SFC都展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[61]。

在應(yīng)用領(lǐng)域,2000年6月人類基因組計(jì)劃的提前完成[62]在很大程度上得益于分析化學(xué)家發(fā)展的陣列毛細(xì)管電泳(ACE)技術(shù)[63]。從此,人類進(jìn)入了功能基因組(后基因組)時(shí)代,科學(xué)家的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對(duì)生物功能的研究?；蚪MDNA的測(cè)序結(jié)果還不能回答某基因的表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等問題,而這些問題可望在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等生命組學(xué)研究中找到答案。這也是目前色譜和電泳及其與MS的聯(lián)用技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)和新能源研究都是色譜相關(guān)技術(shù)可以發(fā)揮更大作用的領(lǐng)域。

3 色譜分析方法的現(xiàn)狀和未來

色譜法在100多年的發(fā)展過程中,各種方法的發(fā)展是不平衡的。LC出現(xiàn)雖然早,但GC是最早廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)。之所以如此是因?yàn)镚C的分析靈敏度高,分離效率高,分析速度快,分析精度高,很好地滿足了當(dāng)時(shí)科學(xué)研究和社會(huì)發(fā)展的需求。后來HPLC突飛猛進(jìn),是基于小粒度填料和高壓輸液泵的技術(shù)突破,同時(shí)也是制藥工業(yè)和生命科學(xué)的發(fā)展使然。目前,GC和HPLC是世界上應(yīng)用最廣的分析技術(shù),在食品安全、石油化工、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用。將來的發(fā)展趨勢(shì)是儀器的自動(dòng)化、網(wǎng)絡(luò)化,特別是計(jì)算機(jī)技術(shù)和人工智能的應(yīng)用,以及專門的進(jìn)樣裝置及樣品預(yù)處理裝置與色譜儀器的一體化,比如頂空進(jìn)樣、吹掃捕集進(jìn)樣、固相微萃取(SPME)、超臨界流體萃取(SFE)和加壓溶劑萃取(PSE)等技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了與不同色譜儀器的在線聯(lián)用。GC-MS迅速普及,全二維GC、多維LC以及二維CE的發(fā)展也引人注目,它們將對(duì)復(fù)雜混合物的分析發(fā)揮重要作用。HPLC近年在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展很快,其中較為活躍的是離子色譜(IC)、疏水相互作用色譜(HIC)、手性分離及反相色譜與其他模式結(jié)合的多維色譜。HPLC應(yīng)用面廣,可以進(jìn)行制備分離,在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域中有很好的應(yīng)用前景。HPLC的儀器市場(chǎng)將持續(xù)增長(zhǎng),主要表現(xiàn)在LC-MS系統(tǒng)以及LC-NMR系統(tǒng)的進(jìn)一步成熟和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,以及開發(fā)更為簡(jiǎn)單高效的儀器系統(tǒng),包括各種新的MS技術(shù)。據(jù)中國(guó)行業(yè)研究報(bào)告網(wǎng)最新研究報(bào)告顯示,到2022年全球色譜儀器市場(chǎng)總規(guī)模將達(dá)109.9億美元[64]。

著名色譜學(xué)者G. Guiochon在1998年發(fā)表文章[65]認(rèn)為,GC和HPLC是分離分析領(lǐng)域極為成功的范例,而SFC和FFF發(fā)展緩慢,CE則處于前途未卜的狀態(tài)。關(guān)于SFC, Giddings和Myers早在20世紀(jì)60年代就發(fā)表了先驅(qū)性的研究工作,80年代初期毛細(xì)管柱SFC是一個(gè)研究熱點(diǎn),而且當(dāng)時(shí)認(rèn)為SFC將掀起分析方法的革命,但是后來各大儀器公司紛紛停止了SFC的生產(chǎn),放棄了進(jìn)一步開發(fā)SFC的計(jì)劃。毫無疑問,SFC具有一些獨(dú)特用途,兼具GC和LC的一些優(yōu)點(diǎn),但是它也只能在GC和HPLC的夾縫中生存,而GC和HPLC已成為廣泛應(yīng)用的技術(shù),這就造成了SFC市場(chǎng)有限的局面。值得注意的是,近年來SFC又有東山再起之勢(shì)[66],特別是在手性藥物分離、生命分析化學(xué)和組學(xué)分析領(lǐng)域,SFC的多樣品適用性、快速分離和流動(dòng)相綠色環(huán)保的特點(diǎn)逐漸被人們所重視。采用壓縮CO2流動(dòng)相、亞2 μm填料的填充柱SFC的文獻(xiàn)越來越多[67]。SFC與UHPLC分離可以在一臺(tái)儀器上實(shí)現(xiàn),這被沃特世公司稱為超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography, UPC2)[68]; SFC與HPLC構(gòu)成的二維分離系統(tǒng)展示出優(yōu)于一般二維HPLC的分析速度和分離效率,有望應(yīng)用于更多的研究領(lǐng)域[69]。為此,幾個(gè)大的儀器廠商,如安捷倫、沃特世、賽默飛世爾和島津等公司又都推出了各自的SFC儀器,預(yù)示著這一技術(shù)可能有很好的市場(chǎng)前景。

20世紀(jì)80年代興起的CE因具有驚人的高柱效和相對(duì)簡(jiǎn)單的儀器設(shè)備而吸引了許多分析化學(xué)家參與研究,特別是MEKC和CEC的出現(xiàn),使許多色譜學(xué)者覺得CE似乎要解決絕大部分分離問題。然而,進(jìn)入21世紀(jì)以來,許多工業(yè)分析化學(xué)家逐漸對(duì)CE失望了,原因是CE的分析重現(xiàn)性和檢測(cè)靈敏度達(dá)不到HPLC的水平,這大大阻礙了其實(shí)際應(yīng)用。同時(shí),很多CE研究人員轉(zhuǎn)移到了由微通道電泳發(fā)展而來的微納流控研究領(lǐng)域,致使CE的發(fā)展相對(duì)停滯了,有些儀器廠商已經(jīng)停止了CE儀器的生產(chǎn)。目前,CE的主要應(yīng)用領(lǐng)域是基因測(cè)序(陣列CE)、手性藥物分離、物化參數(shù)(如解離常數(shù))的測(cè)定以及相互作用研究等領(lǐng)域。最近采用CE分離表征納米材料,研究納米顆粒的性質(zhì)及其與其他分子的相互作用取得了很好的效果[70]。而各種納米材料如金屬有機(jī)骨架(MOFs)、磁性和非磁性納米顆粒、碳納米管和石墨烯在CE中的應(yīng)用也取得了很好的進(jìn)展[71],這可能是一個(gè)很有前途的CE發(fā)展方向。在常規(guī)分析領(lǐng)域,雖然CE的分析重現(xiàn)性已經(jīng)在很大程度上得到了解決,在生物大分子分析中也顯示了其優(yōu)越性,但由于毛細(xì)管內(nèi)徑只有25～75 μm,光學(xué)檢測(cè)器的靈敏度仍然是一個(gè)瓶頸問題?；诩{米孔的新一代基因檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)有望取代陣列CE,而微納流控的發(fā)展又會(huì)進(jìn)一步縮小CE的發(fā)展空間。因此,除非CE在進(jìn)一步提高分析重現(xiàn)性的同時(shí)發(fā)展出更高靈敏度的通用檢測(cè)技術(shù),解決一些其他方法解決不了的問題,否則,其發(fā)展前景并不令人樂觀。

FFF也經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展,但應(yīng)用仍然有限。FFF是根據(jù)顆粒物質(zhì)在各種場(chǎng)中的擴(kuò)散速度不同而實(shí)現(xiàn)分離的,故主要用于顆粒物如合成與天然高分子的分析,也可以分離細(xì)菌、病毒、微生物和脂質(zhì)體等生物顆粒。目前,FFF的主要應(yīng)用領(lǐng)域還是聚合物分析[72],采用熱FFF可以表征共聚物的自組裝[73]。近年來納米科技的發(fā)展為FFF提供了一個(gè)新的機(jī)遇[74],不對(duì)稱流FFF的應(yīng)用越來越多[75],在納米藥物分析方面展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[76],比如,不對(duì)稱流FFF與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用可以分析金屬納米顆粒。這是一個(gè)FFF可以展示其優(yōu)越性的領(lǐng)域,可能推動(dòng)FFF的進(jìn)一步發(fā)展?？傊?基礎(chǔ)研究產(chǎn)生的新方法能否得到廣泛的應(yīng)用,從而推動(dòng)技術(shù)進(jìn)步和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,主要取決于這種方法是否能解決其他方法所不能解決的實(shí)際問題,是否具有已有方法所不具備的優(yōu)點(diǎn),以及是否有適當(dāng)?shù)氖袌?chǎng)需求。

4 色譜發(fā)展史給我們的啟示

總結(jié)色譜100多年的發(fā)展史,給我們的啟示主要是:第一,基礎(chǔ)研究始終是科學(xué)技術(shù)進(jìn)步的源泉。沒有茨維特當(dāng)初對(duì)色譜分離這一物理現(xiàn)象的仔細(xì)觀察,沒有Martin等人對(duì)分配色譜理論的系統(tǒng)研究,沒有Giddings對(duì)色譜理論的深入闡述,很難想象色譜的發(fā)展能有這么快。第二,社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需求是各種分析技術(shù)創(chuàng)新的驅(qū)動(dòng)力。無論是色譜的出現(xiàn),還是當(dāng)初Kuhn等人分離胡蘿卜素的工作,都是科學(xué)研究對(duì)分離技術(shù)的需要才導(dǎo)致了色譜的發(fā)展;至于20世紀(jì)50年代GC突飛猛進(jìn)的發(fā)展,則是石油化工對(duì)分析技術(shù)的迫切需求所致。而20世紀(jì)90年代以來生命科學(xué)和醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境科學(xué)的發(fā)展更是為新的色譜技術(shù)提供了強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)力。第三,學(xué)科交叉是分析技術(shù)創(chuàng)新的重要途徑。茨維特是植物學(xué)家,Martin是物理化學(xué)家,但他們對(duì)科學(xué)的貢獻(xiàn)最終主要體現(xiàn)在分析化學(xué)領(lǐng)域,這是典型的學(xué)科交叉。今天,很多物理學(xué)家、納米化學(xué)家、有機(jī)和無機(jī)化學(xué)家與分析化學(xué)家合作發(fā)展了很多用于色譜分析的新理論新材料新方法。在生命化學(xué)領(lǐng)域,化學(xué)與生物學(xué)的交叉、與臨床醫(yī)學(xué)的交叉更是催生了各種生命分析化學(xué)方法的出現(xiàn),包括用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等前沿領(lǐng)域的色譜新方法。至于色譜儀器的創(chuàng)新則更是多學(xué)科研究人員共同參與的結(jié)果。第四,不懈堅(jiān)持和勇于探索是技術(shù)創(chuàng)新的必要條件。對(duì)于科學(xué)工作者來說,這應(yīng)該是不言而喻的。歷史上重要的科學(xué)突破無不是科學(xué)家長(zhǎng)期堅(jiān)持的結(jié)果,色譜亦然。任何急功近利的浮躁做法都是和科學(xué)精神背道而馳的,因此科學(xué)研究的評(píng)價(jià)機(jī)制也必須符合科學(xué)發(fā)展的規(guī)律。

盡管色譜經(jīng)歷了100多年的發(fā)展,盡管已經(jīng)有各種很成熟的色譜方法,但我們相信,色譜技術(shù)在未來還會(huì)有重要的發(fā)展,這可能主要體現(xiàn)在:(1)分離材料的創(chuàng)新將使分析速度更快,分離效率更高;(2)新的檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)將使分析靈敏度更高,從而使單分子分析真正成為可能;(3)色譜儀器與其他儀器(包括樣品處理、檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理技術(shù))的聯(lián)用將使色譜分析的自動(dòng)化程度更高,應(yīng)用也將更為廣泛。(4)在應(yīng)用方面,生命組學(xué)研究無疑是色譜發(fā)揮更大作用的領(lǐng)域;新藥的研發(fā)、重大疾病的診斷與治療、環(huán)境污染分析和治理都離不開色譜分離分析?？傊?隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,各種色譜技術(shù)也將持續(xù)發(fā)展,這必將為社會(huì)為人類做出更大的貢獻(xiàn)。

致謝: 本文是在為色譜技術(shù)叢書第三版的《色譜分析概論》撰寫的第一章部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上擴(kuò)充而成的。叢書第三版的出版得到了化工出版社和安捷倫科技公司的大力支持,特此致謝!